一种人脂肪干细胞用的细胞冻存液的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及组织细胞培养技术领域，具体设及一种人脂肪干细胞冻存液及其制备 方法和应用。
【背景技术】
[0002] 脂肪干细胞(Adipose-derived stem cells,ADSCs)是近年来从脂肪组织中分离 得到的一种具有多向分化潜能的干细胞，具有可迅速扩增、不易衰老等一般干细胞的特点。 人脂肪干细胞即人体脂肪间充质干细胞是目前广泛应用于组织工程及再生医学领域的一 种成体干细胞与骨髓间充质干细胞一样具有多向分化潜能。ADSCs呈成纤维细胞样生长，胞 浆和核仁丰富，呈平行或縱满样排列。细胞周期分析显示G0/G1期的细胞占69%，S期占 24%，G2/M期占8%。在胎牛血清的存在条件下传代培养2-3天细胞增殖I倍。多次传代（10-20代)后，细胞增殖速度无明显减慢，在传代6次后细胞群体中出现衰老细胞，第15代细胞群 体中衰老细胞约占15%。
[0003] 由于人脂肪间充质干细胞分离培养周期较长，原代细胞铺满的时间约2周W上，达 到一定的数量需要3周左右。人脂肪间充质干细胞体外长期培养传代容易发生自发分化，失 去其多向分化的潜能。所W为保证实验的连续性，必须随时提供大量的实验或组织工程用 的种子细胞。因此，对于细胞的需求非常强烈。现在，将生产好的细胞进行冷冻保存，使用时 再几种解冻使用也是常规的使用模式。然而现有技术中干细胞冻存使用的冻存液有含血清 和无血清的两类，由于血清具有成分复杂、质量不稳定、价格昂贵等缺点，无血清冻存和复 苏技术成为发展趋势。低溫保存干细胞主要依靠抗冻液二甲基亚讽(DMSO)和血清的保护。 常用到的细胞保护剂还有径乙基淀粉0ES)、聚乙二醇(PEG)等。但是，DMSO会对细胞产生毒 性作用，对冻存的干细胞造成不可逆的损伤。为获得来源方便的神经干细胞，开展有效的神 经干细胞冻存方法是本领域迫切的需求，建立一种长期低溫保存人脂肪干细胞的方法对于 促进人脂肪干细胞的研巧和应用具有重大意义。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是提供一种人脂肪干细胞冷冻保存液W及相应的制备 方法及使用方法。
[000引红果黄肉楠是一种小乔木，申请人经过研究发现，该植物中具有能够耐寒冷的物 质存在，因此，申请人通过高通量筛选获得了相应的具有耐寒的多肤，因此，申请人尝试将 其加入到冷冻保存液中，用于保存细胞。
[0006] 本发明的技术方案如下：
[0007] -种人脂肪干细胞冷冻保存液，其特征在于由如下各组分组成：其特征是冷冻存 液中含有:0.5%w/v低密度脂蛋白，1 %w/v的海藻糖，1 %甘油，1 %w/v卵憐脂，多肤0.1 %w/ v，bFGF l%w/v，维生素 E l%w/v，还原性谷脫甘肤0.5%w/v最后用DMEM培养基定容至 100ml，所述多肤的序列如SEQ ID NO: 1-32任一所示。所述多肤有申请人通过前期的大量的 基因库筛选得到，所述多肤具有保护细胞免受损伤的功能。其名称分别为KATS-UKATS-2、 KATS-3、KATS-4、KATS-5、KATS-6、KATS-7、KATS-8、KATS-9、KATS-10、KATS-11、KATS-12、 KATS-13、KATS-14、KATS-15、KATS-16、KATS-17、KATS-18、KATS-19、KATS-20、KATS-21、KATS-22、KATS-23、KATS-24、KATS-25、KATS-26、KATS-27、KATS-28、KATS-29、KATS-30、KATS-31、 KATS-32,其依次对应于沈Q ID N0:l-32。
[0008] 在本发明的细胞的冻存液中，海藻糖W及维生素 E和多肤具有明确的抵御外来伤 害对细胞的损伤，特别是多肤，还具有保护细胞免受冻存时冰结晶对细胞的损伤。
[0009] 本发明还提供了一种人脂肪干细胞的冻存液的制备方法，即将所述各组分混合摇 匀即成。
[0010] 本发明还提供了一种人脂肪干细胞冻存方法，包括W下步骤：
[0011] A.冻存液制备：制备所述的细胞冻存液，将各组分按照常规的操作方法将各组分 按照相应的比例混合即可获得；
[0012] B.细胞悬液制备:培养生长成单层的人脂肪细胞一瓶，0.20 %膜蛋白酶液消化4分 钟，弃膜酶液，加入DMEM培养液15ml，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，离屯、4000转/分，弃上清， 加入步骤A冻存液2ml，混均，置入无菌的冻存管内；
[0013] C.冷冻:先将冻存管在4°C下冻存30min，然后放入-30°c冻存化，再放入-80°c冻存 3h，最后移入液氮中保存；
[0014] D.细胞复苏:取出冻存管快速置于37°C水浴，震荡直至细胞悬液完全融化，然后用 5倍DMEM液稀释，100化/min离屯、5min,离屯、去除上清液，再重复3次。所述细胞悬浮浓度为 IO8 细胞 Aa-IO^ 细胞/ml。
[001引本发明的有益效果：
[0016] 本发明的人脂肪干细胞冻存液，复苏细胞存活率可达97% W上，较使用常规细胞 冻存液的复苏存活率有了显著提高，基本上没有细胞的损耗。
[0017] 本发明的干细胞冻存液可W长期保存干细胞，细胞活性不发生变化，保证了细胞 生物学活性。
[0018] 本发明神经细胞冻存方法，操作简单可行，价格适宜，具有较好的实用价值。
【具体实施方式】
[0019] 实施例1多肤的制备
[0020] 取红果黄肉楠叶片5g，清洗干净，绞碎，棒汁，加入木瓜蛋白酶和膜蛋白酶，加酶量 8000 lU/g叶片，酶解溫度47°C，pH值7.5，酶解时间1.化，酶解完成后90°C灭酶IOmin;灭酶后 的物料过滤除去不溶物，得到溶液，所得多肤溶液加入4%活性炭吸附脱色，用葡聚糖G-50 (Sephadex G-50)进行多肤分离，20mmol/L肥1溶液洗脱，流速1.3mL/分钟，分别收集不同 时间段的洗脱产物，调节溶液至pH7.0，10000转/分钟离屯、15分钟，经大孔树脂DA201-C脱盐 处理后，真空浓缩，上清液冷冻干燥备用；经十二烷基硫酸钢-聚丙締酷胺凝胶电泳（SDS-PAGE)，回收小分子量的条带，其中经过功能验证，共得到32个小肤的序列具有稳定人脂肪 干细胞，促进干细胞生长，保持干细胞正常生长状态的功效。根据色谱柱中不同的峰值分离 时间，可W批量获得相应的小肤，也可人工合成所述的多肤。所述多肤的序列如SEQ ID NO: 1-32所示。分别命名为KATS-I~32。
[0021] 实施例2人脂肪干细胞冻存液的制备
[0022] 将0.5 %w/v低密度脂蛋白，1 %w/v的海藻糖，1 %甘油，1 %w/v卵憐脂，多肤0.1 % w/v，bFGF l%w/v，维生素 E l%w/v，还原性谷脫甘肤0.5%w/v最后用DMM培养基定容至 100ml，其中所述多肤的序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0023] 实施例3人脂肪干细胞冻存液的制备
[0024] 将0.5 %w/v低密度脂蛋白，1 %w/v的海藻糖，1 %甘油，1 % w/v卵憐脂，多肤0.1 % w/v，bFGF l%w/v，维生素 E l%w/v，还原性谷脫甘肤0.5%w/v最后用DMM培养基定容至 100ml，其中所述多肤的序列如SEQ ID N0:2所示。
[0025] 实施例4人脂肪干细胞冻存液的制备
[0026] 将0.5 %w/v低密度脂蛋白，1 %w/v的海藻糖，1 %甘油，1 % w/v卵憐脂，多肤0.1 % w/v，bFGF l%w/v，维生素 E l%w/v，还原性谷脫甘肤0.5%w/v最后用DMM培养基定容至 100ml，其中所述多肤的序列如SEQ ID N0:3所示。
[0027] 实施例5人脂肪干细胞冻存液的制备
[0028] 将0.5 %w/v低密度脂蛋白，1 %w/v的海藻糖，1 %甘油，1 % w/v卵憐脂，多肤0.1 % w/v，bFGF l%w/v，维生素 E l%w/v，还原性谷脫甘肤0.5%w/v最后用DMM培养基定容至 100ml，其中所述多肤的序列如SEQ ID N0:4所示。
[0029] 实施例6人脂肪干细胞冻存液的制备
[0030] 将0.5 %w/v低密度脂蛋白，1 %w/v的海藻糖，1 %甘油，1 % w/v卵憐脂，多肤0.1 % w/v，bFGF l%w/v，维生素 E l%w/v，还原性谷脫甘肤0.5%w/v最后用DMM培养基定容至 100ml，其中所述多肤的序列如SEQ ID N0:5所示。
[0031] 实施例7人脂肪干细胞冻存液的制备
[0032] 将0.5 %w/v低密度脂蛋白，1 %w/v的海藻糖，1 %甘油，1 % w/v卵憐脂，多肤0.1 % w/v，bFGF l%w/v，维生素 E l%w/v，还原性谷脫甘肤0.5%w/v最后用DMM培养基定容至 100ml，其中所述多肤的序列如SEQ ID N0:6所示。
[0033] 实施例8人脂肪干细胞冻存液的制备
[0034] 将0.5 %w/v低密度脂蛋白，1 %w/v的海藻糖，1 %甘油，1 % w/v卵憐脂，多肤0.1 % w/v，bFGF l%w/v，维生素 E l%w/v，还原性谷脫甘肤0.5%w/v最后用DMM培养基定容至 100ml，其中所述多肤的序列如SEQ ID N0:7所示。
[0035] 实施例9人脂肪干细胞冻存液的制备
[0036] 将0.5 %w/v低密度脂蛋白，1 %w/v的海藻糖，1 %甘油，1 % w/v卵憐脂，多肤0.1 % w/v，bFGF l%w/v，维生素 E l%w/v，还原性谷脫甘肤0.5%w/v最后用DMM培养基定容至 100ml，其中所述多肤的序列如SEQ ID N0:8所示。
[0037] 实施例10人脂肪干细胞冻存液的制备
[003引将0.5 %w/v低密度脂蛋白，1 %w/v的海藻糖，1 %甘油，1 % w/v卵憐脂，多肤0.1 % w/v，bFGF l%w/v，维生素 E l%w/v，还原性谷脫甘肤0.5%w/v最后用DMM培养基定容至 100ml，其中所述多肤的序列如SEQ ID N0:9所示。
[0039] 实施例11人脂肪干细胞冻存液的制备
[0040] 将0.5 %w/v低密度脂蛋白，1 %w/v的海藻糖，1 %甘油，1 % w/v卵憐脂，多肤0.1 % w/v，bFGF l%w/v，维生素 E l%w/v，还原性谷脫甘肤0.5%w/v最后用DMM培养基定容至 100ml，其中所述多肤的序列如SEQ ID NO: 10所示。
[0041] 实施例12人脂肪干细胞冻存液的制备
[0042] 将0.5 %w/v低密度脂蛋白，1 %w/v的海藻糖，1 %甘油，1 %w/v卵憐脂，多肤0.1 % w/v，bFGF l%w/v，维生素 E l%w/v，还原性谷脫甘肤0.5%w/v最后用DMM培养基定容至 100ml，其中所述多肤的序列如SEQ ID NO: 11所示。
[0043] 实施例13人脂肪干细胞冻存液的制备
[0044] 将0.5 %w/v低密度脂蛋白，1 %w/v的海藻糖，1 %甘油，1 % w/v卵憐脂，多肤0.1 % w/v，bFGF l%w/v，维生素 E l%w/v，还原性谷脫甘肤0.5%w/v最后用DMM培养基定容至 100ml，其中所述多肤的序列如SEQ ID NO: 12所示。
[004引实施例14人脂肪干细胞冻存液的制备
[0046] 将0.5 %w/v低密度脂蛋白，1 %w/v的海藻糖，1 %甘油，1 % w/v卵憐脂，多肤0.1 % w/v，bFGF l%w/v，维生素 E l%w/v，还原性谷脫甘肤0.5%w/v最后用DMM培养基定容至 100ml，其中所述多肤的序列如SEQ ID NO: 13所示。
[0047] 实施例15人脂肪干细胞冻存液的制备
[004引将0.5 %w/v低密度脂蛋白，1 %w/v的海藻糖，1 %甘油，1 % w/v卵憐脂，多肤0.1 % w/v，bFGF l%w/v，维生素 E l%w/v，还原性谷脫甘肤0.5%w/v最后用DMM培养基定容至 100ml，其中所述多肤的序列如SEQ ID NO: 14所示。
[0049] 实施例16人脂肪干细胞冻存液的制备
[0050] 将0.5 %w/v低密度脂蛋白，1 %w/v的海藻糖，1 %甘油，1 % w/v