一种用于成体干细胞长期保存的冻存液及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于细胞工程领域，涉及干细胞的保存，具体涉及一种用于成体干细胞长 期保存的冻存液及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 干细胞是一类能形成和维持多种功能、构筑组织器官或生物个体的原始细胞。在 个体生长发育过程中，有两类干细胞:胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞是早期胚胎发 育过程中，可形成生命个体并能传代的细胞。从受精卵分裂后形成的子代细胞，直到胚泡内 的内细胞群，均具有胚胎干细胞的特性，能分离形成胚胎干细胞。成体干细胞位于分化成熟 的组织器官之中，它们能够分化形成相应组织的功能细胞，构筑相应的器官。
[0003] 干细胞的冻存是建立干细胞库的重要环节之一，同时也是研究者在实验中解决干 细胞随着代数的增加增殖能力逐渐减弱而导致实验条件不均一问题的有效方法。目前，低 温保存干细胞主要依靠抗冻液二甲基亚砜和血清的保护。而二甲基亚砜对细胞有损伤，且 复苏过程中容易导致干细胞氧化损伤与分化潜能降低。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种用于成体干细胞长期保存的冻存液及其制备方法，冻 存液使用一种结构新颖的天然产物为添加剂，以Knock-out血清替代常规胎牛血清，提高成 体干细胞复苏后的抗凋亡、抗氧化能力，且去除外源动物源血清对细胞的影响。
[0005] 本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
[0006] -种用于成体干细胞长期保存的冻存液，含有DMEM培养基、二甲基亚砜、Knockout 血清和如下结构所示的化合物 （I); 每 100ml 冻存液中 ，所述二甲基亚砜占冻存液的体积 百分含量为8%~10%，所述Knock-out血清占冻存液的体积百分含量为20 %~40%，余量 为DMEM培养基;所述化合物(I)在冻存液中的浓度为10~20ng/ml;
[0007]
[0008] 进一步地，所述的用于成体干细胞长期保存的冻存液含有DMEM培养基、二甲基亚 砜、Knock-out血清和化合物（I);每100ml冻存液中，所述二甲基亚砜占冻存液的体积百分 含量为9%，所述Knock-out血清占冻存液的体积百分含量为30%，余量为DMEM培养基;所 述化合物(I)在冻存液中的浓度为15ng/ml。
[0009] 上述冻存液的制备方法:取配方量的DMEM培养基、二甲基亚砜、Knock-out血清和 化合物（I);先将化合物（I)溶解在二甲基亚砜中，再将DMEM培养基、Knock-out血清和溶解 有化合物（I)的二甲基亚砜混合均匀。
[0010]本发明的优点：
[0011]本发明提供的冻存液使用一种结构新颖的天然产物为添加剂，以Knock-out血清 替代常规胎牛血清，提高了成体干细胞复苏后的抗凋亡、抗氧化能力，且去除外源动物源血 清对细胞的影响，冻存效果好。
【具体实施方式】
[0012]下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范 围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对 本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
[0013]实施例1:冻存液的制备
[0014] 配方:含有DMEM培养基、二甲基亚砜、Knock-out血清(Gibco, 10828028,下同）和化 合物（I);每l〇〇ml冻存液中，所述二甲基亚砜占冻存液的体积百分含量为9%，所述Knockout 血清 占冻存液的体积百分含量为 30 % ， 余量为 DMEM 培养基; 所述化合物 （ I) 在冻存液中 的浓度为15ng/ml。
[0015] 配制方法:取配方量的DMEM培养基、二甲基亚砜、Knock-out血清和化合物（I);先 将化合物(I)溶解在二甲基亚砜中，再将DMEM培养基、Knock-out血清和溶解有化合物（I)的 二甲基亚砜混合均匀。
[0016] 细胞冻存:成体干细胞经lOOOrpm离心10min后倒掉上清液，用含化合物（I)的冻存 液重悬，装入无菌细胞冻存管中。
[0017] 冻存程序:放入细胞程序性冷冻盒，-80°c放置12h后放入液氮长期保存。或4°C条 件下放置30min，-20°C放置2h，-80°C放置16~18h后直接放入液氮长期保存。
[0018]细胞复苏:冻存管从液氮取出后，在37~40°C水域中迅速搅动至溶解，加入DMEM培 养基，1500rpm离心10min，弃上清，置37°C、5 % C02培养箱中培养。
[0019] 实施例2:冻存液的制备
[0020] 配方:含有DMEM培养基、二甲基亚砜、Knock-out血清和化合物（I);每100ml冻存液 中，所述二甲基亚砜占冻存液的体积百分含量为8%，所述Knock-out血清占冻存液的体积 百分含量为20%，余量为DMEM培养基;所述化合物(I)在冻存液中的浓度为10ng/ml。
[0021] 配制方法:取配方量的DMEM培养基、二甲基亚砜、Knock-out血清和化合物（I);先 将化合物(I)溶解在二甲基亚砜中，再将DMEM培养基、Knock-out血清和溶解有化合物（I)的 二甲基亚砜混合均匀。
[0022] 细胞冻存:成体干细胞经lOOOrpm离心10min后倒掉上清液，用含化合物（I)的冻存 液重悬，装入无菌细胞冻存管中。
[0023]冻存程序:放入细胞程序性冷冻盒，_80°C放置12h后放入液氮长期保存。或4°C条 件下放置30min，-20°C放置2h，-80°C放置16~18h后直接放入液氮长期保存。
[0024]细胞复苏:冻存管从液氮取出后，在37~40°C水域中迅速搅动至溶解，加入DMEM培 养基，1500rpm离心10min，弃上清，置37°C、5 % C02培养箱中培养。
[0025]实施例3:冻存液的制备
[0026] 配方:含有DMEM培养基、二甲基亚砜、Knock-out血清和化合物（I);每100ml冻存液 中，所述二甲基亚砜占冻存液的体积百分含量为10%，所述Knock-out血清占冻存液的体积 百分含量为40%，余量为DMEM培养基;所述化合物（I)在冻存液中的浓度为20ng/ml。
[0027] 配制方法:取配方量的DMEM培养基、二甲基亚砜、Knock-out血清和化合物（I);先 将化合物(I)溶解在二甲基亚砜中，再将DMEM培养基、Knock-out血清和溶解有化合物（I)的 二甲基亚砜混合均匀。
[0028] 细胞冻存:成体干细胞经lOOOrpm离心10min后倒掉上清液，用含化合物（I)的冻存 液重悬，装入无菌细胞冻存管中。
[0029]冻存程序:放入细胞程序性冷冻盒，_80°C放置12h后放入液氮长期保存。或4°C条 件下放置30min，-20°C放置2h，-80°C放置16~18h后直接放入液氮长期保存。
[0030]细胞复苏:冻存管从液氮取出后，在37~40°C水域中迅速搅动至溶解，加入DMEM培 养基，1500rpm离心10min，弃上清，置37°C、5 % C02培养箱中培养。
[0031 ]实施例4:实施例1的对比实施例，不含化合物(I)
[0032] 配方:含有DMEM培养基、二甲基亚砜和Knock-out血清;每100ml冻存液中，所述二 甲基亚砜占冻存液的体积百分含量为9%，所述Knock-out血清占冻存液的体积百分含量为 30%，余量为DMEM培养基。
[0033] 配制方法:取配方量的DMEM培养基、二甲基亚砜和Knock-out血清混合均匀。
[0034]