一种基于热应激的猕猴桃遗传转化受体系统的建立方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物组织培养及基因工程技术领域，具体而言，一种基于热应激的猕 猴桃遗传转化受体系统的建立方法。
【背景技术】
[0002] 猕猴桃属猕猴桃科(Actinidiaceae)猕猴桃属植物，由于它们具有维生素 C含量 高、风味独特、营养丰富等优点而备受关注。中华猕猴桃(Actinidia chinensis)是猕猴桃 的主要栽培种之一，其中伏牛95 - 2品系的果肉为红色，是特异的中华猕猴桃种质资源，但 因其具有果实小、外观差等不足，因此有待于改良并提高其果实品质以适应市场需求。利用 常规育种手段进行猕猴桃的品种改良所需的周期长、工作量大且效率低，难以满足生产发 展的需要，而基因工程技术则为猕猴桃的种质改良开辟了一条新途径。
[0003] 自1985年Horsch等发明叶盘法以来，基因工程的转化工作相对简化。成功的基因 转化系统首先依赖良好的植物受体系统的建立，即要求用于转化的外植体能够高效、稳定 地再生无性系，并能接受外源DNA的整合，同时用于筛选的转化细胞或植株应该对抗生素具 有一定的敏感性。本发明申请人之前对于中华猕猴桃的遗传转化体系已有研究，但该体系 依然存在再生时间长，不定芽所生根系不发达的问题。
[0004] 有鉴于此，特提出本发明。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种基于热应激的猕猴桃遗传转化受体系统的建立方法， 所述的猕猴桃遗传转化受体系统，可解决现有转化体系再生时间长，不定芽所生根系不发 达的问题。
[0006] -种基于热应激的猕猴桃遗传转化受体系统的建立方法，包括：
[0007] 将热应激处理后的中华猕猴桃伏牛95 - 2的组培苗的叶片作为外植体，将所述外 植体处理成为愈伤组织并进行不定芽的诱导培养及生根培养。
[0008] 植物的每个细胞都包含着该物种的全部遗传信息，从而具备发育成完整植株的遗 传能力。在适宜条件下，任何一个细胞都可以发育成一个新个体。植物细胞全能性是植物组 织培养的理论基础，其全能性的强弱与转化体系中愈伤组织的分化速度息息相关。
[0009] 本申请所采用的热应激方法，是发明人在实验中偶然发现的。由于培养室内的温 度调节装置出现故障而出现了短暂升温，在随后的培养中，发现这一批次的愈伤组织分化 速度显著高于之前的批次，且根系更为发达。经过发明人对调整遗传转化受体系统进行调 整之后最后确定下来整体参数。
[00?0]关于热应激(heat stress)对植物细胞全能性的影响目前还没有明确的机制，但 近年来研究发现，在动物中会有应激处理之后细胞的全能性得到部分恢复的现象【Nature 510,393-396(19 June 2014)】，研究人员通过对小鼠的肌肉干细胞(星状细胞)进行研究时 发现的，这类细胞通常情况下是处于一种静止状态，不像其他细胞在不断进行DNA复制以及 分化。但一旦肌体在受伤或者需要再生时，这些细胞即可被激活。而植物细胞的全能性本身 就远超于动物细胞，其全能性可能也会受到应激影响，进而使愈伤组织分化能力更强，这可 能具有与动物细胞不同的分子机制。
[0011]经过热应激处理后，本申请取得了再生时间显著缩短，且不定芽所生根系更为发 达的效果。
[0012] 优选的，如上所述的基于热应激的猕猴桃遗传转化受体系统的建立方法，所述组 培苗的叶片的叶龄为28~32d。
[0013] 优选的，如上所述的基于热应激的猕猴桃遗传转化受体系统的建立方法，所述热 应激的具体步骤为：
[0014] 取健壮的中华猕猴桃伏牛95 - 2的组培苗，在其叶龄为18~22d时，于早上6:00~ 8:00时，将所述组培苗于35~38 °C热处理30~50min，次日6:00~8:00时相同条件再处理一 次；
[0015] 除热应激处理以外，其余的培养温度均为23~27°C。
[0016] 中华猕猴桃的最适培养温度为23~27°C，当环境温度超过40°C时就可能导致植株 的死亡。早上6:00~8:00进行热应激效果最好，且可缩短植株的恢复时间。热应激处理的具 体操作方法为，将组培苗转移到室温为35~38°C的培养环境中静置30~50min。
[0017] 优选的，如上所述的基于热应激的猕猴桃遗传转化受体系统的建立方法，将外植 体处理成为愈伤组织并进行不定芽的诱导培养的具体操作包括：
[0018] 去掉叶片的叶尖和叶缘，垂直沿叶片中脉切成(0.4~0.6cm) X (0.4~0.6cm)的叶 盘作为试验用外植体，将叶片正面向上接种于愈伤组织及不定芽诱导培养基中进行培养。
[0019] 优选的，所述愈伤组织及不定芽诱导培养基为MS+(1.5~2.2)mg/L ΖΤ+(0·5~ 0.7)mg/L ΝΑΑ〇
[0020] 进一步优选的，所述愈伤组织及不定芽诱导培养基为MS+(1.5~2.2)mg/L ZT+ (0.5~0.7)mg/L NAA。
[0021 ]配制方法为，在MS培养基中按既定量添加 ZT及NAA。
[0022]优选的，如上所述的基于热应激的猕猴桃遗传转化受体系统的建立方法，所述生 根培养的具体操作包括:将长至2~3cm的健壮不定芽接种于生根培养基中进行培养。
[0023] 优选的，所述生根培养基为l/2MS+(2.3~2.6)mg/L NAA。
[0024] 配制方法为，在MS培养基中按既定量添加 NAA。
[0025] 进一步优选的，所述生根培养的培养条件为：
[0026] 培养温度23~27°C，光照时间13~15h/d，培养时间为20~30d。
[0027] 优选的，如上所述的基于热应激的猕猴桃遗传转化受体系统的建立方法，所述愈 伤组织及不定芽诱导培养基中的MS和所述生根培养基中的1/2MS均为对基础MS培养基中的 部分无机盐改良得到的，改良成分为:KN〇3调整为700~750mg/L，NH4N03调整为600~650mg/ L〇
[0028] 表1改良MS培养基母液配制示例(单位:mg)
[0029]
[0031] 其中，MS培养基是Murashige和Skoog于1962年为烟草细胞培养设计的，其特点是 无机盐和离子浓度较高，是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量高，其养分的数量和比 例合适，但是，高盐离子浓度反而不利于中华猕猴桃伏牛95 - 2的分化。因此，本申请对其中 大量元素中的KN〇3及NH4NO3含量进行改良，其具体含量如表1所示。
[0032] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0033] (1)热应激操作简单，技术难度低。
[0034] (2)愈伤组织及不定芽的诱导时间大幅减少，增加培养效率;愈伤组织及不定芽的 的分化率可达96 %。
[0035] (3)不定芽的生根培养培养时间大幅减少，增加了培养效率;根系生物量、分支数、 根茎入土深度都较其他方法进步明显，说明培养得到的根系发育更为发达。
【具体实施方式】
[0036] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会 理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体 条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为 可以通过市售购买获得的常规产品。
[0037] 实施例1
[0038] -种基于热应激的猕猴桃遗传转化受体系统的建立方法
[0039] 取健壮的中华猕猴桃伏牛95 - 2的组培苗，在其叶龄为18d时，于早上6:00~8:00 时，将所述组培苗于35~38°C热处理30~50min，次日6:00~8:00时相同条件再处理一次；
[0040] 除热应激处理以外，其余的培养温度均为23~27°C。
[0041] 将热应激处理后的中华猕猴桃伏牛95 - 2的组培苗的叶片作为外植体，将所述外 植体处理成为愈伤组织并进行不定芽的诱导培养及生根培养。
[0042] 实施例2
[0043] -种基于热应激的猕猴桃遗传转化受体系统的建立方法
[0044] 取健壮的中华猕猴桃伏牛95 - 2的组培苗，在其叶龄为22d时，于早上6:00~8:00 时，将所述组培苗于35~38°C热处理30~50min，次日6:00~8:00时相同条件再处理一次；
[0045] 除热应激处理以外，其余的培养温度均为23~27°C。
[0046] 将热应激处理10d后的中华猕猴桃伏牛95 - 2的组培苗的叶片作为外植体，去掉叶 片的叶尖和叶缘，垂直沿叶片中脉切成〇 . 4cm X 0.4cm的叶盘作为试验用外植体，将叶片正 面向上接种于愈伤组织及不定芽诱导培养基中进行培养。
[0047] 愈伤组织及不定芽诱导培养基为MS+1 · 5mg/L ΖΤ+0 · 5mg/L NAA;
[0048] 培养条件为:培养温度23~27°C，光照时间13~15h/d，培养时间为25d。
[0049] 将长至2~3cm的健壮不定芽接种于生根培养基中进行培养。
[0050] 生根培养基为l/2MS+2.6mg/L NAA;
[0051] 培养条件为:培养温度23~27°C，光照时间13~15h/d，