山葡萄组织培养基及山葡萄组织培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及植物组织培养领域，具体而言，设及一种山葡萄组织培养基W及山葡 萄组织培养方法。
【背景技术】
[0002] 山葡萄(Vitis amurensis Rupr.)原产中国东北及朝鲜、前苏联远东地区。山葡萄 也是我国东北地区葡萄酒酿造工业的主要原料，所酿制的葡萄酒酒体鲜艳透明，风味独特， 因此深受消费者喜爱。同时山葡萄也是葡萄属中最抗寒的一个种，对白腐病、白粉病、炭痘 病和黑豆病等也有较强的抵抗能力。因此，它是葡萄抗寒抗逆育种的重要种质资源，具有较 高的经济价值。
[0003] 中国农业科学院特产研究所建有国家果树种质左家山葡萄圃，资源圃露地保存中 国北方各省、区及俄罗斯远东地区山葡萄种质资源400余份，是当前世界上保存山葡萄种质 资源份数最多、面积最大的山葡萄种质资源圃。为避免田间圃位保存易受自然灾害影响而 导致种质丢失或毁灭的危险，采用组织培养蔽芽成苗（亦简称组培苗）的途径，已成为山葡 萄种质资源保存W及优良单株快速繁殖的主要途径，但获得的再生植株均存在不同程度的 玻璃化现象，严重时甚至出现图1所示的由于发生玻璃化而折断的山葡萄组织培养幼苗，运 会导致幼苗死亡。
[0004] 组培苗玻璃化现象在植物组织培养中普通存在，玻璃化的植株形态崎形，叶片、茎 梢常呈半透明水溃状，叶片皱缩、易碎，生理功能异常，分化能力低。玻璃化苗后续培养期间 也很难恢复正常生长，在继代培养中仍然形成玻璃化苗。因此，玻璃化现象是亟待解决的组 织培养Ξ大难题之一，能否有效控制玻璃化苗问题已成为山葡萄组织培养能否成功的关键 所在。同时，目前对如何控制山葡萄组培苗玻璃化的问题也鲜见报道。
[0005] 有鉴于此，特提出本发明。
【发明内容】
[0006] 山葡萄组织培养主要包括:诱导培养、增殖培养、生根培养和无菌苗移栽四个过 程。玻璃化现象主要发生在诱导培养和增殖培养运两个阶段，特别是最初的诱导培养阶段。 因此，如何有效地控制诱导培养和增殖培养过程中外植体玻璃化问题，对克服山葡萄组培 苗玻璃化现象至关重要。本发明主要通过提供一种山葡萄组织培养基和一种山葡萄组织培 养方法，两种综合手段极大克服了山葡萄组培苗玻璃化现象的发生。具体如下：
[0007] 本发明的第一目的在于提供一种山葡萄组织培养基，本发明所述培养基中，通过 控制培养基中6-节氨基嚷岭等外源激素的用量来调节接种外植体内源激素的水平;并通过 增加培养基内琼脂、薦糖等物质的浓度，来降低培养基的水势，运在一定程度上较好地减轻 了山葡萄组培苗玻璃化现象的发生，特别是诱导阶段的玻璃化现象。同时，培养基内活性炭 的加入可避免因培养基薦糖浓度的增加而导致的组培苗褐变现象的发生，进而提高山葡萄 组织培养的成功率。
[0008] 本发明的第二目的在于提供一种山葡萄组织培养方法，本发明方法中，通过在现 有的组织培养幼苗过程中进一步加入过渡培养步骤，并使用本发明所述培养基作为诱导培 养基W及增殖培养基，从而通过对培养流程W及所用培养基的优化，有效控制了诱导培养 和增殖培养过程中的玻璃化现象。
[0009] 为了实现本发明的上述目的，特采用W下技术方案：
[0010] -种山葡萄组织培养基，所述培养基为MS基本培养基中溶有6-节氨基嚷岭、糞乙 酸、琼脂W及薦糖，并进一步加入活性炭和/或青霉素钢所制成的;其中，6-节氨基嚷岭在所 述培养基中的含量为0.1-2.0111邑/1，糞乙酸在所述培养基中的含量为0.001-0.01111邑/1。
[0011] 本发明中，通过控制培养基中激素用量，并降低培养基水势及培养容器的相对湿 度，进而克服了培养过程中，尤其是诱导培养和增殖培养过程中玻璃化现象的发生。同时， 本发明中，通过在培养基内加入活性炭可避免因培养基薦糖浓度的增加而导致的组培苗褐 变现象的发生，进而提高山葡萄组织培养的成功率。可选的，本发明中，所述MS基本培养基 中，添加6-节氨基嚷岭的含量为0.1-2. Omg/L，糞乙酸的含量为0.001-0.0 lmg/L，琼脂含量 为5.0-10.0g/L，薦糖的含量为20-50g/L，活性炭含量为0.1-2.0g/L，青霉素钢的含量为l- 3m邑/L。
[0012] 本发明中，通过增加培养基中薦糖W及琼脂等物质的含量，从而降低了培养基水 势，进而克服了培养过程中玻璃化现象的发生，提高了山葡萄组织培养的成功率。
[0013] 可选的，本发明中，所述MS培养基中，添加各组分含量分别为：6-节氨基嚷岭0.5- 1. Omg/L，糞乙酸0.001-0.005mg/L，琼脂 7.0-7.5g/L，薦糖 30-35g/L，活性炭0.4-0.8g/L。
[0014] 可选的，本发明中，所述MS培养基中，添加各组分含量分别为：6-节氨基嚷岭1.0- 2.0111旨/1，糞乙酸0.005-0.01111旨/1，琼脂7.0-7.5旨/1，薦糖28-32旨/1，青霉素钢1-3111邑/1。
[0015] 本发明同时还提供了一种山葡萄组织培养的方法，其包括如下步骤：
[0016] 将山葡萄外植体接种于本发明所述山葡萄组织培养基中进行诱导培养；
[0017] 将诱导培养后的外植体进行过渡培养；
[0018] 将过渡培养后的外植体转接到本发明所述的山葡萄组织培养基中进行增殖培养， 并得到增殖的山葡萄植株。
[0019] 其中，所述过渡培养所用培养基为1/2MS基本培养基，其中溶有6-节氨基嚷岭、糞 乙酸、琼脂和薦糖，并进一步加入活性炭，6-节氨基嚷岭在所述过渡培养基中的含量为0.1- 1.0111旨/1，糞乙酸在所述过渡培养基中的含量为0.001-0.005111邑/1。
[0020] 本发明中，通过在现有的组织培养幼苗过程中进一步加入过渡培养步骤，并使用 本发明所述培养基作为诱导培养基W及增殖培养基，从而克服了山葡萄组培苗玻璃化的发 生。
[0021] 具体的，本发明中，通过控制诱导培养和增殖培养过程中所用培养基中6-节氨基 嚷岭等激素浓度，调节了接种外植体内源激素的水平，从而降低了玻璃化现象的发生；同 时，本发明中，通过提高诱导培养和增殖培养所用培养基中薦糖W及琼脂等物质含量，从而 有效的降低了培养基的水势，进而能够有效的控制诱导培养和增殖培养过程中的玻璃化现 象。进一步的，本发明中，通过增加过渡培养步骤，并将过渡培养基中MS的大量元素降低至 1/2,并逐步提高激素浓度，将激素浓度提高一倍，但不改变激素比例，从而实现了诱导培养 和增殖培养过程间培养基激素浓度和有效成分的逐步改变，从而防止由于初期诱导阶段激 素浓度过高所导致的诱导出的组培苗易发生玻璃化的现象，因而既有利于进一步的增殖培 养，又不易发生玻璃化问题。
[0022] 可选的，本发明中，所述外植体为山葡萄茎尖分生组织、单芽茎段中的一种;优选 的，本发明中，所述外植体为山葡萄单芽茎段。
[0023] 可选的，本发明中，所述1/2MS基本培养基为大量元素减半的MS基本培养基。
[0024] 可选的，本发明中，所述过渡培养的培养基为MS基本培养基中溶有6-节氨基嚷岭、 糞乙酸、琼脂、薦糖，并进一步加入活性炭所制成。进一步的，所述培养基中，各组分含量分 别为:6-节氨基嚷岭 0.5-1. Omg/L，糞乙酸 0.001-0.005mg/L，琼脂 7.0-7.5g/L，薦糖 30-35g/ L，活性炭 0.4-0.8g/L。
[0025] 可选的，本发明中，所述增殖培养的培养基为MS基本培养基中溶有6-节氨基嚷岭、 糞乙酸、琼脂、薦糖，并进一步加入青霉素钢所制成。进一步的，所述培养基中，各组分含量 分别为：6-节氨基嚷岭1.0-2 . Omg/L，糞乙酸0.005-0 . Olmg/L，琼脂7.0-7.5g/L，薦糖28- 32g/L，青霉素钢 l-3mg/L。
[0026] 可选的，本发明中，所述诱导培养、过渡培养W及增殖培养是在玻璃培养瓶中进行 的。
[0027] 本发明中，通过使用玻璃培养瓶进行培养，从而避免了普通的塑料培养瓶在灭菌 后，其瓶体内水汽过大，且不易蒸发，从而使得外植体容易发生玻璃化、水溃化，甚至使得外 植体腐烂死亡的问题，从而进一步能够减轻山葡萄组织培养所得山葡萄幼苗的玻璃化程 度。
[00%]可选的，本发明中，所述玻璃培养瓶为50mL玻璃Ξ角瓶，并用通气好的封口膜进行 封口。
[0029] 可选的，本发明中，每次配制好的培养基装入玻璃Ξ角瓶中W后，应先经过高压灭 菌，并放置1周左右，待Ξ角瓶内水汽消减后再进行接种培养，每瓶培养基中最多培养不超 过3个外植体。
[0030] 可选的，本发明中，所述诱导培养的溫度为21~23°C，环境湿度为30~50%。
[0031] 本发明中，通过对诱导培养过程中环境溫度W及湿度的控制，从而进一步降低了 组织培养幼苗发生玻璃化的可能性。
[0032] 可选的，本发明中，所述诱导培养的时间为20-24d。
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