一种细胞冻存液及其应用
【技术领域】
[0001 ]本发明属于细胞培养的技术领域，具体涉及一种细胞冻存液及其应用。
【背景技术】
[0002]细胞培养技术自1907年开创以来，历经一个世纪的发展，已成为自然科学领域不可缺少的研究方法之一。在细胞培养技术中，细胞冻存是细胞保存的主要方法之一，具体而言，细胞冻存是指利用冻存技术将细胞置于O?-196°C的低温保存，使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验或者其他用途。
[0003]在医学方面，近年来干细胞的研究越来越被人们关注，由于它是一种具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，可分化为多种功能细胞。根据发育阶段和取材来源，干细胞分为胚胎干细胞和成体干细胞两大类。骨髓和脐血是成体干细胞的主要来源。骨髓干细胞在骨髓中含量极少，约占骨髓有核细胞的十万分之一，所以要在临床上广泛应用首先必须具备先进的冻存与复苏技术。而干细胞研究的深入将解决包括癌症等一系列为人们所知的“绝症”。而“冬眠”技术对医学的发展有着里程碑式的意义。
[0004]对于细胞冻存技术，1972年，Mazur等首先根据中国仓鼠组织培养细胞的低温保存实验数据分析，提出关于冷冻损伤的两因素假说目，即冰晶损伤和溶液损伤假说。这个假说认为随着温度的下降，细胞内外的水分结冰，所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏并引起细胞死亡。这种因细胞内部结冰而致的细胞损伤即就是冰晶损伤(Intracellularice damage)。冰晶损伤是由冷却速度过快造成，冷却速度越快，冰晶损伤越大。同时随着温度的下降，细胞外部的水分会先结冰，从而使得未结冰的溶液中电解质浓度升高，细胞膜上的脂质会因长时问暴露在高溶质的溶液中而受到损坏，细胞发生渗漏，导致在复温时大量水分渗入细胞内造成细胞死亡。这种因保存溶液溶质浓度增高而致的细胞损伤被称为溶液损伤(SoIut1n damage)。溶液损伤是由冷却速度过慢，使细胞在高浓度的溶液中暴露的时间过长而造成，冷却速度越慢，此损伤越严重。
[0005]为解决上述问题，在细胞冻存过程中使用添加二甲基亚砜(DMSO)的细胞冻存液。但是DMSO也是一种对细胞毒性很大的化学试剂。培养液中残存的DMSO是冻存细胞复苏后出现细胞毒现象的主要原因，尽量去除DMSO是减少其对细胞毒性作用和保证细胞尽快恢复生长增殖的关键。另外，目前采用10%的DMSO和人血清白蛋白深低温保存干细胞是最常用的方法，但加入药品人血清白蛋白时，既增加冷冻保护剂的费用，也可能增加输注异体人体白蛋白产生不良反应的机会。而用自体血浆代替人血清白蛋白，在冷冻和解冻过程中可能发生凝集和凝胶化。这是因为自体外周血干细胞采集均是用血液成分离机完成的，血小板和有核细胞一起被富集。当冻存物中有多量血小板时，血小板在深低温保存和解冻的过程中将被活化，释放出促凝物质，导致冻存物中出现凝集和凝胶化。
【发明内容】
[0006]为此，本发明所要解决的技术问题在于现有技术中为保证冻存效果不得不在细胞冻存液中添加DMSO，由此带来的对细胞的毒性作用，进而提供一种既能够达到DMSO对细胞冻存的效果，又能够减少细胞毒性作用的细胞冻存液。
[0007]本发明还提供了所述冻存液的应用方法。
[0008]为解决上述技术问题，本发明的细胞冻存液，包括人血白蛋白、AB血清、HBS中的两种或者三种的混合物。
[0009 ] 优选地，所述的细胞冻存液，包括人血白蛋白与AB血清。
[0010]优选地，所述的细胞冻存液，包括AB血清与HBS。
[0011 ]优选地，所述的细胞冻存液，包括人血白蛋白与HBS。
[0012]优选地，所述细胞冻存液以复方电解质注射液作为溶剂。
[0013]需要说明的是，所述人血白蛋白的英文名称为Albumin Human，CAS号为70024-90-7;HBS的英文名称为hemoglobin S，即血红蛋白S;AB血清的英文名称为AB-Human Serum。
[0014]本发明的应用所述的细胞冻存液的方法，包括以下步骤:
[0015](I)检测待冻存的细胞的细胞活率、诱导分化、端粒酶，并进行核型分析；
[0016](2)取所述的细胞冻存液，对细胞进行冻存；
[0017](3)复苏步骤2)中冻存的细胞；
[0018](4)检测复苏培养的细胞的细胞数量、细胞活率、诱导分化、端粒酶，并进行核型分析。
[0019]本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点:
[0020](I)本发明的细胞冻存液，包括人血白蛋白、AB血清、HBS中的两种或者三种的混合物。本发明所述的细胞冻存液，未添加DMSO，可避免DMSO对细胞的毒性做用，更为重要的是，可以实现在不添加DMSO的情况下实现良好的细胞冻存的效果。
[0021](2)本发明的细胞冻存液对细胞有更好和更稳定的保护作用，融解后活细胞比例为8513% ±6115% ;集落的回收率90158% ±9176%。
【附图说明】
[0022]为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，
[0023]图1为生理盐水和冻存液人工计数活率比较图；
[0024]图2为生理盐水组和冻存液组保存后细胞贴壁能力变化图；
[0025]图3为冻存液组保存后核型分析对比图；
[0026]图4为流式细胞仪检测细胞表面抗原图。
【具体实施方式】
[0027]实施例1
[0028]本实施例的细胞冻存液，包括以下重量份的组分:人血白蛋白1g;AB血清1g。
[0029]其制备方法包括以下步骤:
[0030]按选定的重量份取人血白蛋白以及AB血清，与150ml复方电解质注射液混合均匀，即得。
[0031]实施例2
[0032]本实施例的细胞冻存液，包括以下重量份的组分:AB血清10g;HBS1go
[0033]其制备方法包括以下步骤:
[0034]按选定的重量份取HBS以及AB血清，与120ml复方电解质注射液混合均匀，即得。
[0035]实施例3
[0036]本实施例的细胞冻存液，包括以下重量份的组分:人血白蛋白1g;HBSlOg。<