一种法斗木莲组织快繁育苗方法
【技术领域】
[0001]本发明属于植物的组织培养技术领域，具体涉及一种法斗木莲组织快繁育苗方法。
【背景技术】
[0002]法斗木莲(Manglietia fadouensis Law et R.Z.Zhou ined)隶属木兰科(Magnoliaceae)木莲属(Manglietia)，常绿乔木，高达15m，胸径达30cm;树皮灰褐色，光滑；嫩枝绿色，老枝紫褐色，具褐色细点状皮孔。叶薄革质，狭卵状椭圆形或狭椭圆形，长6?12cm，宽2.5?4cm。花蕾绿色，椭圆体形；花白色、芳香而美丽，雌蕊群多数、白色，雄蕊群多数、绿色，花期4?5月；聚合果成熟时鲜红色，果熟期9-10月。
[0003]法斗木莲为阳性树种，多为森林上层乔木。原产于云南(西畴)海拔1300?1500m的山地常绿阔叶林中。其树冠宽广，树形开阔，枝繁叶茂，花洁白芳香，聚合果熟时鲜红夺目，适应热带、南亚热带、中亚热带、亚热带、温带等气候种植，具有较强的抗风、抗污染和净化环境能力，是极优良的庭园观赏与绿化树种;枝、叶、花可提取具有较强香气和活性的精油，其主要成分是倍半萜类，可调制香料用，是医药、食品、化妆品的重要原料;树干通直，木材轻软，纹理细致，易加工，可供一般家具、建筑用材。综上，法斗木莲是既具有很高观赏价值的园林、庭园绿化树种，又是具有工业开发用途的多功能树种，综合开发潜力大。
[0004]由于法斗木莲天然分布狭窄，种子发芽率低，生境遭破坏，天然更新不良，种群数量越来越小。加之采种困难，缺乏行之有效的育苗措施、快繁技术和管理方法，严重制约了法斗木莲的开发利用。
[0005]经文献检索，目前尚未见关于法斗木莲组培快繁的报道，，目前仅有一篇(4种木莲幼苗生长特性与光和生理研究，2014，朱贤良等)文献中提到过法斗木莲。
【发明内容】
[0006]为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种法斗木莲组织快繁育苗方法。该方法具有不定芽诱导快、增殖倍率高、芽粗壮伸长快、生根率高、生根苗根系发达健壮、移栽成活率高等特点。
[0007]本发明的目的通过下述技术方案实现:
[0008]—种法斗木莲组织快繁育苗方法，包括以下步骤:
[0009]a、无菌种子苗获得:消毒后的法斗木莲种子接种到滤纸桥上，放到液体培养基上进行液体培养，得到无菌种子苗;所述的液体培养基为1/2ML培养基，pH为5.8?6.0;所述的液体培养的条件为:温度为25±2°C，60μπιο1.m—2.s—1光照下培养12h/d；
[0010]b、腋芽诱导:截取步骤a获得的无菌种子苗的子叶节转接到诱导培养基上进行培养，得到腋芽;所述的诱导培养基为ML培养基+6-BA 1.0?3.0mg/L+NAA 0.05?0.2mg/L+蔗糖25?40g/L+卡拉胶7?8.5g/L，pH为5.8?6.0;所述的培养的条件为:温度为25 ± 2°C，60μmo 1.m—2.s—1光照下培养 12h/d;
[0011]C、增殖培养:将步骤b获得的腋芽切下接种到增殖培养基上进行培养，得到增殖苗；所述的增殖培养基为ML培养基+6-BA 0.5?1.5mg/L+NAA 0.05?0.2mg/L+蔗糖25?40g/L+卡拉胶7?8.5g/L，pH为5.8?6.0 ；所述的培养的条件为:温度为25 ± 2°C，60ymol.m—2.s—1光照下培养12h/d ；
[0012]d、生根培养:从步骤c获得的增殖苗中切取嫩芽接种到生根培养基中进行生根培养，得到生根苗。所述的生根培养基为I /2ML培养基+NAA 0.5?1.0mg/L+蔗糖15?20g/L+卡拉胶7?8.5g/L，pH为5.8?6.0;所述的培养的条件为:温度为25± 2°C，60ymol.m—2.s—1光照下培养12h/d。
[0013]为了更好的实现本发明:
[0014]将步骤d得到的生根苗移到温室中炼苗，然后取出幼苗，洗净黏在苗上的培养基，移植到按体积比泥炭土:珍珠岩=3:1的混合基质中，进行培养管理，得到法斗木莲苗。
[0015]所述的ML培养基，其含有以下成份:560mg/LNH4NO3、720mg/L KN03、360mg/L Ca(NO3)2.2H20、370mg/L MgSO4.7H20、170mg/L KH2P04、65mg/L KCU22.3mg/L MnSO4.4H20、8.6mg/L ZnSCU.7H20、6.2mg/L H3B03、0.83mg/L K1、0.25mg/L Na2Mo04.2H2CK0.25mg/LC11SO4.5H20、0.05mg/L NiSO4.6H20^0.025mg/L CoC12、27.8mg/L FeSO4.7H20、37.3mg/LNa2.EDTA.H2O、150mg/L肌醇(Myo-1nsitol)、2.0mg/L甘氨酸(Glycine)、0.5mg/L盐酸硫胺素(Thiamine.HCl)、0.2mg/L烟酸(Nicotinic.acid)、0.2mg/L盐酸卩比卩多醇(Pyridoxine.HCl),pH 5.8?6.0、121°C灭菌 15?20min;
[0016]所述的1/2ML培养基为将ML培养基中所含大量元素(NH4N03、KN03、Ca(N03)2.4H20、MgSO4.7出0、腿2?04、1((:1)的用量减半，其余成分不变。
[0017]步骤a中所述的消毒优选为:将外植体(种子)用体积分数70%?75%酒精溶液浸泡，时间为20?30s，倒掉酒精溶液后，用无菌水冲洗I?2次，然后加入质量分数0.05 %?
0.1%升汞溶液，依据外植体幼嫩程度浸泡3?lOmin，其间不断摇动，倒掉升汞溶液，再用无菌水冲洗5?6次，得到消毒后的外植体(种子)。
[0018]步骤a中所述的液体培养的时间为培养约5?14d后发芽，约28?32天长成幼苗；
[0019]步骤b中所述的截取无菌种子苗的子叶节接种到诱导培养基上是将无菌种子苗用无菌刀片切除部分子叶和子叶节上下多余部分，再接种到诱导培养基上。
[0020]步骤c中所述的增殖培养优选是将腋芽切下，接种到增殖培养基上培养，腋芽分化形成新芽丛，将新芽丛中的芽高2 2cm的幼嫩枝条切割成1.0?1.5cm的茎段，再接入到新的增殖培养基中培养得到增殖苗，所述的增殖培养基为ML培养基+6-BA 0.5?1.5mg/L+NAA0.05?0.2mg/L+鹿糖25?40g/L+卡拉胶7?8.5g/L，pH为5.8?6.0 ；所述的培养的条件为:温度为 25 ± 2 °C，60ymo l.m"2.s—1 光照下培养 12h/d。
[0021]步骤c中所述的培养的时间为28?32d;
[0022]步骤d中所述的生根培养的时间为20?30d。
[0023]本发明通过基本培养基(ML培养基，专门针对法斗木莲生理状态设定的基本培养基)设置、不同激素成份及浓度水平配比优化，以种子为外植体，经腋芽诱导、腋芽增殖和生根培养，形成完整植株，移栽到基质后，得到生长整齐、表型一致的健壮苗木。本发明具有腋芽诱导速度快，诱导率高、达80%;繁殖系数高，达3.32，培育周期短，不受季节限制等优点，增殖芽粗壮，培养28?32d芽高达1.5cm;生根培养20d，生根率可达80 %，平均根数3.4条/株;组培生根苗健壮、移栽成活率高达90 %以上。
[0024]本发明的原理是:以法斗木莲种子为外植体，通过基本培养基设计、激素种类、浓度及其配比的优化，建立其高效的组培快繁技术，达到增殖芽健壮伸长生长快、增殖率高、生根率高、生根苗健壮、移栽成活率高的目的。将为我国法斗木莲的繁殖提供技术支撑，对其推广利用有着极其重大的意义。
[0025]本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果:
[0026]本发明中腋芽诱导速度快、诱导率高;增殖系数大、丛芽粗壮、伸长生长快;生根率高，根系发达，生根苗粗壮、移栽成活率高。本发明为法斗木莲组培育苗提供了有效途径，通过规模化育苗，可以大规模的获得法斗木莲苗，将为法斗木莲乃至木莲属植物的无性化推广提供技术支持，应用前景广阔，对广东乃至华南地区园林绿化及生态文明建设有着极其重大的意义。
【附图说明】
[0027]图1是实施例1获得的无菌种子苗的图。
[0028]图2是实施例1获得的腋芽的图。
[0029]图3是实施例1获得的增殖苗的图。
[0030]图4是实施例1获得的生根苗的图。
[0031]图5是实施例1中待移栽的生根苗的图。
[0032]图6是实施例1中生根苗移栽两个月后的图。
【具体实施方式】
[0033]下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0034]下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。
[0035]以下实施例中所述的ML培养基，其含有以下成份:560mg/L NH4NO3、720mg/L KNO3、360mg/L Ca(NO3)2.2H20、370mg/L MgSO4.7H20、170mg/L KH2P04、65mg/L KCl、22.3mg/LMnSCU.4H20、8.6mg/L ZnSCU.7H20、6.2mg/L H3B03、0.83mg/L K1、0.25mg/L Na2Mo04.2H20、0.25mg/L C11SO4.5H20、0.05mg/L NiSO4.6H20、0.025mg/L CoC12、27.8mg/L FeSO4.7H2〇、37.3mg/L Na2.EDTA.H2O、150mg/L肌醇(Myo-1nsitol)、2.0mg/L甘氨酸(Glycine)、0.5mg/L盐酸硫胺素(Thiamine.HCl)、0.2mg/L烟酸(Nicotinic.acid)、0.2mg/L盐酸卩比口多醇(Pyridoxine.HCl)，溶剂为水。按照上述配方的成分和含量，将上述成分混合均勾，调pH5.8?6.0、121°C灭菌15?20min，得到ML培养基，备用。
[0036]所述的1/2ML培养基为将ML培养基中所含大量元素(NH4N03、KN03、Ca(N03)2.2H20、MgSO4.7出0、腿2?04、1((:1)的用量减半，其余成分不变。
[0037]实施例1
[0038]—种法斗木莲组织快繁育苗方法，包括以下步骤:
[0039](I)外植体采集:种子采自云南省屏边县大围山国家级自然保护区，海拔1700m左右，树龄70年左右，树高30m左右。
[0040](2)外植体表面消毒:将法斗木莲种子在超净工作台上先用无菌水擦洗干净，再用体积分数75%酒精消毒，浸泡时间为20s，倒掉酒精后，无菌水冲洗I?2次，然后加入质量分数0.1 %升汞溶液，浸泡3min，其间不断摇动，倒掉升汞溶液后，用无菌水冲洗5?6次，获得无菌种子。无菌滤纸吸干无菌材料表面水珠，将无菌种子放到滤纸桥上进行培养。
[0041](3)无菌种子苗的获取:将无菌种子放到滤纸桥上，然后放到液体培养基(所述液体培养基为1/2ML基本培养基，pH为5.8?6.0 ；其配制方法为:将上述成分混合均匀后，调pH值，灭菌备用。)上培养(培养条件为:温度为25±2°C，60ymol.m—2.S—1光照下培养12h/d)，每瓶接种一个外植体。5?14d之后，幼苗逐渐萌发，萌发率达90%以上;约28?32天后，获得无菌种子苗，见图1。
[0042](4)腋芽诱导:截取步骤(3)获得的无菌种子苗的子叶节转接到诱导培养基上进行培养(培养条件为:温度为25 ± 2 °C，60ymo1.m—2.s—1光照下培养12h/d)，获得腋芽，见图2。所述的诱导培养基配方为ML培养基+6-BA 3.0mg/L+NAA 0.2mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶7?
8.5g/L，pH为5.8?6.0 (其配制方法为:将上述成分混合均匀后，调pH值，灭菌备用)；腋芽诱导率高，达80% ;腋芽伸长生长快，30d后，芽高达1.5cm左右。
[0043](5)增殖培养:将步骤(4)获得的腋芽截成1.0?1.5cm的茎段转接到增殖培养基上进行增殖培养(培养条件为:温度为25 ± 2 °C，60ymoI.m—