一种细胞冻存液的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医学技术领域，尤其设及一种细胞冻存液。
【背景技术】
[0002] 细胞培养的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各种准备工作方面都 需大量的耗费，而且细胞一旦离开活体开始原代培养，它的各种生物特性都将逐渐发生变 化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。因此及时进行细胞冻 存十分必要。
[0003] 目前，细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要是采用添加适量保护剂的 缓慢冷冻法来冻存细胞，如采用甘油或二甲基亚讽(DMSO)为保护剂，因为如果细胞在不加 任何保护剂的情况下直接冷冻，细胞内外的水分会很快形成冰晶，从而引起一系列不良反 应，如:细胞脱水使局部电解质浓度增高、导致pH值改变，部分蛋白质由于上述原因而变性， 从而引起细胞内部空间结构素乱，溶酶体膜由此遭到损伤而释放出溶酶体酶，使细胞内结 构成分造成破坏，线粒体肿胀，功能丢失，并造成能量代谢障碍。胞膜上的类脂蛋白复合体 也易被破坏引起细胞膜通透性的改变，使细胞内容物丢失。如果细胞内冰晶形成较多，随冷 冻溫度的降低，冰晶体积膨胀造成细胞核DNA空间构型发生不可逆的损伤，而致细胞死亡。
[0004] 现有的冻存方案常采用10%DMS0+90%FBS的冻存方案去保存细胞，该方案能够很 好的为动物细胞提供营养物质，细胞经短时间冻存再复苏后仍能维持较高的活率。但是该 细胞冻存方案经长时间冻存后细胞复苏率较低，只有85%左右，直接制约冻存细胞的临床 应用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种细胞冻存液，使用本发明提供的细胞冻存液长时间冻 存后的细胞复苏率较高。
[0006] 本发明提供一种细胞冻存液，包括W下体积分数的组分：
[0007] 9~13%的二甲基亚讽，2~7%的人血清白蛋白，1~3 %的右旋糖酢，1~5%的葡 萄糖，余量为溶剂。
[000引优选的，所述二甲基亚讽的体积分数为10~12%。
[0009]优选的，所述人血清白蛋白的体积分数为3~6%。
[0010]优选的，所述人血清白蛋白的体积分数为4~5%。
[0011] 优选的，所述右旋糖酢的体积分数为1~3%。
[0012] 优选的，所述右旋糖酢的体积分数为1~2%。
[0013] 优选的，所述右旋糖酢为右旋糖酢-40。
[0014] 优选的，所述葡萄糖的体积分数为2~3%。
[0015] 优选的，所述溶剂为PBS缓冲溶液或生理盐水。
[0016] 本发明提供一种细胞冻存液，包括W下体积分数的组分:9~13%的二甲基亚讽，2 ~7%的人血清白蛋白，I~3%的右旋糖酢，I~5%的葡萄糖，余下为溶剂。本发明采用了人 血清白蛋白替代动物血清作为细胞的营养来源，不仅避免了动物来源病毒的污染，还能有 效的提供是成分多元的营养物质，可被细胞直接吸收使用;此外，人血清白蛋白中含有大量 高分子的蛋白质，可形成水化膜，降低在东村过程中形成的冰晶数量，可降低细胞的机械损 伤、死亡；而右旋糖酢可W很好的维持了渗透压，在溫度下降的过程中，仍能维持良好的渗 透压环境，避免了细胞因溫度下降，渗透压改变而出现细胞死亡的现象，从而提高了经长时 间冻存复苏后的细胞活率。实验结果表明，使用本发明中的冻存液在冻存1个月、6个月和12 个月后的细胞复苏率分别为94~97%、91~98%和90~97%。
【具体实施方式】
[0017]本发明提供一种细胞冻存液，包括W下体积分数的组分：
[001引 9~13 %的二甲基亚讽，2~7 %的人血清白蛋白，1~3 %的右旋糖酢，1~5 %的葡 萄糖，余下为溶剂。
[0019] 使用本发明提供的细胞冻存液长时间冻存后的细胞复苏率较高。
[0020] 在本发明中，所述二甲基亚讽(DMSO)的体积分数为9~13 %，优选为10~12 %，更 优选为10%。本发明对所述二甲基亚讽的来源没有特殊的限制，采用常规的市售商品即可。
[0021] 在本发明中，所述人血清白蛋白化SA)的体积分数为2~7%，优选为3~6%，更优 选为4~5%;本发明对所述人血清白蛋白的来源没有特殊的限制，具体的，在本发明的实施 例中，可采用广州医药公司提供的体积分数为20%的人血清白蛋白。
[0022] 在本发明中，所述右旋糖酢的体积分数为1~3%，更优选为1~2% ;所述右旋糖酢 优选包括右旋糖酢-40(即低分子右旋糖酢），所述低分子右旋糖酢可W很好的维持了渗透 压，在溫度下降的过程中，仍能维持良好的渗透压环境，避免了细胞因溫度下降，渗透压改 变而出现细胞死亡的现象。本发明对所述右旋糖酢的来源没有特殊的限制，具体的，在本发 明的实施例中，可采用广州医药公司提供的体积分数为6%的右旋糖酢-40,规格为SOOmL/ 袋。
[0023] 在本发明中，所述葡萄糖的体积分数为1~5%;本发明对所述葡萄糖的来源没有 特殊的限制，优选采用广州医药公司提供的体积分数为5%的葡萄糖注射液。
[0024] 在本发明中，所述右旋糖酢溶液包括溶剂，所述溶剂可W是PBS缓冲溶液或生理盐 水，本发明对所述PBS缓冲溶液和生理盐水的来源没有特殊的限制。
[0025] 在本发明中，所述细胞冻存液优选按照W下方法制备得到：
[0026] 将体积分数为6%的右旋糖酢-40溶液与体积分数为5%的葡萄糖注射液混合均 匀，配制得到右旋糖酢溶液，所述右旋糖酢溶液中右旋糖酢的体积分数为0.1~3% ;
[0027] 将二甲基亚讽、体积分数为20%的人血清白蛋白和所述右旋糖酢溶液加入溶剂 中，得到细胞冻存液，所述细胞冻存液中含9~13%的二甲基亚讽，2~7%的人血清白蛋白， 1~3%的右旋糖酢和1~5%的葡萄糖。
[00%]在本发明中，所述人血清白蛋白、二甲基亚讽、葡萄糖、右旋糖酢和溶剂的来源和 用量与上述技术方案中人血清白蛋白、二甲基亚讽、葡萄糖、右旋糖酢和溶剂的来源和用量 一致，在此不再寶述。
[0029]本发明提供的细胞冻存液可用于冻存多种类型的人体细胞，如人体肝细胞、人体 免疫细胞、人体肿瘤细胞或人体成体细胞，具体的，在本发明的实施例中，可采用W下类型 和来源的人体细胞：
[0030] 按照文献：田霖，孙彼放，刘海波.人脂肪干细胞的分离培养与生物学特征.《中国 组织工程研究》，2012，16(32): 5946-5952中的方法获取ADSCS原代细胞，经过传代培养，获 取的P3~P5的细胞。
[0031] 按照文献:李艳琪，王洪一.人厮带源间充质干细胞分离培养方法的改进.《中国组 织工程研究》，2014，18(10): 1609-1614中的方法中的方法获取UC-MSC原代细胞，经过传代 培养，获取的P3~P5的细胞。
[0032] 按照文献:陈丹，王小东种分离人外周血单核细胞方法的分离.《天津医科大学 学报》，2014.6:483-485中的方法获取人外周血单个核细胞(PBMC);
[0033] 从暨南大学生命科学院获取肿瘤细胞K562、化60细胞；
[0034] 按照文献王玲玲，马峰，张玉成.人成纤维细胞的体外分离、纯化培养及细胞鉴定. 《中国老年学杂志》，2012，32:1215-1216.中的方法获取成纤维细胞，经过传代培养后，获取 P3~P5的细胞。
[0035] 本发明分别将上述细胞冻存后，于1个月、6个月和12个月将细胞复苏，结果表明， 冻存12个月后复苏的细胞活率均在90% W上。在本发明中，所述细胞冻存和复苏的方法为 本领域技术人员常用的方法。
[0036] 本发明提供一种细胞冻存液，包括W下体积分数的组分:9~13%的二甲基亚讽，2 ~7%的人血清白蛋白，1~3%的右旋糖酢，1~5%的葡萄糖，余下为溶剂。本发明提供的细 胞冻存液具有W下优点：
[0037] 本发明通过优化细胞冻存方案，尽可能避免细胞在冻存过程中因冰晶形成而导致 细胞大量死亡；
[0038] 优化了冻存体系，细胞在复苏后可直接回输至人体；
[0039] 不添加动物来源的血清，避免了动物来源的病毒污染；
[0040] 本发明中的冻存液可用于多种细胞类型，如干细胞、免疫细胞、肿瘤细胞，成体细 胞等。
[0041] 为了进一步说明本发明，W下结合实施例对本发明提供的一种细胞冻存液进行详 细描述，但不能将其理解为对本发明保护范围