一种石斛超低温保存脱毒的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于植物病毒防治技术领域，具体涉及一种石斛超低温保存脱毒的方法。
【背景技术】
[0002]石斛(Dendrobium nobile Lindl)，又名万丈须、吊兰、林兰等，是兰科中的大属，有1500-1600个原生种，主要分布于亚洲的热带、亚热带地区和大洋洲，我国有76种，主要分布于西南和华南地区。茎直立，肉质状肥厚，稍扁的圆柱形，长10-60厘米，粗达1.3厘米。石斛是著名的中药材，性味甘淡微咸，寒，归胃、肾，肺经。益胃生津，滋阴清热。用于阴伤津亏，口干烦渴，食少干呕，病后虚热，目暗不明。石斛花姿优雅，玲珑可爱，花色鲜艳，气味芳香，被喻为“四大观赏洋花”之一。
[0003]由于石解属植物生长缓慢，种子极其微小，且胚具有生理后熟现象，自然繁殖条件下种子萌发率小于5%，加之长期非法采挖，致使多种石解原生种已濒临灭绝。自1987年开始，石解先后被列为《中华人民共和国珍稀濒危植物录》、《濒危野生动植物种国际贸易公约》中级保护植物，2001年石解属全部被列入《国家重点保护野生植物名录(第2批户)》。
[0004]国内外利用石斛的茎节、花梗、幼叶尖为外植体快繁组培苗，在移栽技术方面已做了大量的研究工作，但市场上石斛商品药材仍然短缺。就其原因在于组培苗移栽成活率低，易受外界气候影响，而且易带病毒，致使植株形态畸变，产生皱缩、花叶、杂斑、条斑、植株矮小、品质变劣、品种退化等多种症状，严重时还会导致植株死亡，产量下降。
[0005]至今，兰科植物的病毒病已发现30多种。常见的感染石斛的病毒有建兰花叶病毒(CyMV)和齿兰环斑病毒(ORSV)。感染CyMV病毒的石解植株叶片正反面出现黑色坏死小圆斑，叶脉间生褐色的条斑，后呈条纹状花叶，花叶症状在新叶上明显，成熟的叶上花叶症色淡，使得植株叶片发育不良或开花不正常，病患传播迅速，目前尚无有效的救治方法，一旦发现可疑植株只能立即隔离或烧毁。感染ORSV病毒的石斛，叶的坏死组织为同心圆圈或间有绿色区。圈可联合成各种形状，可使叶脱落。
[0006]种苗是规模化生产的起点，是保护资源和有效利用资源的关键点，种苗的质量得到保证才能提高石斛种植和产品质量。因此，种苗脱毒具有重要的价值和意义。常用的脱毒方法有热处理脱毒法、茎尖脱毒法、热处理茎尖脱毒法等。传统的脱毒方法脱毒率低，脱毒率受茎尖大小的影响，取材困难。因此如何克服现有技术的不足是目前植物病毒防治技术领域亟需解决的问题。
【发明内容】
[0007]为了更有效的保护即将濒危的石斛，提高种苗质量，生产无病毒种苗，本发明提供了一种新型的石斛超低温保存脱毒方法，能有效提高种苗脱毒率。该方法周期短，操作简便，无需复杂的设备、仪器和昂贵的药品试剂，易于推广应用。
[0008]为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下:
一种石斛超低温保存脱毒的方法，包括如下步骤: 步骤(I)，选择I月苗龄的带有CyMV和ORSV病毒的石斛组培苗，取石斛组培苗带有单芽的茎段1.0-1.5cm，接种到基本培养基上，在4°C黑暗条件下炼苗3-5周;所述I月苗龄是继代培养I月的石斛组培苗，苗高度为2-3cm;
所述基本培养基为:l/2MS+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8;
步骤(2)，从步骤(I)所炼的苗上剥取l-3mm长的茎尖，然后将茎尖在4°C黑暗条件下预培养l-3d;接着在超净工作台上，采用高糖加载液对茎尖加载20-40min后，将茎尖转移到玻璃化溶液PVS2中脱水30-60min，再将茎尖投入液氮中保存30min-lh，之后将茎尖在室温下迅速转入卸载液中解冻并卸载20-30min，或是将茎尖在37°C水浴中解冻3-4min再转入卸载液中卸载20-30min，卸载后的茎尖接种到成活培养基上，先暗培养l-3d，后转入正常光照下继续培养，获得石斛脱毒苗；
所述预培养的培养基为:1/2MS+0.3-0.6mol/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8;
所述加载和脱水过程都在冰上进行；
所述高糖加载液为:l/2MS+2mol/L甘油+0.3-0.7mol/L鹿糖，pH5.8 ；
所述玻璃化液PVS2: 1/2MS+0.4mol/L蔗糖+30%w/v甘油+15%w/vDMS0 pH5.8 ；
所述卸载液为:1/2MS+1.2mol/L鹿糖，pH5.8;
所述成活培养基为:1/2MS+0.1-0.2ml/L NAA+0.1-2.0ml/L 6_BA+50g/L马铃薯+25g/L香蕉+7g/L琼脂，pH5.8 ；
所述正常光照培养是在温度25土 1°C、光照强度1000-20001x、光照12h/d的条件下进行培养。
[0009]进一步，优选的是步骤(2)中在体视显微镜下剥取l-3mm长的茎尖。
[0010]进一步，优选的是将茎尖投入液氮中保存时采用小滴玻璃化法或玻璃化法。
[0011]进一步，优选的是所述的小滴玻璃化法是将铝箔纸剪成(0.8-l)cm*(2-2.2)cm长条形的铝箔条，将经PVS2脱水处理后的茎尖放到铝箔条光滑的一面上，向茎尖上滴加PVS2，使茎尖完全包裹于PVS2溶液小滴中，然后将铝箔条直接浸入液氮中进行冷冻，冷冻后将铝箔条装入冻存管中，拧紧盖子，最后投入液氮中保存。
[0012]进一步，优选的是所述的玻璃化法是将将经PVS2脱水处理后的茎尖放入冷冻管中，向冷冻管加入PVS2使茎尖浸泡在PVS2中，盖紧盖子后直接将冷冻管投入液氮中保存。
[0013]进一步，优选的是将4°C黑暗条件下预培养l-3d得到的茎尖先进行包埋，然后再加载、脱水和液氮保存；
所述的包埋的具体步骤为:向茎尖上滴加海藻酸钠包埋液，使得茎尖完全包裹于海藻酸钠包埋液中，然后将含有茎尖的海藻酸钠包埋液液滴加入至钙离子包埋液中，置于室温下，使其充分凝固成包埋珠；
所述的海藻酸钠包埋液为:1/2MS+0.4mol/L蔗糖+2-3.5%w/v海藻酸钠；
所述的钙离子包埋液为:1/2MS+0.4mol/L蔗糖+0.lmol/1氯化钙；
经过包埋后的茎尖加载时间为1.5-2h，脱水时间为4-5h，液氮保存时间为0.9-1.1h。
[0014]进一步，优选的是，所述的包埋珠的直径为4-5_。
[0015]进一步，优选的是，所述的石斛超低温保存脱毒的方法，包括如下步骤:
步骤(I)，取I月苗龄的带有CyMV和ORSV病毒的石斛组培苗，取带有单芽的茎段1.2cm,接种到基本培养基上，在4°C黑暗条件下炼苗4周;所述I月苗龄是继代培养I月的石斛组培苗，苗高度为2-3cm;
所述基本培养基为:l/2MS+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8;
步骤(2)，在体视显微镜下，从步骤(I)所炼的苗上剥取2mm长的茎尖，然后将茎尖在4°C黑暗条件下预培养2d;接着在超净工作台上，采用高糖加载液对茎尖加载30min后，将茎尖转移到玻璃化溶液PVS2中脱水50min，再将茎尖放到0.9cm*2.1cm的铝箔条光滑的一面上，向茎尖上滴加PVS2，使茎尖完全包裹于PVS2溶液小滴中，之后将铝箔条直接浸入液氮中进行冷冻，冷冻后将铝箔条装入冻存管中，拧紧盖子后投入液氮中保存45min，之后将茎尖在室温下转入卸载液中解冻并卸载25min，卸载后的茎尖接种到成活培养基上，先暗培养2d，后转入正常光照下继续培养，获得石斛脱毒苗；
所述预培养的培养基为:1/2MS+0.5mol/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8;
所述加载和脱水过程都在冰上进行；
所述高糖加载液为:l/2MS+2mol/I/y^^+0.6mol/L鹿糖，pH5.8;
所述玻璃化液PVS2: 1/2MS+0.4mol/L蔗糖+30%w/v甘油+15%w/vDMS0 pH5.8 ；
所述卸载液为:1/2MS+1.2mol/L鹿糖，pH5.8;
所述成活培养基为:l/2MS+0.17ml/L NAA+1.5m I/L 6_BA+50g/L 马铃薯+25g/L 香蕉+7g/L 琼脂，pH5.8;
所述正常光照培养是在温度25土 1°C、光照强度1000-20001x、光照12h/d的条件下进行培养。
[0016]进一步，优选的是，所述的石斛超低温保存脱毒的方法，包括如下步骤:
步骤(I)，取I月苗龄的带有CyMV和ORSV病毒的石斛组培苗，取带有单芽的茎段1.3cm，接种到基本培养基上，在4°C黑暗条件下炼苗3.5周;所述I月苗龄是继代培养I月的石斛组培苗，苗高度为2-3cm;
所述基本培养基为:l/2MS+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8;
步骤(2)，在体视显微镜下，从步骤(I)所炼的苗上剥取2mm长的茎尖，然后将茎尖在4°C黑暗条件下预培养1.8d;接着在超净工作台上，采用高糖加载液对茎尖加载25min后，将茎尖转移到玻璃化溶液PVS2中脱水52min，再将茎尖放入冷冻管中，向冷冻管加入PVS2使茎尖浸泡在PVS2中，盖紧盖子后直接将冷冻管投入液氮中保存43mi