一种可提高饲料青贮品质的布氏乳杆菌及其应用的制作方法

本发明涉及一种可提高饲料青贮品质的布氏乳杆菌及其应用，属于青贮饲料制备
技术领域：
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背景技术：
：未经处理的粳稻秸秆是一种劣质粗饲料，粗纤维含量高，可消化利用营养成分低，质地粗硬，适口性差，很难被家畜有效利用。青贮可改善适口性，提高饲料营养价值，扩大饲料来源，是低质粗饲料成功贮存的有效途径。多年来，人们已经进行了大量的尝试来完善作物的发酵过程，改善青贮品质，使更多不适于青贮的牧草或作物可以调制成优质青贮。其中最为生产者所接受的就是通过加入青贮添加剂来提高发酵品质，抑制高水分牧草或作物青贮中真菌的生长，降低丁酸的产生，降低青贮原料干物质(DM)的损失量，减少发酵过程中以及发酵完成后营养物质的损失。维持青贮低pH值及严格厌氧环境，可以避免由丁酸菌或肠细菌所引起的二次发酵(Seconderyfermentation)。在开窖饲喂过程中，由于空气的进入，这类细菌在有氧或微氧状态下可将乳酸和残留的水溶性碳水化合物发酵为丁酸，导致pH值上升。从而导致不耐酸的可水解蛋白质的梭状芽孢杆菌及其它好氧微生物开始活动，使青贮温度升高，同时产生的氨使青贮的pH值进一步升高。二次发酵不仅会导致能量和DM的损失，而且产生的丁酸及梭菌孢子会严重影响家畜采食量、生产性能甚至会影响畜产品质量。因此，抑制青贮二次发酵具有非常重要的意义。生产实践中二次发酵可以通过加入使pH值迅速降低的青贮添加剂来避免。有研究表明，向青贮中加入含有heLABLactobacillusbuchneri的添加剂，可以增强多种牧草青贮的有氧稳定性，降低厌氧储藏阶段及开窖饲喂时酵母菌的生长与存活。2013年，农业部发布的《饲料添加剂品种目录(2013)》中规定布氏乳杆菌可用于青贮饲料。但现有用于饲料青贮的乳酸菌制剂绝大多数都是多种菌组成的复合菌制剂，这类菌制剂具有制备成本高，不同菌种的最佳生长条件存在差异，青贮效果有限等问题。技术实现要素：针对上述问题，本发明提供了一种提高饲料青贮品质的乳酸菌制剂及其制备方法与应用，所采取的技术方案如下：本发明的目的在于提供一种可提高饲料青贮品质的布氏乳杆菌，其特征在于，保藏号为CGMCCNo.11078，于2015年7月15日保藏于位于北京市的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。保藏单位的地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。菌株的分类命名为：Lactobacillusbuchneri。含有所述布氏乳杆菌的制剂也在本发明保护范围之内。优选地，所述含有布氏乳杆菌的制剂剂型为粉剂或液态制剂。优选地，所述制剂为粉剂时，布氏乳杆菌的活菌数为1013～1014cfu/g。优选地，所述制剂为液态制剂时，布氏乳杆菌的菌种浓度为105～107cfu/mL。更优选地，所述液态制剂中布氏乳杆菌的菌种浓度为105cfu/mL。所述布氏乳杆菌在饲料青贮过程中的应用。所述应用的步骤如下：1)新鲜饲料萎蔫后粉碎，获得饲料粉碎物；2)将含有布氏乳杆菌的制剂稀释后配置成含有105～107cfu/mL活性布氏杆菌的菌悬液，再将菌悬液喷洒到步骤1)所得的饲料粉碎物上，混合均匀后获得待青贮饲料；3)将步骤2)所得的待青贮饲料转移到发酵容器中压紧、密封，在15-25℃下，发酵55-65天获得青贮饲料。优选地，所述饲料为苜蓿或禾本科牧草。更优选地，所述禾本科牧草为稻草秸秆、披碱草或老芒麦。所述布氏乳杆菌是从吉林省长春地区梅花鹿青贮饲料(以青贮玉米与柞树枝叶等为主要原料)中分离得到的布氏乳杆菌。由申请人编号为布氏乳杆菌H4001。发明人取上述饲料30g，加入270ml无菌水中，227rpm/min充分震荡1h，取上清液，梯度稀释后，利用倾注分离方法，得到该乳酸菌。经分离、纯化，生理生化检测，核酸检测鉴定为布氏乳酸菌。本发明获得的有益效果如下：本发明所提供的乳酸菌制剂，可提高青贮发酵品质。迅速降低苜蓿、粳稻秸、老芒麦青贮pH值至4.0以下，降低老芒麦青贮干物质损失量2.49％，降低苜蓿青贮蛋白质损失量1％，，提高青贮中乳酸和乙酸含量，抑制丁酸产生，增加青贮饲料有氧稳定性。附图说明图1为添加乳酸菌制剂对苜蓿贮藏稳定性的影响。图2为添加乳酸菌制剂对粳稻秸秆的贮藏稳定性的影响。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。以下实施例中所采用的试剂、材料、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域常规试剂、材料、仪器和方法，本领域技术人员均可通过商业渠道获得。实施例1布氏乳杆菌的筛选和菌剂的制备从梅花鹿青贮饲料中分离得到一株优良布氏乳杆菌H4001乳酸菌。取玉米牧草枝叶混合青贮30g，加入270ml无菌水中，227rpm/min摇床震荡60min，搅拌器充分搅拌，梯度稀释，利用倾注培养法进行分离培养，37℃培养72h选择具有溶钙圈的菌落，采用平板划线的方式纯化5-6代，镜检，将纯化后的乳酸菌接入改良MRS液体培养基中，检测其微生物学特性，如形态学、生理学特性(表1)以及糖分解代谢(表2)的能力。以所分离菌株为核心物质，经过18～24h厌氧发酵，4℃，3000g/rpm离心浓缩，每100ml浓缩液添加100ml冻干保护剂(主要成分为12％无菌脱脂乳+0.2％甘油)，-45℃速冻后，利用Ella1100冻干机0.03mbar冻干24-36h，取出，无菌粉碎分装，-4℃保存。检测其对苜蓿青贮发酵品质(表3)，水稻秸青贮发酵品质(表4)的影响。1.形态学观察、显微镜检以及生理生化指标检测无菌条件下挑取该布氏乳杆菌H4001涂于干净的载玻片上，制片，革兰氏染色进行形态学及染色结果观察。无菌条件下将植物乳杆菌接种于相应的培养基或培养条件下，进行生理生化指标的检测观察。表1形态学与理化试验结果检测指标特性形态学杆状革兰氏染色阳性形成芽孢否接触酶-氧化酶-空气中生长+65℃生长+45℃生长+15℃生长+pH值(培养24h)4.252.不同碳水化合物发酵活性检测无菌条件下，用接种环挑取少许生长旺盛的，培养18-24h的布氏乳杆菌H4001，接种入北京陆桥技术有限责任公司生产的不同糖发酵管内，37℃恒温培养18-24h，观察发酵液颜色变化，以判断对不同碳水化合物的发酵。表2不同碳水化合物发酵活性由表1,2可知，布氏乳杆菌H4001增殖迅速，可在较广泛温度范围内生长，可广泛利用碳水化合物产生能量，是一株性状优良乳酸菌。实施例2乳酸菌制剂对苜蓿青贮发酵品质影响2014年8月14日取内蒙古锡林郭勒盟正蓝旗育草站，5年生，当年第2次刈割的盛花期紫花苜蓿，阳光下萎蔫6h，切成3～4cm段，喷洒布氏乳杆菌H4001培养液，添加菌数约为每克混合牧草5×105cfu，对照组添加等量无菌水。将喷洒后的青贮原料充分混合，取900g左右装入1000ml的青贮瓶中，压紧，密封。发酵60d，检测青贮发酵品质。表3添加布氏乳杆菌H4001对苜蓿青贮pH值及有机酸含量影响由结果可知添加布氏乳杆菌可以有效降低青贮的pH值，但差异不显著。试验期内，添加组乳酸含量低于对照组，差异不显著(p＞0.05)，但乙酸含量明显高于对照组(p<0.05)，正丁酸含量明显低于对照组(p<0.05)，这表明，布氏乳杆菌在一定程度上可以促进乙酸的产生，减少丁酸的生成。表4添加布氏乳杆菌对苜蓿青贮营养成分含量影响结果表明，经过发酵后，牧草的各成分均有不同程度的变化。对照组和添加组DM、Ash、EE、NDF、ADF变化差异均不显著(p>0.05)。添加组可溶性糖(WCS)、CP含量明显优于对照组(p<0.05)。由此说明，添加布氏乳杆菌可以明显抑制苜蓿蛋白质降解，并保留可溶性碳水化合物含量。乳酸菌制剂对苜蓿贮藏稳定性的影响如图1所示。由图1可知，随有氧暴露时间延长，96h开始，对照组青贮中心温度逐渐增加，至有氧暴露422h为止，对照组青贮中心温度比添加组高2.6℃，由此表明添加布氏乳杆菌可有效提高苜蓿青贮有氧稳定性。实施例3不同乳酸菌对粳稻秸发酵品质的影响2015年9月30日取吉林省吉林市左家镇小塘村收割去穗后粳稻秸，离地4-5cm刈割，阳光下萎蔫6h，用农用牧草粉碎机切成3～4cm段，喷洒布氏乳杆菌培养液，添加菌数约为每克混合牧草5×105cfu，对照组添加等量无菌水。将喷洒后的青贮原料充分混合，取800-900g左右装入1000ml的青贮瓶中，压紧，密封。发酵60d，检测青贮发酵品质。结果如表5-6和图2所示。表5添加布氏乳杆菌对粳稻秸青贮pH值及有机酸含量影响添加该乳酸菌制剂可明显降低青贮pH值，增加乙酸含量(P<0.05)，降低乙醇含量(P<0.05)，同时戊酸、正丁酸、丙酸含量均显著低于对照组(P<0.05)。这表明，布氏乳杆菌在一定程度上可以促进发酵，增加乙酸的产生，降低乙醇、丙酸、丁酸和戊酸的生成，进而降低青贮饲料能量损失。表6添加布氏乳杆菌对粳稻秸青贮营养成分含量影响与青干草相比，青贮可明显降低DM损失量(P<0.05)。添加布氏乳杆菌组，可保存原料中WSC含量(P<0.05)，并使氨态氮含量显著降低(P<0.05)，但中性洗涤纤维(NDF)，粗脂肪和灰分含量无显著差异(P>0.05)，粗蛋白质、干物质、酸性洗涤纤维(ADF)含量明显低于对照组(P<0.05)。上述结果表明，添加该乳酸菌可以降低可溶性糖以及氨态氮的损失，但布氏乳杆菌是一种营养要求复杂的兼性厌氧菌，在寡营养状态下将植物中蛋白质作为氮源，以供自身的增殖生长，这一点可由表5和表6中明显降低的青贮pH值和氨态氮含量可以确定，这完全有别于对照组中青贮微生物直接利用植物蛋白质，将其降解为具有刺激性气味的氨态氮。在苜蓿青贮中应用该布氏乳杆菌可明显抑制蛋白质降解不同，出现这一现象主要与菌株本身特性有关，在不同蛋白质含量情况下，菌株选择不同的代谢途径。实施例4不同布氏乳杆菌制剂对披碱草青贮发酵品质的影响2014年8月14日取内蒙古锡林郭勒盟正蓝旗育草站，3年生禾本科披碱草，开花期刈割，阳光下萎蔫6h，用小铡刀切成3～4cm段，分别喷洒来源于鲜牧草附着的布氏乳杆菌Q4001稀释液，梅花鹿青贮饲料中分离的布氏乳杆菌H4001(均于本实验室分离、保存)，添加菌数均为每克混合牧草5×105cfu，对照组添加等量无菌水。将喷洒后的青贮原料充分混合，取900g左右装入1000ml的青贮瓶中，压紧，密封。发酵60d，检测青贮发酵品质。表7.不同布氏乳杆菌对披碱草发酵品质影响由结果可知，添加两种布氏乳杆菌均可降低青贮pH值，提高青贮干物质含量，与对照组相比，H4001对青贮pH的降低更有效，并且可明显提高青贮干物质含量(p<0.05)，降低青贮蛋白质损失(p>0.05)，降低青贮中氨态氮含量，对粗脂肪、酸性以及中性洗涤纤维、粗灰分影响不显著，可保存青贮原料中可溶性糖含量(p>0.01)，效果优于其他来源布氏乳杆菌。表8.添加布氏乳杆菌对老芒麦青贮pH值及有机酸含量影响添加布氏乳酸菌制剂可改变青贮发酵品质，降低青贮pH值，增加乙酸含量(P<0.05)，降低乙醇含量(P<0.05)，同时增加戊酸、丙酸含量(P<0.05)，而且添加本布氏乳酸菌与牧草来源乳酸菌相比，效果更优。这表明，尽管布氏乳杆菌在一定程度上均可以促进发酵，增加乙酸的产生，降低乙醇、丙酸、丁酸和戊酸的生成，进而降低青贮饲料能量损失，但是不同菌株对发酵影响的最终效果不同，在相同青贮时间内，本菌株能达到更好的青贮效果。虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。当前第1页1 2 3