一种提取羊奶乳清的方法与流程

本发明属于食品分离纯化技术领域，具体涉及羊奶乳清的分步提取方法。

背景技术：

干酪的制作过程中会大量产生乳清，乳清含有丰富的蛋白和多种类的微量元素，随着功能食品的开发利用，乳清的合理利用也越发受到关注，高质量的乳清粉已作为营养强化剂添加到食品行业中。在饲料工业，乳清粉也发挥着重要的角色，在羔羊犊牛代乳料、乳猪饲料等领域的应用已广为人知。随着乳清产品在市场上的活跃，乳清蛋白的得率和乳品过敏原αs1酪蛋白的去除是获得高质量乳清的关键，乳清的提纯工艺迫切需要改进。

乳清有多种提纯方法，常见的方法主要有：乙醇分级沉淀法、等电点沉淀法、离心法、膜过滤法，CO₂沉淀分离法，此外还有超临界CO₂萃取法、双水相萃取法等。这些不同方法的提纯过程虽然都比较单一，但都可以比较简洁的分离乳清。

1.乙醇分级沉淀法

沉淀蛋白质所需要使用的乙醇浓度，与所要去除物质的分子量有关。在乙醇的百分数不断增加的情况下，蛋白质逐渐沉淀：纤维蛋白原为8％，球蛋白为20％，白蛋白为40％。一般乙醇加入不能太快，要边加边摇，防止局部浓度过高，造成溶液的共沉或者局部变性。乙醇法沉淀蛋白易造成蛋白变性，变性蛋白无法重新溶解，沉淀蛋白的特异性不够好，分级沉淀的效果不佳，笔者使用乙醇分级沉淀制取乳清蛋白，SDS-PAGE之后发现酪蛋白的量显著降低的同时，乳清蛋白丢失严重。

2.等电点沉淀法

运用蛋白质中正、负电荷数目相同时，蛋白质为电中性，容易沉淀的特点。调整羊奶的pH同酪蛋白等电点相同，这时酪蛋白的溶解度最小，酪蛋白及其夹杂物就会从羊奶中沉淀出来，上清液中所含蛋白即为乳清蛋白。常用等电点沉淀法从羊奶中分离酪蛋白。该方法与制作干酪中得到乳清的原理一致，都运用了等电点沉淀的原理。该方法乳清蛋白损失较少，但是乳清蛋白中酪蛋白污染严重，造成这种结果的原因是：在pH 4.6～4.7环境下分离乳清时，β-酪蛋白(等电点为4.83～5.07)、κ-酪蛋白(等电点为5.3～5.8)等酪蛋白难以沉淀。

3.离心法

离心法被广泛应用于生物样品。如细胞器、蛋白质、病毒和核糖等的分离提纯，是研究生物分子提纯、分离的重要手段。离心法与电泳配合使用，能对蛋白质定量和定性分析，笔者发现离心法和等电点沉淀法都能获得类似的乳清蛋白分离效果：乳清蛋白损失较少，酪蛋白显著减少。但由于酪蛋白的量较多(羊乳蛋白的80％)，而离心法依靠分子量的大小沉淀蛋白，分子量较大的蛋白先沉淀，羊乳中主要蛋白大小依次为：αs1-酪蛋白(23600Da),αs2-酪蛋白(25150Da)，β-酪蛋白(24000Da)，κ-酪蛋白(19000Da)，β-乳球蛋白(18300Da)，α-乳球蛋白(14400Da)。从分子量来看，乳清蛋白(β-乳球蛋白及α-乳球蛋白)和酪蛋白的分子量相差并不大，尤其是κ-酪蛋白的分子量十分接近乳清蛋白，所以难以用离心法从乳清中去除。

4.膜过滤法

膜过滤法使用半透膜作为选择障碍层，利用膜两侧的能量差为动力，通过膜的孔径大小对蛋白质进行过滤，过滤大粒子，通过小粒子，从而起到分离溶液作用。这是一种新型方法，膜过滤存在浓差极化，膜污染的问题，过滤时程长，易导致奶样酸化等问题。

5.双水相萃取法

双水相萃取法的使用率较低。它用不互溶的两种聚合物(如聚乙二醇和葡聚糖)溶液，或是不互溶的盐溶液和聚合物溶液(如硫酸铵和聚乙二醇)。通常先将两种溶质配制成合适浓度的水溶液，再将两者按照不相同的比值配合起来。静置中超过某浓度范围时，两种溶质就会产生两相。试验中选择聚乙二醇、硫酸盐做双水相，乳蛋白应该富集在聚乙二醇相(上相)，乳脂应该富集在盐相(下相)。笔者发现该方法的原料应使用羊乳粉，当使用生羊乳为样品时，因为羊乳中的液体成分复杂，无法回收聚乙二醇和硫酸铵，并且高浓度的硫酸铵极易使羊乳的蛋白盐析，该方法适合在其它提纯乳清方法基础上，制备脱脂乳清粉，只能将乳粉中的乳脂去除。

6.CO₂沉淀分离法

CO₂溶于水，生成碳酸，降低溶液的pH，当溶剂的温度较低，压力较大的时候，CO₂的溶解度会相应增大，从而能达到较低的pH，当pH达到某种蛋白等电点的时候，会导致该蛋白聚沉，降低压力后溶液能回复到正常的pH，与等电点沉淀和盐析相比，CO₂在蛋白分离后更容易除去，这就是该方法的优势所在。然而该方法需要对奶样进行约40倍的稀释，且分离装置较昂贵，这些都是制约因素。

7.超临界CO₂萃取法

该方法成本很高，设备昂贵，不适合农产品和食品的加工。

中国专利“一种酶解羊乳酪蛋白制备ACE抑制肽的方法”(公开日：2013.07.24，公开号：CN103215333A)中公开了先离心再等电点沉淀的酪蛋白分离步骤，酪蛋白的得率接近12％，但是，考虑到羊乳中乳蛋白的含量仅为3～4％，且乳蛋白中酪蛋白的比重为80％，因此，使用该专利提供的方法无法达到有效分离酪蛋白的目的。

目前，亟待提出一种既可以降低酪蛋白的含量，又可以提高乳蛋白得率的羊乳乳清分离方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种提取羊奶乳清的方法。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

1)将羊奶样品经均质处理后于18～25℃条件下离心，离心的转速为≥17000g；

2)离心后弃去离心体系的上层脂肪和下层沉淀，得到羊奶上清液；

3)用等电点沉淀法分离羊奶上清液中的酪蛋白，收集分离酪蛋白后的羊奶上清液，得到羊奶乳清。

所述羊奶样品选自采集的新鲜羊奶或4℃以下低温保存的未发生酸败的羊奶。

所述步骤1)中，离心的时间≥0.5h。

所述步骤3)具体包括以下步骤：用盐酸调节羊奶上清液的pH至4.6～4.7，然后进行静置，直至不再析出沉淀，然后通过离心去除沉淀。

所述静置的时间为25～35min。

所述步骤3)中，离心的条件为：4℃条件下5000g离心20～30min。

所述均质处理包括以下步骤：将羊奶样品置于37～40℃恒温水浴摇床中温育20～30min，转速为60～80rpm。

本发明的有益效果体现在：

与现有分离提取乳清的方法相比，本发明主要采用“高速离心-等电点沉淀-离心分离沉淀”的乳清分离方法；根据羊乳蛋白特性，在对羊乳均质后，采用高速离心不仅能更有效的去除乳脂，还能选择性地沉淀羊乳中分子量较大的酪蛋白，然后经过等电点沉淀，可最大限度地降低酪蛋白的含量，并提高乳蛋白的得率，因此获得了有效分离羊奶乳清的技术效果，具有较高的推广应用前景和经济价值。

附图说明

图1为本发明所述提取羊奶(羊乳)乳清的方法的流程图；

图2为奶样不同处理的SDS-PAGE分析结果；

图3为αs1酪蛋白标准品线性回归曲线。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作详细说明。

(一)乳清分离实施例(参见图1)

1)将40mL新鲜羊奶或者4℃保存的羊奶置于恒温水浴摇床上，37℃温育30min，转速为60～80rpm，使羊奶结构均匀，并且达到预定的温度(37℃)，当羊奶体积大于40mL时，酌情延长温育时间。本方法必须使用理化性质正常的羊奶，酸败的奶样在室温下有固形物小颗粒析出，无法使用，-20℃保存半个月以上的羊奶酸败状况严重，-20℃保存半个月以内的羊奶可根据是否酸败酌情使用。

2)将经过温育的羊奶于18℃条件下17800g离心1h。弃去离心后的羊奶上层脂肪和下层蛋白沉淀，收集羊奶上清液。本方法中，升高离心的温度会导致在室温下进行后续操作时(刮去脂肪层的操作在室温下进行，该操作需要耗费一定的时间，在处理大量样品的时候尤其明显，在这段时间内会导致离心后奶样的升温)脂肪层的回溶，进一步降低离心的温度可使脂肪层的硬度增加，但离心时会有破损的可能，破碎的脂肪层散落在乳清层中，不易除尽。离心宜选用10mL以上的离心体系，40mL离心体系能得到较好的分离效果，离心体系过小会导致实验误差的增大。缩短17800g转速下的离心时间至30min也能得到较高的酪蛋白去除率，离心时间延长至大于1h能进一步提高酪蛋白去除率，但是提高的幅度很小。

3)在室温环境下，加入1mol/L盐酸使羊奶上清液pH达到4.6，在此过程中持续搅拌，使盐酸与羊奶上清液充分混匀，然后静置30min。本方法中，等电点沉淀时pH小于4.6，能得到更高的酪蛋白去除率，但同时会沉淀乳清蛋白，导致乳清蛋白得率的下降。pH超过4.7会导致酪蛋白的去除率下降。

4)4℃条件下5000g离心20min，收集上清液，即获得羊奶乳清，计算其乳蛋白得率及酪蛋白去除率。

(二)乳清分离结果分析

1.乳蛋白得率

利用BCA蛋白检测试剂盒分析发现，上述实施例获得的乳清中乳蛋白(总蛋白)的浓度为10.226+0.240mg/mL，与纯羊奶样品相比乳蛋白得率高达到44.5％，参见表1。

表1提取乳清不同方法的结果比较

2.SDS-PAGE电泳

根据测得的乳蛋白浓度进行SDS-PAGE电泳。取5μL乳清样品与上样缓冲液混合后煮沸5min，冷却备用。配制15％分离胶、5％浓缩胶，将各样品(制样参考以上步骤)加入电泳槽中(等体积加样)，100V电泳30min，之后140V电泳100min。电泳结束后对凝胶进行考马斯亮蓝G-250染色30min，之后脱色至背景透明。结果见图2，上述实施例获得的乳清中酪蛋白条带明显变弱，说明酪蛋白去除率很高。

3.酪蛋白污染检测

利用imagej灰度分析法对图2获得蛋白条带定量分析发现，上述实施例可有效去除酪蛋白，去除率达到63.9％。

表2不同分离方法的酪蛋白去除率

4.αs1酪蛋白污染检测

利用αs1酪蛋白检测试剂盒标准品获得αs1酪蛋白标准品线性回归曲线(图3)。利用回归曲线获得7个样品的αs1酪蛋白浓度。结果发现，上述实施例获得的乳清中αs1酪蛋白浓度为2.285±0.095mg/mL，与纯羊奶样品相比αs1酪蛋白去除率达到14.9％。

表3 6种分离方法处理后的αs1酪蛋白浓度

本发明将高速离心法、等电点沉淀法联合使用，获得的乳蛋白浓度为10.226+0.240mg/mL，乳蛋白得率达到44.5％。同时，显著去除羊奶中的酪蛋白，去除率可达到总酪蛋白的63.9％，并用ELISA试剂盒分析发现αs1酪蛋白的去除率可达14.9％。以上结果证实，本发明的方法(离心+等电点)是获得羊奶乳清的有效方法。