本发明涉及地衣芽孢杆菌-海洋活性寡糖合生元研制方法及其在刺参养殖中的应用。
背景技术：
刺参是中国20多种可食用海参中品质最好的一种，位列海产八珍之首，具有极高的营养价值和经济价值。近十多年来，刺参养殖业发展迅猛，2013年全国刺参产量超过13×104吨，产值突破300亿元，在水产养殖行业单种产值和利润中最高，其发展速度和综合经济效益都是其他经济水产品种所无法比拟的。随着刺参产业向高密度集约化方式转变，刺参养殖的健康和病害问题日益凸显，腐皮综合征等疾病频发，导致生产性能降低，严重制约了刺参产业健康和可持续发展。虽然使用抗生素和化学药物防治水生动物疾病具有一定的效果，但是会导致细菌出现抗药性、药物残留及破坏动物与环境中正常菌群平衡等诸多弊端。随着现代水产养殖业逐步向绿色、环保和无公害方向发展，益生菌和益生元等天然绿色饲料添加剂因具有利于肠道及水体微生态群系平衡、促进动物生长及增强免疫应答，可为宿主带来诸多益处，且绿色安全、无污染，逐渐成为水产养殖领域研究的焦点。
技术实现要素：
本发明的目的在于高效科学配伍益生菌及益生元，从而显著提高刺参的生长性能及非特异性免疫应答，以保证刺参产业健康可持续性发展。
为了达到上述目的，本发明提供了一种海洋合生元添加剂，该添加剂包含源自海洋、具有生物活性的海洋寡糖类益生元——壳寡糖和褐藻寡糖，以及能同时利用壳寡糖与褐藻寡糖作为能源物质生长的地衣芽孢杆菌(Bacillus lincheniformis)WS-2(保藏编号为CGMCC No.12813)。所述地衣芽孢杆菌与上述两种寡糖类益生元科学配伍，制备出的海洋合生元添加剂为可用于刺参养殖促进其生长及增强免疫力的新型合生元添加剂；
上述海洋合生元添加剂的组成包括：
地衣芽孢杆菌WS-2、海洋寡糖类益生元、菌体保护剂、植物源载体；
所述海洋寡糖类益生元包括聚合度为2～10的壳寡糖及聚合度为2～10的褐藻寡糖；
所述壳寡糖分子量<5000，所述褐藻寡糖分子量<2000；
所述褐藻寡糖与壳寡糖的质量比为1:2～3；优选1:2。
所述菌体保护剂为脱脂奶粉、甘油、蔗糖或明胶；优选脱脂奶粉；
所述植物源载体为玉米芯粉、稻壳粉或麸皮；优选玉米芯粉。
优选方式下，所述海洋合生元添加剂各组分的配比为：
浓度大于等于1×1010CFU/mL的地衣芽孢杆菌WS-2菌液中加入占所述菌液质量5～8％的海洋寡糖类益生元、占所述菌液质量5～10％的菌体保护剂后得到的溶液与所述植物源载体按体积质量比1:0.25ml/g混合，冻干。
进一步优化，地衣芽孢杆菌WS-2菌液浓度中等于1×1010CFU/mL，加入的海洋寡糖类益生元占所述菌液质量5％、菌体保护剂占所述菌液质量的10％。
本发明地衣芽孢杆菌WS-2，已于2016年7月27日于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏(简称CGMCC；地址：中国科学院微生物研究所；邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.12813。本发明合生元中的地衣芽孢杆菌WS-2对刺参没有安全性风险，无致病性，可作为刺参的益生菌使用。
上述地衣芽孢杆菌WS-2特征如下：白色，半透明，光滑湿润菌落，稍隆起，圆形齐整菌落；革兰氏染色阳性，细胞呈杆状，运动，好氧，可耐1％～10％NaCl浓度，在褐藻寡糖及壳寡糖选择性培养基上菌落形态分别为淡黄色和褐色，圆形，边缘整齐，最适生长pH为6.5～7.5，最适生长温度25～35℃。
本发明还提供了上述海洋合生元添加剂的制备方法，具体步骤如下：
S1、取地衣芽孢杆菌WS-2菌液，加入海洋寡糖类益生元、菌体保护剂，得到混合液；
所述海洋寡糖类益生元包括聚合度为2～10的壳寡糖及聚合度为2～10的褐藻寡糖；
所述壳寡糖分子量<5000，所述褐藻寡糖分子量<2000；
所述褐藻寡糖与壳寡糖的质量比为1:2～3；优选1:2；
所述菌体保护剂为脱脂奶粉、甘油、蔗糖或明胶；优选脱脂奶粉。
优选方式下，所述地衣芽孢杆菌WS-2菌液浓度大于等于1×1010CFU/mL；优选等于1×1010CFU/mL；
加入的所述海洋寡糖类益生元的量占所述地衣芽孢杆菌WS-2菌液质量的5～8％；优选5％；
加入的所述菌体保护剂的量占所述地衣芽孢杆菌WS-2菌液质量的5～10％；优选10％。
所述地衣芽孢杆菌WS-2菌液的制备方法优选为：
将地衣芽孢杆菌WS-2进行发酵富集，培养温度为25～30℃，pH 6.8～7.8，培养48～72h，得到地衣芽孢杆菌WS-2发酵液；调整地衣芽孢杆菌WS-2发酵液浓度得到地衣芽孢杆菌WS-2菌液；
所述地衣芽孢杆菌WS-2发酵培养基为改进后的2216E海洋培养基，具体成分质量体积比为：
蛋白胨:褐藻寡糖:壳寡糖:酵母膏:沙滤海水＝0.3:0.1:0.1:0.1:100(g:g:g:g:ml)。
此步骤可采用平板计数法调整发酵后的地衣芽孢杆菌WS-2发酵液浓度。
S3、将步骤S2制得的混合液与植物源载体混合；
所述植物源载体为玉米芯粉、稻壳粉或麸皮；优选玉米芯粉；
所述混合液与植物源载体混合的体积质量比优选为1:0.25mL/g。
S4、将步骤S3制得的混合物真空冷冻干燥24h～48h，制成冻干粉，即为海洋合生元添加剂。
经实际测算，本发明制得的海洋合生元添加剂产品中地衣芽孢杆菌WS-2的含量>1010CFU/g。
本发明还提供了上述海洋合生元添加剂在刺参养殖中的应用，具体步骤为：将所述海洋合生元添加剂与海参基础饲料按比例混合；
所述海洋合生元添加剂为所述基础饲料质量的2～5％。
本发明的有益效果是：
1、本发明高效科学配伍益生菌及益生元，使二者协同作用，发挥“1+1>2”的效果，利用本发明所述合生元添加剂可同时发挥地衣芽孢杆菌WS-2和海洋寡糖类益生元的双重益生作用，选择性促进外源性益生菌与内源性肠道有益微生物在动物肠道内定植及增殖，集益生菌的速效性和慢效应物质益生元的生长保护作用于一体，发挥协同效应，促进动物生长，激活宿主免疫系统，并直接或间接抑制有害微生物的繁殖，从而显著提高刺参的生长性能及非特异性免疫应答，更好地促进动物健康生长。
2、本发明能改善刺参肠道微生态环境，促进刺参生长性能，提高刺参养殖品质与效益，可用作水产养殖功能性绿色饲料添加剂。
综上所述，本发明依据肠道微生态营养学原理，在研究与把握现有水产添加剂基础上，结合最新一代高通量测序与微生态菌群分析技术，科学筛选配伍特定益生菌和新型海洋寡糖类益生元，提供一种具有促进刺参生长及激活免疫系统的高效合生元制剂，使其充分发挥合生元各组分的益生作用，达到增强高密度集约化养殖模式下刺参的生长性能及抵御疾病的能力的目的，促进刺参养殖业的健康稳定发展。
具体实施方式
下面将说明本发明的具体实施方式：
实施例1
一、制备海洋合生元添加剂
步骤1：在改进后的2216E海洋培养基中发酵培养地衣芽孢杆菌WS-2，培养温度为28℃，pH 7.0，培养时间为48h，得到地衣芽孢杆菌WS-2发酵液，调节地衣芽孢杆菌WS-2发酵液至其中地衣芽孢杆菌WS-2浓度为1×1010CFU/mL，得到地衣芽孢杆菌WS-2菌液；
蛋白胨:褐藻寡糖:壳寡糖:酵母膏:沙滤海水＝0.3:0.1:0.1:0.1:100(g:g:g:g:ml)；
步骤2：将上述地衣芽孢杆菌WS-2菌液与海洋寡糖类益生元及脱脂奶粉混合，使海洋寡糖类益生元质量浓度为5％，脱脂奶粉保护剂质量浓度为10％；
上述海洋寡糖类益生元包括聚合度2～10的壳寡糖及聚合度2～10的褐藻寡糖；所述壳寡糖分子量<5000，所述褐藻寡糖分子量<2000；所述褐藻寡糖与壳寡糖的质量比为1:2。
步骤3：将步骤2溶液与植物源载体玉米芯粉混合，体积质量比为1:0.25ml/g；
步骤4：将步骤3制得的混合物真空冷冻干燥24h，制成冻干粉，即为海洋合生元添加剂。
二，试验用刺参饲料的制备
步骤1：刺参基础饲料的选择，此处提供一种饲料配方(具体配方应视情况选择)：称量海带粉2kg，鼠尾藻粉2kg，豆粕粉1kg，鱼粉1kg，海泥3kg，贝壳粉0.75kg，复合维生素和矿物质0.25kg；
其中，所述复合维生素和矿物质与现有技术的基础饲料所需添加成份和数量的要求相同。在此提供一种优选方式，所述复合维生素和矿物质成分为(mg/g)：维生素B1 0.5,维生素B2 1.0,烟酸0.75,维生素B6 1.5,维生素B12 0.05,泛酸钙10,维生素C 50,氯化胆碱200,维生素K 2,维生素A 0.6，维生素E 10，α纤维素723.6；MgSO4-7H2O 100,ZnSO4-7H2O 3,CoCl2-6H2O 1,MnSO4-H2O 1,Al Cl3-6H2O 0.2,FeSO4-7H2O 30,CuCl2-2H2O 63，碳酸钙801.8。
步骤2：饲料原料预处理，干燥至含水量不高于15％，粗粉碎至100～200目；
步骤3：每天投喂饲料之前，将本发明合生元制剂按照基础饲料重量5％的添加量进行充分拌料混合，其中海洋合生元添加剂中益生菌的含量>109CFU/g，在基础饲料中有效含量>108CFU/g，然后对刺参进行饲喂。
三，刺参的饲养与管理
选择大小相似的健康刺参作为实验对象，平均体重10g左右。考察上述发明合生元制剂对对刺参生长及免疫的促进效果。实验开始前进行适应性暂养，所有养殖箱24h曝气，采用流水系统，避光，每天更换30％的养殖水体，每周吸低排污一次，整个实验过程中，溶氧≥6mg/l，水温保持于16-18℃，pH7.9-8.1，盐度为30-32ppt。每天固定时间分别投喂基础饲料及加入本发明合生元制剂的饲料，投喂量为刺参体质量的5％，试验进行60天。
四，刺参样品采集与数据分析
1.生长性能测定
存活率：N2/N1×100
特定生长率：100(lnW 2-lnW1)T-1
日增重：(W2-W1)T-1
其中N2和N1分别为每个平行刺参终末头数和初始头数，W2和W1分别为每个平行刺参终末体重和初始体重，T为试验天数。
2.免疫指标的测定
刺参体腔细胞吞噬率测定
经结晶紫染色及甲醛灭活后浓度为109cfu mL-1的金黄色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus Rosenbach)与一定体积的刺参体腔细胞悬液一起加入到一块48孔板中，反复吸打，使细胞及菌液充分混合。调整细胞悬液体积及菌液体积使细胞密度：细菌密度＝1:50。18℃下避光反应1h，每隔20min吸打一次。然后取40μL混合液轻轻滴于载玻片上，涂片，待干。加5％甲醛(溶于生理盐水)，固定吸附在玻片上的吞噬细胞3min，用蒸馏水冲洗，置倒置显微镜下观察。计数100个吞噬细胞，吞噬率的计算公式为：
细胞吞噬率(％)＝总共发生吞噬作用的吞噬细胞数目/细胞总数×100
免疫相关酶活的测定
超氧化物歧化酶、溶菌酶及一氧化氮合酶活均采用试剂盒(购买自南京建成生物工程研究所)测定。
3.抗病力测定
在60d养殖实验结束后,每个平行组随机抽取10只刺参，每只刺参体腔注射100μL浓度为1×109cfu mL-1刺参致病菌—灿烂弧菌的菌悬液，连续注射3天，期间不进行饲料投喂，观察两周后，统计刺参累计发病率(累积发病率＝发病刺参个数/刺参总数)。
本发明合生元对刺参生长性能及非特异免疫力的影响如表1及表2所示：
表1.饲喂本发明合生元对刺参生长性能的影响(n＝30)
表2.饲喂本发明合生元对刺参免疫力及抗病力的影响
试验结果表明：在刺参基础饲料中额外添加本发明合生元，可以显著提高刺参特定生长率等生长性能，有效增强刺参体腔细胞吞噬率、超氧化物歧化酶、溶菌酶及一氧化氮合酶活性，并能够显著降低刺参在灿烂弧菌胁迫下的累计发病率。因此，在刺参基础饲料中适量添加本发明合生元能够显著促进刺参生长性能与非特异免疫力及抗病力，可以作为刺参新型绿色饲料添加剂使用。
本发明采用合生元的模式制得饲料添加剂，合生元是益生菌与益生元科学配伍制成的生物制剂，其本质不是两种产品的简单叠加，而是一个质的变化。通过高效配伍特定的益生菌和益生元，有针对性地促进外源性益生菌在动物肠道中定植和生长，并选择性刺激内源有益菌群的增殖，调节免疫系统，提高机体对病原微生物的防御能力，改善动物肠道微生态群系平衡，起到益生菌和益生元的双重作用，达到“1+1>2”的效果，从而更好地促进动物的生长和健康。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。