技术领域：
本发明属于微生物发酵应用领域，涉及一种凝结芽孢杆菌混合纳豆芽孢杆菌液体、固态发酵豆类食品及其制备方法。
背景技术：
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近几十年来，我国科学科技发展迅速，社会风貌和人民的生活水平都大幅提高，人们对均衡全面的摄入营养有了越来越清晰的认识，对食物的需求早已远远超出满足生存和味蕾的范畴，保健养生的概念深入人心，且渐渐成为了一种潮流和习惯。豆类制品作为一种历史悠久的高蛋白食物，其中所含有的植物性蛋白相比于肉类奶类中的动物性蛋白更适合于中国人的肠道，利于吸收，温和养胃且营养全面。但是国内现有的豆制食品看似种类繁多，其实类型单一，大致可以概括为豆浆制品、各类豆干类制品和油炸制品，加工粗糙、营养利用率低且部分食品还存在安全卫生风险。
益生菌是一类对宿主有益的活性微生物，将益生菌应用在食品生产中，其在营养价值、口感风味和保健作用等方面的优势日益显著。利用益生菌生产的各类功能性产品已成为当今研究的热点，广为人民喜爱和接受。
凝结芽孢杆菌是乳酸菌的一种，兼性厌氧。除了具有乳酸菌的所有特点外，还具有抗逆性强、耐高温、易储存等生物学特性。凝结芽孢杆菌在食品中的利用其实有着悠久的历史，早在1972年，日本厚生省(mhlw)就证实b.coagulans可用于处方笺，同时凝结芽孢杆菌也被美国药品食品管理局(fda)认定为安全有效的可食用益生菌，是目前效果最为确切的一类益生菌。中国国家卫生计生委发布2016年第6号《关于发酵乳杆菌cect5716等3个菌种的公告》中写明：将凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)列入《可用于食品的菌种名单》。该菌种口服进入消化系统后，会消耗游离氧进行肠道繁殖，从而有利于厌氧微生物乳酸菌和双歧杆菌的生长，调节肠道内微生物菌群的平衡，提高机体的免疫力和抗病力，减少肠道疾病的发生。同时该菌在肠道繁殖的过程中还会分泌淀粉酶和蛋白酶，促进机体对营养物质的消化和吸收；其产生的b族维生素、氨基酸、短链脂肪酸等物质能增加小肠的蠕动速度，从而改善肠道的消化功能，其大量产生的抑制有害菌的凝固素(coagulin)和l-乳酸等抑菌物质可以有效抑制多种肠道有害菌的繁殖，调节肠道酸碱平衡，对胃肠道炎症有一定的治疗作用。
纳豆芽孢杆菌属于芽孢杆菌属枯草芽孢杆菌，适宜在中性或偏酸性环境中生存，其在胃酸下4h存活率为100％，同时具有强力的病原菌抑制能力，是各类益菌中对环境耐受力最好的菌种之一。利用纳豆芽孢杆菌制作的食品，可抵抗胃酸等物质的杀灭作用，进入小肠，改变人体肠道菌丛生态，调节肠道菌群，帮助消化道机能正常化，同时增强细胞免疫反应。纳豆芽孢杆菌次生代谢产物中含有多种抑菌物质，比如杆菌肽、多粘菌素等，对食品中常见的污染菌和致病菌具有很强的抑菌效果。
利用纳豆芽孢杆菌单菌发酵的纳豆已经成为现代人成熟的保健食品，但是由于纳豆芽孢杆菌发酵期间产生的臭氨味，纳豆在中国市场的推广存在着极大的阻力。而凝结芽孢杆菌在发酵过程中恰好可以利用氨类物质，利用凝结芽孢菌和纳豆芽孢杆菌混合发酵工艺一方面保留了原料豆类中的一些活性成分，如多糖、膳食纤维、生物类黄酮等对机体有保健作用的物质，同时产生特色风味物质，很好地祛除了纳豆的特殊氨味和豆类食品存在的豆腥味，在保留产品原有营养成分的基础上改善产品的口味，使其口感更好、更易被人体吸收，促进消化、调理肠道。同时混菌发酵由于两种菌种的相互促进作用，可以使最终产物获得更高的益生菌数量与菌体活性，其产生的有益物质也高于单菌发酵的食品，而且混菌发酵具有不易染杂菌、稳定性高的特征，使得发酵生产在工艺控制上更简便易行。
技术实现要素：
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本发明属于功能性食品领域，目的在于利用凝结芽孢杆菌混合纳豆芽孢杆菌对豆类进行发酵获得一种益生菌功能性食品。
为了实现上述目的，本发明提供一种凝结芽孢杆菌混合纳豆芽孢杆菌发酵豆类液态饮料，是以大豆和黑豆中的至少一种，或大豆和黑豆中的至少一种混合其他豆类作为发酵基质，采用凝结芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌进行液态发酵后获得活菌型益生菌发酵豆类液体饮料；
进一步地，经加热灭活处理即得到的芽孢型益生菌发酵豆类液体饮料；
进一步地，所述液态饮料制备方法如下：
菌种活化：凝结芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌从甘油管出发，按接种量1％分别接入活化培养基进行活化，活化培养基装液量为20％，ph自然，培养温度为36-38℃，220r/min，培养19-20h后，按10％的接种量再次转接入活化培养基进行二次活化，活化时间20-22h后得二级种子液；
液态发酵培养：将纳豆芽孢杆菌二级种子液接入液态发酵培养基中进行通气有氧发酵，通气量1：0.3(以每分钟内通过单位体积培养液的空气体积比来表示(v/v·min))，36-38℃下发酵12-24h后，向发酵罐中接种凝结芽孢杆菌二级种子液，36-38℃下不通气发酵12-24h；
发酵液处理：发酵结束后即获得活菌型益生菌混菌发酵豆类液体饮料；增加加热灭活的过程后，获得的即为芽孢型益生菌发酵豆类液态饮料；
所述活化培养基为：将黄豆、黑豆单独或任意比例混合清洗后，每100ml水中添加5g上述豆子打浆均质，均质温度65℃、压力20.0mpa，均质一次；121℃，20min进行灭菌；
所述液态发酵培养基为：按活化培养基中黄豆与黑豆的比例进行混合，并加入总豆质量0-60％的其他豆类清洗后，每100ml水中添加5g上述豆子打浆均质，均质温度65℃、压力20.0mpa，均质一次；121℃，20min进行灭菌；
所述液态发酵中，凝结芽孢杆菌的接种量为106-108cfu/ml；
所述液态发酵中，纳豆芽孢菌的接种量为106-108cfu/ml；
优选的，所述液态发酵中凝结芽孢杆菌的接种量为1×107cfu/ml；
优选的，所述液态发酵中纳豆芽孢杆菌的接种量为1×107cfu/ml；
优选的，所述液态发酵的培养温度为37℃；
优选的，所述液态混菌发酵时间为纳豆芽孢杆菌发酵19h，凝结芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌混合发酵24；
优选的，加热灭活条件为90℃、10min。
为了实现上述目的，本发明还提供一种凝结芽孢杆菌混合纳豆芽孢杆菌发酵豆类固体食品，是以大豆和黑豆中的至少一种，或大豆和黑豆中的至少一种混合其他豆类作为发酵基质，采用凝结芽孢杆菌混合纳豆芽孢杆菌进行固态发酵后，干燥处理即得到益生菌发酵豆类固体食品；
制备步骤如下：
菌种活化：凝结芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌从甘油管出发，按接种量1％分别接入活化培养基进行活化，活化培养基装液量为20％，220r/min，ph自然，培养温度为36-38℃，培养时间19-20h，作为种子液；
固态发酵培养：将纳豆芽孢杆菌种子液接入固态发酵培养基中，用8层纱布封口，培养箱鼓风，风速0.3m/s，进行有氧静置发酵，36-38℃下固态发酵12-24h后，接种凝结芽孢杆菌种子液，36-38℃下无氧静置固态发酵12-24h即得益生菌发酵豆类固态食品；
发酵结束后可直接包装食用，也可真空冷冻干燥，制成口感更佳的保健食品；
所述活化培养基为：将黄豆和黑豆中的至少一种清洗后，每100ml水中添加5g上述豆子打浆均质，均质温度65℃、压力20.0mpa，均质一次，121℃，20min进行灭菌；
所述固态发酵培养基为：按活化培养基中黄豆与黑豆的比例进行混合，并加入总豆质量0-60％的其他豆类清洗后,按料水比1：1-1.5(质量体积比)进行混合，4℃下浸泡8-10h制得，121℃灭菌20min；
所述固态发酵中，凝结芽孢杆菌的接种量为106-108cfu/g；
所述固态发酵中，纳豆芽孢杆菌的接种量为106-108cfu/g；
优选的，所述固态发酵中凝结芽孢杆菌的接种量为5×107cfu/g；
优选的，所述固态发酵中纳豆芽孢杆菌的接种量为5×107cfu/g；
优选的，所述固态发酵的培养温度为37℃；
优选的，所述固态混菌发酵时间为纳豆芽孢杆菌发酵24h，凝结芽孢杆菌与纳豆芽孢杆菌混合发酵24h；
优选的，所述固态发酵真空冷冻干燥条件为-70℃预冻6h后进行真空冷冻干燥24h，至含水量不大于5％。
有益效果：
1、本发明采用豆类作为原料生产凝结芽孢杆菌混合纳豆芽孢杆菌发酵的益生菌食品。经过益生菌发酵的豆类产品可以产生多种酸类小分子物质如l-乳酸，同时分解豆类中不易消化的成分，这赋予产品特有的酸香味、色泽和口感，使得食品的感官特征得到改善，凝结芽孢杆菌可以祛除纳豆臭氨味和豆腥味。同时，多种酸类小分子物质、呈香呈味物质的存在赋予了发酵食品良好的口感，乳酸等同时也是优质的防腐剂，所以发酵得到的原味型固体食品和液体饮料都无需再添加各类调味剂和防腐剂成分。
2、经益生菌凝结芽孢杆菌发酵后的豆类食品中活性成分含量显著提高，总黄酮和总酚类物质含量显著提高，如大豆苷元、染料木素、生育酚、皂甙等，这些物质具有抗氧化、抗炎、抗癌等生物活性，有抑制不饱和脂肪酸的能力，可以防止异丙基苯过氧化物导致的人体内皮细胞的细胞损伤，可以强化血管壁、促进肠胃消化、降低血脂、增加身体抵抗力，防止动脉硬化和血栓的形成，预防心血管疾病、改善骨质疏松及预防癌症；同时对肥胖症也有相当的有益作用；纳豆菌产生的碱性蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂酶、弹性蛋白酶、植酸酶等多种酶系、发酵大豆中的低聚糖和纤维素等活性物质和凝结素可以帮助改善肠道微生态环境、促进肠道消化吸收功能，具有调整肠道功能帮助消化的强大功效；纳豆芽孢杆菌发酵产生的纳豆激酶具有溶栓作用，同时还可以促进维生素k2的吸收，大大提高人体对钙离子的吸收，维持骨吸收和骨形成的平衡作用，防止骨质疏松，具有多种保健功效，经常食用可以很大程度上改善人体健康，预防疾病。
3、采用混菌发酵的豆类食品不仅口感和营养成分优于单菌发酵，凝结芽孢杆菌在繁殖过程中可以利用氨作为氮源，消耗掉了传统纳豆生产过程中产生的氨气，使得产品没有了传统纳豆的臭氨味和豆类食品的豆腥味，氨气释放量低于10mg/kg；同时其活菌数也高于单菌发酵的产品。经过纳豆芽孢杆菌发酵之后，培养基中氧气含量降低，极大地提高了凝结芽孢杆菌的芽孢产量，使得活菌型食品拥有了更好的稳定性，更多活的益生菌进入人体肠道。经过加热灭活处理的发酵食品中，没有了菌体形态的活菌，使得产品具有更长的保质期限，同时保留的益生菌芽孢在进入人体肠道后会重新萌发为有益健康的肠道益生菌，帮助改善肠道环境，助力机体健康。
具体实施方式：
下面结合具体实施方式对本发明作进一步的描述，但本发明并不限于以下具体实施例子。
实施例1一种凝结芽孢杆菌混合纳豆芽孢杆菌液态发酵豆类饮料
(1)最佳接种量的确定
所选用纳豆芽孢杆菌，即枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)tk-1，保藏编号为cgmccno.4731。
所选用凝结芽孢杆菌为凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)tq33，保藏编号为cgmccno.5233。
选定豆类组合6组：
组合1：100％黄豆；组合2：100％黑豆；组合3：50％黄豆+50％黑豆；组合4：40％黄豆+混合豆类60％，其中混合豆类为绿豆、红豆、白芸豆、花芸豆、鹰嘴豆和小扁豆等量混合；组合5：40％黑豆+混合豆类60％，其中混合豆类为绿豆、红豆、白芸豆、花芸豆、鹰嘴豆和小扁豆等量混合；组合6：20％黄豆+20％黑豆+混合豆类60％，其中混合豆类为红豆、绿豆、白芸豆、花芸豆、鹰嘴豆和小扁豆等量混合；
活化培养基为：按上述各豆类组合中的黄豆、黑豆比例取黄豆和黑豆混合清洗，即组合1为100％黄豆；组合2为100％黑豆；组合3为50％黄豆+50％黑豆；组合4为100％黄豆；组合5为100％黑豆；组合6为50％黄豆+50％黑豆；每100ml水中添加5g豆子打浆均质，均质温度65℃、压力20.0mpa，均质一次，121℃，20min进行灭菌。
发酵培养基为：将选中的组合豆类清洗后，每100ml水中添加5g豆子打浆均质，均质温度65℃、压力20.0mpa，均质一次，121℃，20min进行灭菌。
凝结芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌从甘油管出发，按接种量1％分别接入活化培养基进行活化，活化培养基三角瓶装液量为20％，摇床220r/min，ph自然，培养温度为37℃，培养时间19h，按10％的接种量再次转接入活化培养基，同样条件进行二次活化，活化时间20h后得二级种子液；
将纳豆芽孢杆菌二级种子液接入液态发酵培养基中进行通气有氧发酵，通气量1：0.3(以每分钟内通过单位体积培养液的空气体积比来表示(v/v·min))，37℃下发酵19h后，接入凝结芽孢杆菌二级种子液，37℃下无氧发酵24h。发酵结束后，即获得活菌型凝结芽孢杆菌发酵豆类液体饮料。
接菌量分别为：
1.凝结芽孢杆菌5×106cfu/ml，纳豆芽孢杆菌5×106cfu/ml；
2.凝结芽孢杆菌1×107cfu/ml，纳豆芽孢杆菌1×107cfu/ml；
3.凝结芽孢杆菌5×107cfu/ml，纳豆芽孢杆菌5×107cfu/ml；
4.凝结芽孢杆菌1×108cfu/ml，纳豆芽孢杆菌1×108cfu/ml；
发酵结束后对所得益生菌食品中的益生菌总活菌数进行检测。
表1豆类发酵饮料中凝结芽孢杆菌活菌及芽孢数
表2豆类发酵饮料中纳豆芽孢杆菌活菌数
结果如表1、表2所示，豆类液体发酵饮料中，几种不同组合进行发酵，菌体接种量为凝结芽孢杆菌1×107cfu/g，纳豆芽孢杆菌1×107cfu/g时，两种益生菌的活菌数达到最高，此时组合2活菌数达到了凝结芽孢杆菌活菌1.43×109cfu/g，芽孢1.24×109cfu/g，纳豆芽孢杆菌活菌1.45×109cfu/g，芽孢1.17×109cfu/g。
(2)最佳发酵培养时间
所选用纳豆芽孢杆菌，即枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)tk-1，保藏编号为cgmccno.4731。
所选用凝结芽孢杆菌为凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)tq33，保藏编号为cgmccno.5233。
活化培养基为：取黄豆清洗后，每100ml水中添加5g豆子打浆均质，均质温度65℃、压力20.0mpa，均质一次，121℃，20min进行灭菌。
发酵培养基为：将黄豆清洗后，每100ml水中添加5g豆子打浆均质，均质温度65℃、压力20.0mpa，均质一次，121℃，20min进行灭菌。
凝结芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌从甘油管出发，按接种量1％分别接入活化培养基进行活化，活化培养基三角瓶装液量为20％，摇床220r/min，ph自然，培养温度为37℃，培养时间19h，按10％的接种量再次转接入活化培养基,同等条件进行二次活化，活化时间20h后得二级种子液；
将纳豆芽孢杆菌二级种子液接入液态发酵培养基中进行通气有氧发酵，通气量1∶0.3(以每分钟内通过单位体积培养液的空气体积比来表示(v/v·min))37℃下发酵后,接种凝结芽孢杆菌二级种子液，37℃下无氧发酵。发酵时间为1.纳豆芽孢杆菌16h，接入凝结芽孢杆菌后混菌发酵20h；
2.纳豆芽孢杆菌19h，接入凝结芽孢杆菌后混菌发酵20h；
3.纳豆芽孢杆菌16h，接入凝结芽孢杆菌后混菌发酵24h；
4.纳豆芽孢杆菌19h，接入凝结芽孢杆菌后混菌发酵24h。
发酵结束后，即获得活菌型凝结芽孢杆菌混合纳豆芽孢杆菌发酵豆类液体饮料。
表3液态发酵豆类饮料中凝结芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌的活菌数
结果为：凝结芽孢杆菌发酵豆类食品最佳培养时间为纳豆芽孢杆菌19h，接入凝结芽孢杆菌后混菌发酵24h，测得凝结芽孢杆菌总活菌数为1.50×109cfu/g，纳豆芽孢杆菌活菌数为7.93×108cfu/g。
(3)液体发酵前后活性成分变化
所选用纳豆芽孢杆菌，即枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)tk-1，保藏编号为cgmccno.4731。
所选用凝结芽孢杆菌为凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)tq33，保藏编号为cgmccno.5233。
选定豆类组合6组：组合1：100％黄豆；组合2：100％黑豆；组合3：50％黄豆+50％黑豆；组合4：40％黄豆+混合豆类60％，其中混合豆类为绿豆、红豆、白芸豆、花芸豆、鹰嘴豆和小扁豆等量混合；组合5：40％黑豆+混合豆类60％，其中混合豆类为绿豆、红豆、白芸豆、花芸豆、鹰嘴豆和小扁豆等量混合；组合6：20％黄豆+20％黑豆+混合豆类60％，其中混合豆类为红豆、绿豆、白芸豆、花芸豆、鹰嘴豆和小扁豆等量混合。
活化培养基为：按照上述豆类组合中黄豆和黑豆的比例取黄豆和黑豆混合清洗后，每100ml水中添加5g豆子打浆均质，均质温度65℃、压力20.0mpa，均质一次，121℃，20min进行灭菌。
发酵培养基为：按上述豆类组合选中豆类清洗后，每100ml水中添加5g豆子打浆均质，均质温度65℃、压力20.0mpa，均质一次，121℃，20min进行灭菌。
凝结芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌从甘油管出发，按接种量1％分别接入活化培养基进行活化，活化培养基三角瓶装液量为20％，摇床220r/min，ph自然，培养温度为37℃，培养时间19h，按10％的接种量再次转接入活化培养基进行二次活化，活化时间20h后得二级种子液；
按1×107cfu/ml，将纳豆芽孢杆菌二级种子液接入液态发酵培养基中进行通气有氧发酵，通气量1∶0.3(以每分钟内通过单位体积培养液的空气体积比来表示(v/v·min))37℃下发酵19h后，按1×107cfu/ml接种凝结芽孢杆菌二级种子液，37℃下无氧发酵24h。
发酵结束后，即获得活菌型凝结芽孢杆菌混合纳豆芽孢杆菌发酵豆类液体饮料。
部分产品90℃灭菌10min得灭菌型产品；
利用gb/t23788-2009法测定大豆异黄酮含量；利用gb/t12143.2-89法测定氨基态氮的含量；利用高效气相法测定乳酸含量；利用福林酚反应测定总酚类含量；利用活氧指数法(orac)测定抗氧化物含量；利用纤维蛋白平板法测定纳豆激酶的活性。
表4液态发酵食品中活性物质的测定
从图表中可以看出，发酵产物中活性物质如大豆苷元、染料木素、抗氧化物质、总酚类和氨基态氮等物质的含量显著增加，这些物质具有抗氧化、抗炎、抗癌等生物活性，可以强化血管壁、促进肠胃消化、降低血脂、增加身体抵抗力，并可防止动脉硬化和血栓的形成，极大地有利于机体的健康。
(4)液体混菌发酵饮料氨气释放量与传统发酵纳豆氨气释放量的对比
所选用纳豆芽孢杆菌，即枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)tk-1，保藏编号为cgmccno.4731。
所选用凝结芽孢杆菌为凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)tq33，保藏编号为cgmccno.5233。
选定豆类组合6组：组合1：100％黄豆；组合2：100％黑豆；组合3：50％黄豆+50％黑豆；组合4：40％黄豆+混合豆类60％，其中混合豆类为绿豆、红豆、白芸豆、花芸豆、鹰嘴豆和小扁豆等量混合；组合5：40％黑豆+混合豆类60％，其中混合豆类为绿豆、红豆、白芸豆、花芸豆、鹰嘴豆和小扁豆等量混合；组合6：20％黄豆+20％黑豆+混合豆类60％，其中混合豆类为红豆、绿豆、白芸豆、花芸豆、鹰嘴豆和小扁豆等量混合。
活化培养基为：按照上述豆类组合中的比例取黄豆和黑豆混合清洗后，每100ml水中添加5g豆子打浆均质，均质温度65℃、压力20.0mpa，均质一次，121℃，20min进行灭菌。
发酵培养基为：将选中豆类清洗后，每100ml水中添加5g等量混合后的豆子打浆均质，均质温度65℃、压力20.0mpa，121℃，20min进行灭菌。
凝结芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌从甘油管出发，按接种量1％分别接入活化培养基进行活化，活化培养基三角瓶装液量为20％，摇床220r/min，ph自然，培养温度为37℃，培养时间19h，按10％的接种量再次转接入活化培养基进行二次活化，活化时间20h后得二级种子液；
按1×107cfu/ml，将纳豆芽孢杆菌二级种子液接入液态发酵培养基中进行通气有氧发酵，通气量1：0.3(以每分钟内通过单位体积培养液的空气体积比来表示(v/v·min)，37℃下发酵19h后，按1×107cfu/ml接种凝结芽孢杆菌二级种子，37℃下无氧发酵24h。发酵结束后，即获得活菌型凝结芽孢杆菌混合纳豆芽孢杆菌发酵豆类液体饮料。
采用上述相同的发酵方法方法，将纳豆芽孢杆菌从甘油管出发，按接种量1％分别接入活化培养基进行活化，活化培养基三角瓶装液量为20％，摇床220r/min，ph自然，培养温度为37℃，培养时间19h，按10％的接种量再次转接入活化培养基进行二次活化，活化时间20h后得二级种子液；
按1×107cfu/ml，将二级纳豆芽孢杆菌种子液接入液态发酵培养基中进行通气有氧发酵，通气量1：0.3(以每分钟内通过单位体积培养液的空气体积比来表示(v/v·min),37℃下发酵19h后，继续无氧发酵24h。发酵结束后，即获得单菌发酵液体状态纳豆饮品，与混菌发酵进行对照。
利用挥发性盐基氮的方法测定混菌发酵豆类饮料与单菌发酵纳豆饮品中的氨，即臭氨味来源，进行对比。
表5液体混菌发酵饮料氨气释放量与传统发酵纳豆氨气释放量的对比
综上可以看出，经凝结芽孢杆菌混合纳豆芽孢杆菌发酵后的豆类液体饮料，菌体接种量为凝结芽孢杆菌1×107cfu/g，纳豆芽孢杆菌1×107cfu/g时，活菌数达到最高，凝结芽孢杆菌活菌1.43×109cfu/g，芽孢1.24×109cfu/g，纳豆芽孢杆菌活菌1.45×109cfu/g，芽孢1.17×109cfu/g；且发酵产物中活性物质如大豆苷元、染料木素、抗氧化物质、总酚类、纳豆激酶和氨基态氮等物质的含量显著增加，这些物质具有抗氧化、抗炎、抗癌等生物活性，可以强化血管壁、促进肠胃消化、降低血脂、增加身体抵抗力，并可防止动脉硬化和血栓的形成。活菌型饮料还具有调节肠道菌群，优化肠道微生态的功效，而灭菌型的饮料具有保质期更长，储存稳定性更好的特点；同时混菌发酵液态饮料几乎不含有构成臭氨味的氨气，口感舒适，利于市场的推广。
实施例2一种凝结芽孢杆菌混合纳豆芽孢杆菌液态发酵豆类食品
所选用纳豆芽孢杆菌，即枯草芽孢杆菌枯草为枯草芽孢杆菌亚种(bacillussubtilissubsp.subtilis)，cgmcc菌种编号为1.2163。
所选用凝结芽孢杆菌为凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)，cgmcc菌种编号为1.2407。
活化培养基为：取黄豆和黑豆等质量混合清洗后，每100ml水中添加5g豆子打浆均质，均质温度65℃、压力20.0mpa，均质一次，121℃，20min进行灭菌。
发酵培养基为：按黄豆30％，黑豆30％，其他豆类40％的比例取豆清洗后，每100ml水中添加5g豆子打浆均质，均质温度65℃、压力20.0mpa，均质一次；其他豆类为红豆、绿豆、白芸豆、花芸豆、鹰嘴豆和小扁豆等量混合，121℃，20min进行灭菌。
凝结芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌从甘油管出发，按接种量1％分别接入活化培养基进行活化，活化培养基三角瓶装液量为20％，摇床220r/min，ph自然，培养温度为36℃，培养时间20h，按10％的接种量再次转接入活化培养基同等条件进行二次活化，活化时间22h后得二级种子液；
按照1×107cfu/ml，将二级纳豆芽孢杆菌种子液接入液态发酵培养基中通气有氧发酵12h，38℃，通气量1：0.3(以每分钟内通过单位体积培养液的空气体积比来表示(v/v·min))，之后接种凝结芽孢杆菌二级种子液，接种量1×107cfu/ml，36℃下无氧发酵12h；
发酵结束后，即获得活菌型凝结芽孢杆菌混合纳豆芽孢杆菌发酵豆类液体饮料。
测定所得饮料氨气释放量，即臭氨味来源，用同样方法制备纳豆芽孢杆菌单菌发酵液体饮品，并进行对照。
纳豆芽孢杆菌单菌发酵液体饮品方法为：纳豆芽孢杆菌从甘油管出发，按接种量1％分别接入活化培养基进行活化，活化培养基三角瓶装液量为20％，摇床220r/min，ph自然，培养温度为36℃，培养时间20h，按10％的接种量再次转接入活化培养基同等条件进行二次活化，活化时间22h后得二级种子液；
按照1×107cfu/ml，将纳豆芽孢杆菌二级种子液接入液态发酵培养基中通气有氧发酵12h，38℃，通气量1：0.3(以每分钟内通过单位体积培养液的空气体积比来表示(v/v·min))，之后36℃下无氧发酵12h；
利用挥发性盐基氮的方法测定产品中的氨。
表6混菌发酵豆类饮料氨气释放量与传统发酵单菌发酵氨气释放量的对比
实施例3凝结芽孢杆菌混合纳豆芽孢杆菌固态发酵豆类食品工艺
(1)最佳接种量
所选用纳豆芽孢杆菌，即枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)tk-1，保藏编号为cgmccno.4731。
所选用凝结芽孢杆菌为凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)tq33，保藏编号为cgmccno.5233。
选定豆类组合6组：组合1：100％黄豆；组合2：100％黑豆；组合3：50％黄豆+50％黑豆；组合4：40％黄豆+混合豆类60％，其中混合豆类包括绿豆、红豆、白芸豆、花芸豆、鹰嘴豆和小扁豆等量混合；组合5：40％黑豆+混合豆类60％，其中混合豆类包括绿豆、红豆、白芸豆、花芸豆、鹰嘴豆和小扁豆等量混合；组合6：20％黄豆+20％黑豆+混合豆类60％，其中混合豆类包括红豆、绿豆、白芸豆、花芸豆、鹰嘴豆和小扁豆等量混合。
活化培养基为：按上述豆类组合中的比例取黄豆和黑豆混合清洗后，每100ml水中添加5g豆子打浆均质，均质温度65℃、压力20.0mpa，均质一次，20min进行灭菌。
固态发酵培养基为：将选中的豆类组合混合清洗后,按料水比1：1.5(质量体积比)进行混合，4℃下浸泡8h，121℃灭菌20min。
凝结芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌从甘油管出发，按接种量1％分别接入活化培养基进行活化，活化培养基三角瓶装液量为20％，摇床220r/min，ph自然，培养温度为37℃，培养时间19h得种子液；
将纳豆芽孢杆菌种子液接入固态发酵培养基中，用8层纱布封口放置在培养箱中，鼓风进行风速：0.3m/s，有氧发酵，37℃下发酵24h后接种凝结芽孢杆菌种子液，37℃下无氧发酵24h。发酵结束后，即获得活菌型凝结芽孢杆菌混合纳豆芽孢杆菌发酵豆类固态食品。
接菌量分别为：1.凝结芽孢杆菌5×106cfu/g，纳豆芽孢杆菌5×106cfu/g；
2.凝结芽孢杆菌1×107cfu/g，纳豆芽孢杆菌1×107cfu/g；
3.凝结芽孢杆菌5×107cfu/g，纳豆芽孢杆菌5×107cfu/g；
4.凝结芽孢杆菌1×108cfu/g，纳豆芽孢杆菌1×108cfu/g；
发酵后，对所得益生菌固态食品中的益生菌菌总活菌数进行检测。
表7豆类发酵食品中凝结芽孢杆菌总活菌及芽孢数
表8豆类发酵食品中纳豆芽孢杆菌总活菌及芽孢数
结果如表7、8所示，豆类固态发酵食品中，几种不同组合进行发酵，菌体接种量为凝结芽孢杆菌5×107cfu/g，纳豆芽孢杆菌5×107cfu/g时，活菌数达到最高，且虽然各组合活菌数有小幅度差异但都达到了较高的9次方，其中组合1活菌数达到了凝结芽孢杆菌4.37×109cfu/g，纳豆芽孢杆菌4.23×109cfu/g。
(2)固体发酵最佳培养时间
所选用纳豆芽孢杆菌，即枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)tk-1，保藏编号为cgmccno.4731。
所选用凝结芽孢杆菌为凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)tq33，保藏编号为cgmccno.5233。
活化培养基为：取黄豆清洗后，每100ml水中添加5g豆子打浆均质，均质温度65℃、压力20.0mpa，均质一次，20min进行灭菌。
固态培养基为：将黄豆按料水比1：1.5(质量体积比)进行混合，4℃下浸泡8h，121℃灭菌20min。
凝结芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌从甘油管出发，按接种量1％分别接入活化培养基进行活化，活化培养基三角瓶装液量为20％，摇床220r/min，ph自然，培养温度为37℃，培养时间19h得种子液；
按5×107cfu/g，将纳豆芽孢杆菌种子液接入固体发酵培养基中，用8层纱布封口放置在培养箱中，鼓风风速：0.3m/s，进行有氧发酵，37℃下发酵一段时间后，按5×107cfu/g接种凝结芽孢杆菌种子液，37℃下无氧发酵。
发酵结束后，即获得活菌型发酵豆类食品。
发酵时间为1.纳豆芽孢杆菌19h，接凝结芽孢杆菌后混菌发酵20h；
2.纳豆芽孢杆菌24h，接凝结芽孢杆菌后混菌发酵20h；
3.纳豆芽孢杆菌19h，接凝结芽孢杆菌后混菌发酵24h；
4.纳豆芽孢杆菌24h，接凝结芽孢杆菌后混菌发酵24h。
发酵结束后，分别对固态发酵后的产物进行活菌计数。
表9固态发酵豆类食品中凝结芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌的活菌数
结果为：混合益生菌发酵豆类食品最佳培养时间为纳豆芽孢杆菌24h，凝结芽孢杆菌24h，测得凝结芽孢杆菌总活菌数为1.04×1010cfu/g，纳豆芽孢杆菌总活菌数7.98×109cfu/g。
(3)固体发酵前后活性成分变化
所选用纳豆芽孢杆菌，即枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)tk-1，保藏编号为cgmccno.4731。
所选用凝结芽孢杆菌为凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)tq33，保藏编号为cgmccno.5233。
选定豆类组合6组：组合1：100％黄豆；组合2：100％黑豆；组合3：50％黄豆+50％黑豆；组合4：40％黄豆+混合豆类60％，其中混合豆类包括绿豆、红豆、白芸豆、花芸豆、鹰嘴豆和小扁豆等量混合；组合5：40％黑豆+混合豆类60％，其中混合豆类包括绿豆、红豆、白芸豆、花芸豆、鹰嘴豆和小扁豆等量混合；组合6：20％黄豆+20％黑豆+混合豆类60％，其中混合豆类包括红豆、绿豆、白芸豆、花芸豆、鹰嘴豆和小扁豆等量混合。
活化培养基为：按上述豆类组合中黄豆和黑豆的比例混合清洗后，每100ml水中添加5g豆子打浆均质，均质温度65℃、压力20.0mpa，均质一次，20min进行灭菌。
固态培养基为：将选中的豆类组合混合清洗后,按料水比1：1.5(质量体积比)进行混合，4℃下浸泡8h，121℃灭菌20min。
凝结芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌从甘油管出发，按接种量1％分别接入活化培养基进行活化，活化培养基三角瓶装液量为20％，摇床220r/min，ph自然，培养温度为37℃，培养时间19h得种子液；
按5×107cfu/g，将纳豆芽孢杆菌种子液接入固体发酵培养基中，用8层纱布封口放置在培养箱中，鼓风风速：0.3m/s，进行有氧发酵，37℃下发酵24h后，按5×107cfu/g接种凝结芽孢杆菌种子液，37℃下无氧发酵24h。
发酵结束后，即获得活菌型发酵豆类食品。测定固态发酵物中各活性成分含量的变化。
将固态发酵产物-70℃预冻6h后进行真空冷冻干燥24h，至含水量不大于5％得凝结豆类固态发酵食品。
利用gb/t23788-2009法测定大豆异黄酮含量；利用gb/t12143.2-89法测定氨基态氮的含量；利用高效气相法测定乳酸含量；利用福林酚反应测定总酚类含量；利用活氧指数法(orac)测定抗氧化物含量；利用纤维蛋白平板法测定纳豆激酶的活性。
表10固态发酵食品中活性物质的测定
从图表中可以看出，发酵产物中活性物质如大豆苷元、染料木素、抗氧化物质、总酚类、纳豆激酶和氨基态氮等物质的含量显著增加，这些物质具有抗氧化、抗炎、抗癌等生物活性，可以强化血管壁、促进肠胃消化、降低血脂、增加身体抵抗力，并可防止动脉硬化和血栓的形成，极大地有利于机体的健康。
(4)固态混菌发酵豆类食品中氨气释放量与传统发酵纳豆氨气释放量的对比
所选用纳豆芽孢杆菌，即枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)tk-1，保藏编号为cgmccno.4731。
所选用凝结芽孢杆菌为凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)tq33，保藏编号为cgmccno.5233。
选定豆类组合6组：组合1：100％黄豆；组合2：100％黑豆；组合3：50％黄豆+50％黑豆；组合4：40％黄豆+混合豆类60％，其中混合豆类包括绿豆、红豆、白芸豆、花芸豆、鹰嘴豆和小扁豆等量混合；组合5：40％黑豆+混合豆类60％，其中混合豆类包括绿豆、红豆、白芸豆、花芸豆、鹰嘴豆和小扁豆等量混合；组合6：20％黄豆+20％黑豆+混合豆类60％，其中混合豆类包括红豆、绿豆、白芸豆、花芸豆、鹰嘴豆和小扁豆等量混合。
活化培养基为：按上述豆类组合中的比例取黄豆和黑豆混合清洗后，每100ml水中添加5g豆子打浆均质，均质温度65℃、压力20.0mpa，均质一次，20min进行灭菌。
固态培养基为：将选中的豆类组合混合清洗后,按料水比1：1.5(质量体积比)进行混合，4℃下浸泡8h，121℃灭菌20min。
凝结芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌从甘油管出发，按接种量1％分别接入活化培养基进行活化，活化培养基三角瓶装液量为20％，摇床220r/min，ph自然，培养温度为37℃，培养时间19h得种子液；
按5×107cfu/g，将纳豆芽孢杆菌种子液接入固体发酵培养基中进行，用8层纱布封口放置在培养箱中，鼓风风速：0.3m/s，进行有氧发酵，37℃下发酵24h后，按5×107cfu/g接种凝结芽孢杆菌种子液，37℃下无氧发酵24h。
发酵结束后，即获得活菌型发酵豆类食品。将固态发酵产物-70℃预冻6h后进行真空冷冻干燥24h，至含水量不大于5％得凝结豆固态发酵食品。
其他条件均相同，仅将凝结芽孢杆菌混合纳豆芽孢杆菌混菌发酵改为纳豆芽孢杆菌单菌发酵，发酵阶段接菌量为5×107cfu/g，发酵阶段总时长相同，即24h+24h＝48h；
发酵结束后，即获得单菌发酵传统纳豆食品，与混菌发酵产品做对比。
利用挥发性盐基氮的方法测定混菌发酵豆类食品与单菌发酵纳豆中的氨，即臭氨味来源，进行对比。
表11固态发酵豆类食品氨气释放量与传统发酵纳豆氨气释放量的对比
综上可以看出，经凝结芽孢杆菌混合纳豆芽孢杆菌发酵后的豆类固态食品，菌体接种量为凝结芽孢杆菌5×107cfu/g，纳豆芽孢杆菌5×107cfu/g时，活菌数达到最高，达到了凝结芽孢杆菌4.37×109cfu/g，纳豆芽孢杆菌4.23×109cfu/g；且发酵产物中活性物质如大豆苷元、染料木素、抗氧化物质、总酚类和氨基态氮等物质的含量都有所增加，对人体有着极大的益处；混菌发酵的豆类食品与传统纳豆相比，没有了令人不愉快的特殊氨味，使人们更容易接受，利于市场的推广；同时固态食品，不论是真空包装的湿豆还是经干燥加工的干豆食品，都具有加工操作简单、成本低、储藏和运输等特点，有利于降低成本。
实施例4一种凝结芽孢杆菌混合纳豆芽孢杆菌固态发酵豆类食品
所选用纳豆芽孢杆菌，即枯草芽孢杆菌枯草为枯草芽孢杆菌亚种(bacillussubtilissubsp.subtilis)，cgmcc菌种编号为1.2163。
所选用凝结芽孢杆菌为凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)，cgmcc菌种编号为1.2407。
活化培养基为：取等量黄豆和黑豆清洗后，每100ml水中添加5g豆子打浆均质，均质温度65℃、压力20.0mpa，均质一次，121℃，20min进行灭菌。
固态培养基为：按黄豆30％，黑豆30％，其他豆类40％的比例取豆清洗后，将豆子按料水比1：1(质量体积比)进行混合，4℃下浸泡10h，121℃灭菌20min；其中混合豆类包括红豆、绿豆、白芸豆、花芸豆、鹰嘴豆和小扁豆等量混合；
凝结芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌从甘油管出发，按接种量1％分别接入活化培养基进行活化，活化培养基三角瓶装液量为20％，摇床220r/min，ph自然，培养温度为36℃，培养时间20h得种子液；
按5×107cfu/g的接种量，将纳豆芽孢杆菌种子液接入固体发酵培养基中用8层纱布封口放置在培养箱中，鼓风风速：0.3m/s，进行有氧发酵，36℃下发酵12h后，按5×107cfu/g接种凝结芽孢杆菌种子液进行混菌发酵，38℃下无氧发酵12h。发酵结束后，即获得活菌型发酵豆类食品。
其他条件均相同，仅将凝结芽孢杆菌混合纳豆芽孢杆菌混菌发酵改为纳豆芽孢杆菌单菌发酵，发酵阶段接菌量为5×107cfu/g，发酵阶段总时长相同，即12h+12h＝24h；
发酵结束后，即获得单菌发酵传统纳豆食品，测定所得发酵豆类食品氨气释放量，即臭氨味来源，与混菌发酵产品做对比。
利用挥发性盐基氮的方法测定氨。
表13混菌发酵豆类食品氨气释放量与传统单菌发酵纳豆氨气释放量的对比
上述参照实施例对该益生菌发酵豆类食品及其制备方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。