本发明涉及天然药物领域，且特别涉及一种灵芝三萜的提取方法及灵芝保健品。
背景技术：
灵芝(Ganoderma lucidum)是担子菌纲、多孔菌科、灵芝属(Ganoderma)真菌，常用其子实体，是我国传统的名贵中药材和药用真菌。药理研究表明，灵芝具有调节免疫、抗肿瘤、抗衰老、提高机体耐缺氧能力等活性，其主要功效成分为灵芝三萜和灵芝多糖。灵芝三萜是其中一种主要的成分，具有明显的护肝排毒、抗氧化、抗菌抗炎、抗HIV病毒、抗肿瘤、镇痛、抑制血管紧张素转化酶、抑制胆固醇合成、降低血小板聚集、抑制组胺释放和调节免疫等作用，可以广泛应用于医药和保健品中。
由于灵芝三萜存在于灵芝的细胞壁中，灵芝子实体细胞壁成分主要是几丁质，结构复杂、坚硬，且耐酸碱，造成细胞内有效物质的充分吸收受到很大程度上的阻碍。目前，通常采用有机溶剂法提取灵芝三萜，通常需要较长的提取时间并消耗大量的提取溶剂，同时大量有机溶剂的使用会给人体和环境带来不利的影响。另外，由于灵芝子实体结构紧密，活性成分附着在细胞内侧，传统的热水浸提法时间长、耗能高，活性成分提取物得率低。而单纯的使用超声辅助提取或者乙醇回流提取等方法提取的三萜得率也较低；采用超临界CO2萃取所需的设备投入较大、操作难度和生产成本也较高。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种灵芝三萜的提取方法，此提取方法操作简单，易于实现，且灵芝三萜的提取率较高。
本发明的另一目的在于提供一种灵芝保健品，包括由上述提取方法提取而得的灵芝三萜，该灵芝保健品的保健效果好，且原料为天然产物，毒副作用小。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的：
本发明提出一种灵芝三萜的提取方法，其包括以下步骤：粉碎灵芝子实体，与纤维素酶、半纤维素酶和木瓜蛋白酶混合后酶解，得酶解物；向酶解物中加入93-97wt％的乙醇-水溶液并于75-85℃条件下回流提取1-3h，过滤，浓缩滤液得上样物，于D101大孔吸附树脂层析柱中对上样物进行脱盐和洗脱，收集洗脱后的液体，去除有机相，得灵芝三萜。
本发明还提出一种灵芝保健品，包括由上述提取方法提取所得的灵芝三萜。
本发明较佳实施例的灵芝三萜的提取方法和灵芝保健品的有益效果是：通过对灵芝子实体进行粉碎，增加了原料与酶和提取剂之间的接触面积，提高酶解和提取速度。以纤维素酶、半纤维素酶和木瓜蛋白酶共同作为酶解过程中的酶，不仅利于细胞壁输送、破裂，使细胞内的化合物游离出来，还能水解植物中的蛋白，促使细胞释放更多的三萜物质。以乙醇-水溶液为提取剂，既能保证浸出速度快、浸出物的纯度高、杂质少，而且还能降低成本。回流温度和回流时间分别为75-85℃和1-3h，不仅可避免因回流时间过短或温度过低造成的有效物质溶出率低，回流时间过长或温度过高又会使得植物细胞中的油脂、鞣质等杂质过多的溶出，增大分离纯化的难度等缺陷，还可进一步提高三萜物质的提取率并保持三萜物质的活性最佳。过滤后用D101大孔吸附树脂层析柱对上样物进行脱盐和洗脱，该类型层析柱吸附量高、填料颗粒均匀、机械强度好、不易破碎且残留物少，对有机物选择性好，分离、纯化、除杂的效果佳，故可提高灵芝三萜的纯度。该提取方法简单、条件温和、易操作、成本低、耗时短且得率高。含有上述灵芝三萜的灵芝保健品，毒副作用小，保健效果好。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的灵芝三萜及其提取方法进行具体说明。
本发明实施例提供的灵芝三萜的提取方法，以灵芝子实体为原料，提取过程中可先对原料进行前处理，即灵芝子实体粉碎，以增加原料与酶和提取剂之间的接触面积，提高酶解和提取速度。粉碎粒度例如可以为30-50目，该粒度范围内原料中的有效成分溶出率较大。原料优选采自新鲜灵芝的子实体，此条件下的灵芝子实体中的有效成分含量最高，有利于提高后续提取物中有效成分的含量。
作为优选的，在粉碎步骤之前，还可以对灵芝子实体进行除杂、清洗和干燥等工序。其中除杂和清洗可避免其它杂质对提取效果的干扰，干燥可部分破坏原料的细胞膜和细胞壁，利于提取。其中，干燥的温度例如可以选择为20-45℃，优选为37℃。在此优选条件下，原料中的活性成分可最大程度的保留并不被高温破坏。
较佳的，本发明实施例采用酶解法对灵芝子实体进行酶解，即利用活性酶的特异性来水解酶所对应的特定物质。因灵芝三萜存在于灵芝的细胞壁中，灵芝子实体细胞壁成分主要是几丁质，结构复杂及坚硬，且耐酸碱，造成细胞内有效物质的充分吸收受到很大程度上的阻碍。近年来，酶工程技术在中草药活性成分的提取中得到显著应用，选用适当的酶作用于中药材料，可以通过酶反应温和地分解细胞壁及细胞间质中的纤维素、半纤维素、果胶质等成分，破坏细胞壁的致密构造，引起细胞壁及细胞间质结构产生局部疏松、膨胀、崩溃等变化，减小细胞壁及细胞间质等传质屏障对有效成分从胞内向提取介质扩散的传质阻力，从而有利于有效成分的溶出。又因纤维素和半纤维素是细胞壁的主要成分，用纤维素酶和半纤维素酶处理，能使其细胞壁疏松、破裂，有利于细胞内的化合物游离出来。此外，蛋白酶能水解植物中的蛋白，促使细胞释放更多的三萜，故本发明实施例中优选采用复合酶对原料进行酶解，以在固定时间内对多种物质同时进行酶解，提高酶解效率。其中复合酶例如可以包括纤维素酶、半纤维素酶和木瓜蛋白酶，也可以包括菠萝蛋白酶和果胶酶中的至少一种。具体的，例如可以将粉碎后的灵芝子实体与纤维素酶、半纤维素酶和木瓜蛋白酶混合，并于pH为5-6、温度为36-45℃的条件下酶解1-3h。为了提高酶解效率，本发明实施例中优选酶活分别为45000-55000u/g、150000-250000u/g、750000-850000u/g的纤维素酶、半纤维素酶和木瓜蛋白酶。在提高酶解效率的同时为了避免出现酶浪费的现象，优选的，酶解过程中加入的纤维素酶与灵芝子实体的重量比为2-4:100，半纤维素酶与灵芝子实体的重量比为3-5:100，木瓜蛋白酶与灵芝子实体的重量比为2-4:100。此外，因酶解时间过短或酶解温度过低会造成有效物质溶出率低，酶解时间过长或酶解温度过高又会使得植物细胞中的油脂、鞣质等杂质过多的溶出，增大分离纯化的难度，故酶解时间优选为2h，酶解温度优选为37℃。此外，在酶解过程中，还可以对酶解体系进行适当搅拌，以提高有效物质的溶出率。因本发明实施例中所用酶的最适pH在5-6范围内，为了调节酶解体系的pH，还可以向该体系中加入磷酸缓冲液进行调节。
作为优选的，本发明实施例中例如可以采用高温灭酶活方法停止酶解反应，即可以将酶解体系置于85-100℃的水中加热8-15min，较佳的，可以将酶解体系置于90℃的水中加热10min，此条件下，可以使酶解产物的得率最高，避免酶解不充分的情况。
为了避免灵芝子实体中脂肪类物质对提取三萜物质的影响，还可以在酶解前对灵芝子实体进行脱脂处理，即于粉碎后的灵芝子实体中加入乙醚或石油醚进行脱脂，脱脂后再与纤维素酶、半纤维素酶和木瓜蛋白酶混合，较佳的，灵芝子实体与乙醚或石油醚的比例为1g:150-250mL，此比例条件下，乙醚或石油醚对灵芝子实体的脱脂效果最佳。
酶解后，为了进一步提高三萜物质的提取率，例如还可以对酶解所得的酶解物进行乙醇回流提取。具体的，可以向酶解物中加入质量浓度为93-97％的乙醇-水溶液，并于75-85℃条件下回流提取1-3h。其中，有机溶剂选自乙醇-水溶液，既能保证提取速度快、提取物的纯度高、杂质少，而且成本低。优选的，乙醇-水溶液中乙醇的质量浓度为95％，此质量分数下乙醇溶液的极性适中，使得灵芝子实体中的绝大部分有效成分易溶于该溶液中，提取较快且杂质较少。此外，有机溶剂还可以是甲醇-水溶液等。为了使三萜物质的活性最佳，本发明实施例中回流提取的温度优选为80℃。
回流提取后，例如可以对提取物进行过滤以去除残渣，浓缩滤液得到上样物。其中，过滤可以是抽滤，也可以是离心过滤等方式。
进一步的，对上样物进行纯化。优选的，本发明实施例中的上样方法优选为湿法上样，即将上样物溶解于溶剂后再进行上样，以提高纯化效果。具体的，可以按料液比例如1g:1-6mL将上样物分散于水中，得到上样溶液，继而采用色谱法中的柱层析方法对上样溶液进行纯化分离。具体而言，色谱法是利用不同物质在不同相态的选择性分配，以流动相对固定相中的混合物进行洗脱，混合物中不同的物质会以不同的速度沿固定相移动，最终达到分离的效果。作为优选的，本实施例中的层析柱选用大孔吸附树脂层析柱，其吸附的实质为一种物体高度分散或表面分子受作用力不均等而产生的表面吸附现象，这种吸附性能是由于范德华引力或生成氢键的结果。同时由于大孔吸附树脂的多孔结构使其对分子大小不同的物质具有筛选作用。通过上述这种吸附和筛选原理，有机化合物根据吸附力的不同及分子量的大小，在大孔吸附树脂上经一定溶剂洗脱而达到分离、纯化、除杂、浓缩等不同目的。
较佳的，上述的大孔吸附树脂层析柱中的填料优选为D101填料，其实质为苯乙烯型非极性共聚体。该类型的填料吸附量高、颗粒均匀、机械强度好、不易破碎且残留物少，且对有机物选择性好。本实施例中用其可以对上样物起到脱盐的作用。
进一步的，向大孔吸附树脂层析柱中加入洗脱剂，并对上样溶液进行等度洗脱。其中，洗脱剂例如可以选自94-96wt％醇-水溶液，综合考虑成本及分离效果，优选为95wt％的乙醇-水溶液。较佳的，洗脱剂与上样物的比例可以为400-1000mL:1g，洗脱剂的流速可以是0.5-0.8mL/min，此比例和流速下活性成分的分离效果和提取率均最佳。此外，还可以采用香草醛-高氯酸法辅助检测洗脱液中是否含有灵芝三萜。
收集洗脱后的液体，干燥后除去该液体中的有机相等物质，得到灵芝三萜。其中，干燥可以是将洗脱后的液体减压浓缩后进行冷冻干燥。作为优选的，本发明实施例中例如可以将洗脱后的液体于50-53℃的水浴、转速为50-55转/min、以及真空度为0.07-0.09MPa的条件下旋转蒸发，该条件下进行的减压浓缩，有利于在回收溶剂时避免三萜物质的结构受到破坏。用紫外分光光度计对灵芝三萜含量进行测定，以重量百分数计，本发明实施例中该灵芝三萜的重量例如占灵芝子实体重量的1-5％。
上述的灵芝三萜可以用于制备灵芝保健品，用于睡眠保健等功效。据此本发明还涉及一种灵芝保健品，该保健品包括采用上述方法提取而得的灵芝三萜，由于通过上述方法制得的灵芝三萜纯度高，因此该灵芝保健品具有保健效果好，毒副作用小的特点。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
将1g新鲜灵芝子实体粉碎至粒度为30目，以重量比为100:2:3:2与酶活分别为45000u/g、150000u/g和750000u/g的纤维素酶、半纤维素酶和木瓜蛋白酶混合，于pH为5、温度为36℃的条件下酶解3h后，将酶解体系置于85℃的水中加热15min，向酶解物中加入93wt％的乙醇-水溶液，并于75℃条件下回流提取3h。对提取物进行抽滤，浓缩滤液得到上样物。按料液比1g:1mL将上样物分散于水中，得到上样溶液。采用填料为D101的大孔吸附树脂层析柱对上样物进行脱盐，并以400mL:1g的比例向该层析柱中加入94wt％的乙醇-水溶液作为洗脱剂，对上样物进行等度洗脱，洗脱流速为0.5mL/min。收集洗脱后的液体，于50℃的水浴、转速为50转/min、以及真空度为0.07MPa的条件下旋转蒸发后再进行冷冻干燥，得灵芝三萜，称量计重得该灵芝三萜的重量占灵芝子实体重量的1.2％。
实施例2
将1g新鲜灵芝子实体进行除杂、清洗，于20℃下干燥后粉碎至粒度为50目，以1g:150mL的比例向子实体中加入乙醚进行脱脂。以重量比为100:4:5:4将脱脂后的子实体与酶活分别为55000u/g、250000u/g和850000u/g的纤维素酶、半纤维素酶和木瓜蛋白酶混合，于pH为6、温度为45℃的条件下酶解1h后，将酶解体系置于100℃的水中加热8min，向酶解物中加入97wt％的乙醇-水溶液，并于85℃条件下回流提取1h。对提取物进行离心过滤，浓缩滤液得到上样物。按料液比1g:6mL将上样物分散于水中，得到上样溶液。采用填料为D101的大孔吸附树脂层析柱对上样物进行脱盐，并以1000mL:1g的比例向该层析柱中加入96wt％的乙醇-水溶液作为洗脱剂，对上样物进行等度洗脱，洗脱流速为0.8mL/min。收集洗脱后的液体，于53℃的水浴、转速为55转/min、以及真空度为0.09MPa的条件下旋转蒸发后再进行冷冻干燥，得灵芝三萜，称量计重得该灵芝三萜的重量占灵芝子实体重量的1.5％。
实施例3
将1g新鲜灵芝子实体进行除杂、清洗，于45℃下干燥后粉碎至粒度为40目，以1g:250mL的比例向子实体中加入石油醚进行脱脂。以重量比为100:3:4:3将脱脂后的子实体与酶活分别为50000u/g、200000u/g和800000u/g的纤维素酶、半纤维素酶和木瓜蛋白酶混合，于pH为5.5、温度为40.5℃的条件下酶解2h后，将酶解体系置于92.5℃的水中加热11.5min，向酶解物中加入95wt％的乙醇-水溶液，并于80℃条件下回流提取2h。对提取物进行抽滤过滤，浓缩滤液得到上样物。按料液比1g:3.5mL将上样物分散于水中，得到上样溶液。采用填料为D101的大孔吸附树脂层析柱对上样物进行脱盐，并以700mL:1g的比例向该层析柱中加入95wt％的乙醇-水溶液作为洗脱剂，对上样物进行等度洗脱，洗脱流速为0.65mL/min。收集洗脱后的液体，于51.5℃的水浴、转速为53转/min、以及真空度为0.08MPa的条件下旋转蒸发后再进行冷冻干燥，得灵芝三萜，称量计重得该灵芝三萜的重量占灵芝子实体重量的2.0％。
实施例4
将1g新鲜灵芝子实体进行除杂、清洗，于32.5℃下干燥后粉碎至粒度为40目，以1g:200mL的比例向子实体中加入乙醚进行脱脂。以重量比为100:3将脱脂后的子实体与菠萝蛋白酶混合，加入磷酸缓冲液调节混合体系的pH为5.5，将该体系于40.5℃的条件下酶解2h后，将酶解体系置于92.5℃的水中加热11.5min，向酶解物中加入95wt％的甲醇-水溶液，并于80℃条件下回流提取2h。对提取物进行抽滤过滤，浓缩滤液得到上样物。按料液比1g:3.5mL将上样物分散于水中，得到上样溶液。采用填料为D101的大孔吸附树脂层析柱对上样物进行脱盐，并以700mL:1g的比例向该层析柱中加入95wt％的乙醇-水溶液作为洗脱剂，对上样物进行等度洗脱，洗脱流速为0.65mL/min。收集洗脱后的液体，于51.5℃的水浴、转速为53转/min、以及真空度为0.08MPa的条件下旋转蒸发后再进行冷冻干燥，得灵芝三萜，称量计重得该灵芝三萜的重量占灵芝子实体重量的0.8％。
实施例5
将1g新鲜灵芝子实体进行除杂、清洗，于37℃下干燥后粉碎至粒度为40目，以1g:200mL的比例向子实体中加入石油醚进行脱脂。以重量比为100:3将脱脂后的子实体与果胶酶混合，加入磷酸缓冲液调节混合体系的pH为5.5，将该体系于37℃的条件下酶解2h后，将酶解体系置于90℃的水中加热10min，向酶解物中加入95wt％的乙醇-水溶液，并于80℃条件下回流提取2h。对提取物进行离心过滤，浓缩滤液得到上样物。按料液比1g:4mL将上样物分散于水中，得到上样溶液。采用填料为D101的大孔吸附树脂层析柱对上样物进行脱盐，并以800mL:1g的比例向该层析柱中加入95wt％的乙醇-水溶液作为洗脱剂，对上样物进行等度洗脱，洗脱流速为0.65mL/min。收集洗脱后的液体，于52℃的水浴、转速为55转/min、以及真空度为0.09MPa的条件下旋转蒸发后再进行冷冻干燥，得灵芝三萜，称量计重得该灵芝三萜的重量占灵芝子实体重量的0.9％。
实施例6
将1g新鲜灵芝子实体进行除杂、清洗，于37℃下干燥后粉碎至粒度为40目，以1g:200mL的比例向子实体中加入乙醚进行脱脂。以重量比为100:3:4:3:1:1将脱脂后的子实体与酶活分别为50000u/g、200000u/g和800000u/g的纤维素酶、半纤维素酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶和果胶酶混合，加入磷酸缓冲液调节混合体系的pH为5.5，将该体系于37℃的条件下酶解2h后，将酶解体系置于90℃的水中加热10min，向酶解物中加入95wt％的乙醇-水溶液，并于80℃条件下回流提取2h。对提取物进行离心过滤，浓缩滤液得到上样物。按料液比1g:4mL将上样物分散于水中，得到上样溶液。采用填料为D101的大孔吸附树脂层析柱对上样物进行脱盐，并以800mL:1g的比例向该层析柱中加入95wt％的乙醇-水溶液作为洗脱剂，对上样物进行等度洗脱，洗脱流速为0.65mL/min。收集洗脱后的液体，于52℃的水浴、转速为55转/min、以及真空度为0.09MPa的条件下旋转蒸发后再进行冷冻干燥，得灵芝三萜，称量计重得该灵芝三萜的重量占灵芝子实体重量的2.5％。
重复实施上述实施例1-6，提取足够多的灵芝三萜，并以按上述各实施例提取所得的灵芝三萜分别作为试验组1-6，以普通提取方法中的有机溶剂法提取和超声法提取所得的灵芝三萜作为对照组1和对照组2，分别对1g灵芝子实体所提取出的灵芝三萜占灵芝子实体的质量分数和纯度进行对比，其结果如表1所示：
表1灵芝三萜的质量分数和纯度
由表1可以看出，以同一重量的灵芝子实体作为原料，通过本发明实施例的提取方法所提取出的灵芝三萜的含量比普通提取方法所提取出的灵芝三萜的含量要高。其原因在于本发明实施例中通过结合酶解法和乙醇回流对原料中的活性物质进行酶解和提取，并在酶解过程中同时采用纤维素酶、半纤维素酶和木瓜蛋白酶进行混合酶解，提高了酶解效果和提取率。此外，通过采用大孔吸附树脂对提取物进行脱盐和洗脱，进一步对提取物进行了分离和纯化，提高了提取所得的灵芝三萜的纯度。对比实施例1-6所提取而得的灵芝三萜，可以看出，实施例4和实施例5中灵芝三萜的得率低于其余4组实施例中灵芝三萜的得率，其原因在于实施例4和实施例5的酶解过程只采用了菠萝蛋白酶和果胶酶中的单一酶进行酶解，而其余4组实施例中均采用的是复合酶进行酶解，提高了酶解效果；实施例6所提取出的灵芝三萜得率和纯度均最高，其原因在于，该实施例中，酶解过程中将纤维素酶、半纤维素酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶和果胶酶共同作用，充分酶解了灵芝子实体中的三萜物质，此外，该实施例中复合酶的酶活较高，且各物质的加入量适中、配比的当，酶解、提取和纯化等过程中各参数也为最优值，故该实施例所备出的灵芝三萜的得率和纯度均最高。
将上述各实施例1-6获得的灵芝三萜分别制成灵芝保健品，将分别包括由实施例1-6所制备出的灵芝三萜的灵芝保健品作为试验组1-6，以市售的灵芝保健品做对照组，在含有等量灵芝三萜的条件下，随机调研100人，18-25岁年龄段的30％，26-40岁年龄段的40％，41-60岁年龄段的20％，61-80岁年龄段的10％为受试者，受试者分别口服试验组和对照组中的灵芝保健品，对比口服2h后，受试者的睡眠发生率，其结果如表2所示：
表2灵芝保健品对不同年龄段人群的睡眠发生率
由表2可以看出，试验组的灵芝保健品较对照组的灵芝保健品对不同年龄段人群的睡眠发生率均更高，说明试验组的灵芝保健品起到的促进睡眠的效果更好。其中，实施例6的灵芝保健品促进睡眠效果最为显著，其原因在于该实施例保健品所含的灵芝三萜的纯度最高。
综上所述，本发明实施例的灵芝三萜的提取方法简单、条件温和、易操作、成本低、耗时短且得率高。含有该提取方法提取出的灵芝三萜的灵芝保健品保健效果好，毒副作用小。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。