本发明涉及生物发酵技术领域，尤其是一种利用多菌种混合固体二次发酵工艺生产发酵豆粕的方法及其应用，主要适用于生产优质发酵豆粕。
背景技术：
豆粕是大豆榨油后的副产物,其蛋白质含量高达加40%～50%,并且还有丰富的碳水化合物和矿物质。随着人们对大豆肽功能特性和营养价值的认识的加深,越来越多的专家开始研究发酵法生产大豆肽,近年来有些学者用固态发酵生产蛋白饲料。发酵豆粕发酵菌株的选择历来是一个难题，菌株不同，会对发酵产品质量产生严重的影响。此外不同发酵温度对豆粕转化率也有很大的影响。一般在工农业应用中的绝大多数微生物属于中温性微生物,其最适生长温度为25～35℃。但是生长速度快并不等于发酵速度亦快,更不等于代谢产物积累量大。因此,在实际生产中必须针对要求来确定发酵工艺。
现有技术中也有利用豆粕发酵生产动物饲料的方法，选用的菌种及具体发酵工艺方法各异，所得产品的功效也各有千秋。
技术实现要素：
本发明的目的也是在上述研究的基础上专门研制的一种利用多菌种混合固体二次发酵工艺生产发酵豆粕的方法及其应用，本发明的实质在于解决发酵产物菌种发酵功能单一的缺陷，通过生态发酵将难以消化的蛋白质转化为容易被利用的蛋白质和肽、产生外源消化酶、降解毒素和消除营养抑制因子。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：本发明的利用多菌种混合固体二次发酵工艺生产发酵豆粕的方法包括以下步骤：
（1）、原料混合，以脱脂豆粕为原料并添加麸皮，加入至少由两种及两种以上发酵菌种混合而成的混合菌种发酵液，充分混合；
（2）、一次发酵，将上述混合物料在温度为30～35℃条件下进行发酵，时间90～110小时；
（3）、二次发酵，将步骤（2）中经第一次发酵的中间产品置于预先已添加了混合菌种发酵液的混合罐经过混合后进入第二次发酵过程，温度保持30～35℃，时间90～110小时；
（4）、成品烘干包装，发酵好的豆粕经过烘干，粉碎后打包即为成品。
在本发明中，所述发酵菌种包括以下四种发酵菌株：纳豆芽孢杆菌（菌株一N1）、枯草芽孢杆菌（菌株二BS2）、酵母菌（菌株三Y3）、凝结芽孢杆菌（菌株四AN4）中的任意两种及两种以上混合。
菌种的制备方法为：将四种原始菌株：菌株一N1，菌株二BS2，菌株三Y3， 菌株四AN4分别接种到各自的适宜培养基中在适当的条件下生产一级种子液，在对数生长期转接到二级种子液发酵罐扩大培养，二级种子发酵液培养至菌种生长处于对数生长期时再转接到生产罐中发酵，达到对数生长期时停止发酵，将分别发酵的菌液按需要混合后即为符合生产发酵豆粕使用的混合菌种发酵液。
四种菌株的具体培养条件如下：
纳豆芽孢杆菌：
斜面培养基：牛肉膏 0.5%，蛋白胨 1%，氯化钠0.5%，葡萄糖 2%，琼脂1.5%，pH 7.0～7.2；培养条件：32 ± 2℃，生长18～24h；
一级种子培养基：牛肉膏 0.5%，蛋白胨 1%，氯化钠0.5%，葡萄糖 2%， pH 7.0～7.2；培养条件：32 ± 2℃，生长8～12h；
二级种子培养基：牛肉膏 0.5%，蛋白胨 1%，葡萄糖 2.5%，pH 7.0～7.2；；培养条件：32 ± 2℃，生长8～12h；
枯草芽孢杆菌：
斜面培养基：牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，葡萄糖2%，pH7.0～7.2。；培养条件：30 ± 2℃，生长24～48h；
一级种子培养基：牛肉膏 0.3%，蛋白胨 1%，氯化钠0.5%，葡萄糖 2%，pH 7.0～7.2；培养条件：30 ± 2℃，生长8～12h；
二级种子培养基：牛肉膏 0.3%，蛋白胨 1%，葡萄糖 2.5%，pH 7.0～7.2；培养条件：30 ± 2℃，生长12～24h；
酵母菌：
斜面培养基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，葡萄糖0.9%，pH7.0～7.2。；培养条件：32 ± 2℃，生长24～48h；
一级种子培养基：牛肉膏 0.5%，蛋白胨 1%，氯化钠0.5%，葡萄糖0.9%，pH 7.0～7.2；培养条件：32 ± 2℃，生长8～12h；
二级种子培养基：牛肉膏 0.5%，蛋白胨 1%，葡萄糖 0.9%，糖蜜4.5%，pH 7.0～7.2；培养条件：32 ± 2℃，生长12～24h；
凝结芽孢杆菌：
斜面培养基：牛肉膏0.5%，蛋白胨2%，氯化钠0.5%，葡萄糖2%，pH7.0～7.2。；培养条件：30 ± 2℃，生长24～48h；
一级种子培养基：牛肉膏 0.5%，蛋白胨2%，氯化钠0.5%，葡萄糖2%，酵母粉1%， pH 7.0～7.2；培养条件：30 ± 2℃，生长8～12h；
二级种子培养基：牛肉膏 0.5%，蛋白胨 2%，葡萄糖2.5%，酵母粉1%，pH 7.0～7.2；培养条件：30 ± 2℃，生长12～24h；
在本发明中，麸皮的添加量为脱脂豆粕的5%～20%，主要起提供碳源、增加基料透气性及促进菌株生长的作用。
脱脂豆粕原料的pH调为5.0～7.0，含水率调节至55%～70%。
步骤（1）中，混合菌种发酵液的加入量为脱脂豆粕质量的2%～6%，步骤（3）中，混合菌种发酵液的加入量为中间产品的3%～10%。
利用本发明发酵工艺生产的发酵豆粕可在猪饲料中的应用，由于微生物发酵后产生一定乳酸，使得发酵豆粕具有特殊的乳香味，在断奶猪饲料中添加发酵豆粕后，可提高饲料的适口性，进而提高了仔猪的采食量。通过试验结果显示，日粮中添加发酵豆粕后大大降低了仔猪的腹泻率和死淘率。豆粕发酵后，将植物蛋白中原有的各种抗营养因子彻底分解，而且豆粕中的大分子蛋白被酶解成小肽后，大大降低了植物蛋白的抗原性，减少了仔猪营养性腹泻的发生率。此外，发酵豆粕中含大量的乳酸菌、生杆菌、酵母菌等多种益生菌，菌数达1×108 CFU/g以上。这些益生菌改善了断奶仔猪的胃肠道的微生物区系， 促进了胃肠道中有益菌群的繁殖。
本发明具备的优点在于：解决了发酵豆粕发酵时间过长，最大限度的消除了豆粕抗营养因子的弊端。经过二次发酵后的豆粕蛋白质被分解形成大量的植物小肽,蛋白质的溶解度显著提高,豆粕中的抗营养物质被分解。豆粕中一些多糖分子也在发酵过程中被分解成了小肽等氨基酸和葡萄糖等单糖。豆粕中的抗营养物质显著降低。与国内同类技术相比，本发明专利采用多菌种混合固体二次发酵，解决了发酵产物菌种发酵功能单一的缺陷，通过生态发酵将难以消化的蛋白质转化为容易被利用的蛋白质和肽、产生外源消化酶、降解毒素和消除营养抑制因子、产生益生菌，提高蛋白质生物效价、提高消化率和适口性、提高其免疫能力。并且整个生产过程简单、可靠，反应过程易于控制，适用于工业化规模生产。
具体实施方式
本发明以下将结合工艺参数及实施例做进一步详述，但并不限制本发明。
各菌种及混合菌种发酵液的制备方法如下：
将四种原始菌株：菌株一N1，菌株二BS2，菌株三Y3， 菌株四AN4分别接种到各自的适宜培养基中在适当的条件下生产一级种子液，在对数生长期转接到二级种子液发酵罐扩大培养，二级种子发酵液培养至菌种生长处于对数生长期时再转接到生产罐中发酵，达到对数生长期时停止发酵，将分别发酵的菌液按需要混合后即为符合生产发酵豆粕使用的混合菌种发酵液。
实施例1：
一次发酵：取豆粕1000g（蛋白质含量42.0%），加入麸皮100g，调pH至5.0～6.0，发酵料坯含水率调节至60%。经灭菌、冷却，用菌种接种，混合菌种发酵液的加入量为脱脂豆粕质量的3%，发酵温度31℃，发酵时间102h，发酵过程和结束后测定发酵豆粕中酸溶蛋白含量为49.6%。
发酵菌株：菌株一N1、菌株二BS2，菌种混合比N1: BS2 = 2: 1。
二次发酵：取经过初步发酵的中间产品1000g，调pH至5.0～6.0，发酵料坯含水率调节至60%。经灭菌、冷却，用菌种接种，混合菌种发酵液（菌种混合比N1: BS2 = 2: 1）的加入量为脱脂豆粕质量的4%，发酵温度31℃，发酵时间102h，发酵过程和结束后测定发酵豆粕中酸溶蛋白含量为58.2%。实验结果表明，肽转化率为55.65%。
发酵菌株：菌株一N1、菌株二BS2，菌种混合比N1：BS2 = 2: 1。
实施例2：
一次发酵：取豆粕1000g,加入麸皮100g,调pH至6.0～6.5，发酵料坯含水率调节至65%。经灭菌、冷却，用菌种接种，混合菌种发酵液的加入量为脱脂豆粕质量的3%，发酵温度33℃，发酵时间92h，发酵过程和结束后测定发酵豆粕中酸溶蛋白含量。
发酵菌株：菌株一N1、菌株二BS2、菌株三Y3，菌种混合比N1 : BS2 : Y3 = 2:1:2。
二次发酵:取经过初步发酵的中间产品1000g, 调pH至6.0～6.5,发酵料坯含水率调节至65%。经灭菌、冷却，用菌种接种，，混合菌种发酵液（菌种混合比N1:BS2:Y3 = 2:1:2）的加入量为脱脂豆粕质量的5%， 发酵温度33℃，发酵时间92h，发酵过程和结束后测定发酵豆粕中酸溶蛋白含量。实验结果表明，肽转化率为57.25%。
发酵菌株：菌株一N1、菌株二BS2、菌株三Y3，菌种混合比N1 : BS2 : Y3 = 2:1:2。
实施例3：
一次发酵：取豆粕1000g，加入麸皮150g，调pH至6.5～7.0，发酵料坯含水率调节至70%。经灭菌、冷却，用菌种接种，混合菌种发酵液的加入量为脱脂豆粕质量的4%，发酵温度35℃，发酵时间96h，发酵过程和结束后测定发酵豆粕中酸溶蛋白含量。
发酵菌株：菌株一N1、菌株二BS2、菌株三Y3、 菌株四AN4，接菌比N1: S2: Y3:AN4 = 2: 1:2:2）。
二次发酵：取经过初步发酵的中间产品1000g，调pH至6.5～7.0，发酵料坯含水率调节至70%。经灭菌、冷却，用菌种接种，混合菌种发酵液的加入量为脱脂豆粕质量的5%，发酵温度35℃，发酵时间96h，发酵过程和结束后测定发酵豆粕中酸溶蛋白含量。实验结果表明，肽转化率为62.25%。
发酵菌株：菌株一N1、菌株二BS2、菌株三Y3、菌株四AN4，接菌比N1: BS2: Y3: AN4 = 2: 1: 2: 2）。
实施例4：
一次发酵：取豆粕1000g，加入麸皮50g，调pH至5.5～6.5，发酵料坯含水率调节至65%。经灭菌、冷却，用菌种接种，混合菌种发酵液的加入量为脱脂豆粕质量的4%，发酵温度33℃，发酵时间100h，发酵过程和结束后测定发酵豆粕中酸溶蛋白含量。
发酵菌株：菌株一N1，菌株四AN4，接菌比N1: AN4 = 1:1。
二次发酵：取经过初步发酵的中间产品1000g, 调pH至5.5～6.5，发酵料坯含水率调节至65%。经灭菌、冷却，用菌种接种，混合菌种发酵液的加入量为脱脂豆粕质量的5%，发酵温度33℃，发酵时间100h，发酵过程和结束后测定发酵豆粕中酸溶蛋白含量。实验结果表明，肽转化率为56.05%。
发酵菌株：菌株一N1、菌株四AN4，接菌比N1: AN4 = 1: 1。
提取及计算方法
称取5g样品(精确至0.0001g)，加入5mL10%三氯乙酸溶液,混合均匀，再加入10mL5%三氯乙酸溶液，静置沉降5min后转到离心管中，在4000r/min下离心10min，取上清液并转到25mL比色管中定容。
酸溶蛋白测定：按GB/T 50095-2003操作。
肽转化率（%） = 酸溶蛋白含量/原豆粕蛋白含量
本发明并不局限于上述实施例中所描述的技术，以上描述是说明性的，并非限制性的，本发明的权限由权利要求所限定，基于本技术领域人员根据发明所能够变化、重组等方法得到的与本发明相关的技术，都将在本发明的保护范围之内。