一种衣藻乙醇提取物及其制备方法与应用与流程

本发明属于海洋生物技术领域，尤其涉及一种衣藻乙醇提取物及其制备方法与应用。

背景技术：

微藻是一类于海洋、湖泊、河流等水体环境中独立存在或成链状、团状存在的单细胞微观藻类。微藻具有极大的生物多样性，分布十分广泛，地球上大约存在200000～800000种不同门类的微藻，其中约35000种已有描述，超过15000种从藻类生物物质中产生的新型化合物已进行化学鉴定。

微藻具有分布广且不占用耕地、生物量大、光合效率高、环境适应能力强、生长周期短、油脂含量高和环境友好等特点，因此在生物柴油的开发中得到重视，目前大部分微藻的应用和研究都主要集中在高效产油方面。此外，由于微藻营养丰富，富含微量元素和各类生物活性物质，因此，其在医药、保健品、化妆品、水产养殖饲料和饲料添加剂等方面也具有广阔的应用前景。但目前微藻在医药、保健品方面的应用研究较少，且这些方面的研究目前主要集中在螺旋藻、小球藻、盐生杜氏藻和紫球藻等几种常见的微藻，对于其他微藻则相对报道较少。

衣藻属绿藻门绿藻纲团藻目衣藻科衣藻属，藻体为单细胞，球形或卵形，前端有两条等长的鞭毛，能游动。衣藻素有“绿色酵母”之称，与酵母有许多共同之处，如生长周期简单，生长快，世代时间短，可以在平板上形成单克隆，也能进行液体培养，以单倍体与二倍体两种形式生长，能对其配子的发育过程进行四分子分析。衣藻的独特之处在于其在光照和黑暗条件下均能生长，且能把外界提供的碳源与光合成的碳物质分开，是目前惟一能特异地对线粒体、叶绿体与核分别建立转化系统的生物。目前对衣藻的研究主要集中在生物产油和生物制氢方面，对其抗氧化方面的生物活性研究则鲜有报道。因此积极开发具有抗氧化、抗衰老作用的衣藻提取物将对衰老相关疾病的预防和治疗有重大意义。

技术实现要素：

为解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种衣藻乙醇提取物。本发明提供的衣藻乙醇提取物能够显著延长氧化胁迫条件下秀丽隐杆线虫的存活时间和延长自然条件下秀丽隐杆线虫的平均寿命，同时，其能促进体内活性氧自由基(ros)的清除，显著降低体内活性氧自由基(ros)的水平，具有显著的抗氧化和抗衰老作用，可应用于制备具有抗氧化和/或抗衰老功能的保健食品和药品。

本发明的技术方案将通过下面的详细描述来进一步体现和说明。

一种衣藻乙醇提取物，其制备方法包括如下步骤：

s1、取新鲜的衣藻湿藻，在温度为-20℃～-40℃的条件下冷冻12小时，室温融化12小时，反复冻融3～5次，在转速为5000r/min～10000r/min的条件下离心5～15min，将上清液和沉淀分离，取沉淀备用；

s2、向步骤s1所述的沉淀中加入体积分数为70％～99％的乙醇超声提取2～4次，在转速为5000r/min～10000r/min的条件下离心5～15min，将上清液和沉淀分离，取上清液进行真空干燥，将真空干燥后的产物用一级水溶解，即得衣藻乙醇提取物。

优选地，步骤s2中按湿藻与乙醇的固液比1g/ml加入乙醇进行超声提取。

优选地，步骤s2中超声提取的频率为35～40khz，温度为4℃。

优选地，步骤s2中每次超声提取的时间为10～30min。

本发明所述衣藻(chlamydomonassp.)由中国科学院水生生物研究所提供，其在中国科学院淡水藻种库中的编号为fachb-889。

本发明人在对微藻进行研究的过程中，进行了大量的试验，意外发现对反复冻融，离心取上清后剩余的残渣进行乙醇超声提取制得到的衣藻乙醇提取物能够显著延长氧化胁迫条件下秀丽隐杆线虫的存活时间和延长自然条件下秀丽隐杆线虫的平均寿命，同时，其能促进体内活性氧自由基(ros)的清除，显著降低体内活性氧自由基(ros)的水平，具有显著的抗氧化和抗衰老作用，可应用于制备具有抗氧化和/或抗衰老功能的保健食品和药品。

本发明衣藻乙醇提取物可单独或与其他活性成分合用，作为唯一或主要活性成分应用于制备具有抗氧化和/或抗衰老功能功能的保健食品和药品，所述保健食品和药品的剂型优选为片剂、胶囊剂、注射液、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂和滴丸剂等。

本发明所述的抗氧化、抗衰老作用是指对以病理或生理条件下因发生氧化应激反应所产生的变化为主要特征的衰老及衰老相关疾病的防治作用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)在整体动物水平上以氧化应激模型及衰老相关模型进行试验的试验结果表明，本发明提供的衣藻乙醇提取物可以显著延长氧化胁迫条件下秀丽隐杆线虫的生存时间，提高其存活率，同时还可以延长自然条件下秀丽隐杆线虫的平均寿命，具有显著的抗衰老和抗氧化作用。

(2)本发明提供的衣藻乙醇提取物能促进体内活性氧自由基(ros)的清除，显著降低体内活性氧自由基(ros)水平，具有显著的抗氧化作用。

(3)本发明提供的衣藻乙醇提取物的制备方法具有周期短，有机溶剂消耗少，工艺简单，安全无毒，稳定高效等特点，适合工业化生产。

附图说明

图1衣藻乙醇提取物对氧化胁迫条件下秀丽隐杆线虫存活率的影响。

图2衣藻乙醇提取物对自然条件下秀丽隐杆线虫平均寿命的影响。

图3衣藻乙醇提取物对秀丽隐杆线虫体内ros水平的影响。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明做进一步的详细说明。

本发明实施例中所使用的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂，如无特殊说明，均为可从商业途径得到的试剂和材料。

本发明实施例中，衣藻由中国科学院水生生物研究所提供，其在中国科学院淡水藻种库中的编号为fachb-889。

sbasal溶液：称取5.8gnacl，1.3gk2hpo4·3h2o和6.0gkh2po4置于试剂瓶中，加入750ml去离子水，完全溶解后定容至1l，灭菌30min，冷却至40-50℃备用。

smedium溶液：取1l灭菌后的sbasal溶液，逐滴加入1ml5.0mg/ml胆固醇乙醇溶液，边加变振摇，使其充分溶解(溶液由无色透明转为微乳白透明，无明显沉淀)，然后依次加入3ml1mcacl2溶液，3ml1mmgso4，10ml1m柠檬酸钾溶液(ph＝6.0)和10ml微量元素溶液，常温放置备用。

实施例1衣藻乙醇提取物的制备

s1、取新鲜的衣藻湿藻，在温度为-40℃的条件下冷冻12小时，室温融化12小时，反复冻融4次，在转速为10000r/min的条件下离心10min，将上清液和沉淀分离，取沉淀备用；

s2、向步骤s1所述的沉淀中按湿藻与乙醇的固液比1g/ml加入体积分数为80％的乙醇超声提取3次，超声提取的频率为40khz，温度为4℃，每次超声的时间为25min，在转速为10000r/min的条件下离心15min，将上清液和沉淀分离，取上清液进行真空干燥，将真空干燥后的产物用一级水溶解，调节其相对于衣藻(湿藻)重量的浓度为1ga/ml(a表示衣藻湿藻)，即得衣藻乙醇提取物。

实施例2衣藻乙醇提取物的制备

s1、取新鲜的衣藻湿藻，在温度为-20℃的条件下冷冻12小时，室温融化12小时，反复冻融5次，在转速为5000r/min的条件下离心15min，将上清液和沉淀分离，取沉淀备用；

s2、向步骤s1所述的沉淀中按湿藻与乙醇的固液比1g/ml加入体积分数为70％的乙醇超声提取3次，超声提取的频率为35khz，温度为4℃，每次超声的时间为30min，在转速为8000r/min的条件下离心15min，将上清液和沉淀分离，取上清液进行真空干燥，将真空干燥后的产物用一级水溶解，调节其相对于衣藻(湿藻)重量的浓度为1ga/ml(a表示衣藻湿藻)，即得衣藻乙醇提取物。

实施例3衣藻乙醇提取物的制备

s1、取新鲜的衣藻湿藻，在温度为-30℃的条件下冷冻12小时，室温融化12小时，反复冻融4次，在转速为8000r/min的条件下离心15min，将上清液和沉淀分离，取沉淀备用；

s2、向步骤s1所述的沉淀中按湿藻与乙醇的固液比1g/ml加入体积分数为90％的乙醇超声提取2次，超声提取的频率为40khz，温度为4℃，每次超声的时间为20min，在转速为8000r/min的条件下离心15min，将上清液和沉淀分离，取上清液进行真空干燥，将真空干燥后的产物用一级水溶解，调节其相对于衣藻(湿藻)重量的浓度为1ga/ml(a表示衣藻湿藻)，即得衣藻乙醇提取物。

实施例4衣藻乙醇提取物对氧化胁迫条件下秀丽隐杆线虫存活率的影响

百草枯，学名甲基紫精，是一种强氧化剂，可诱导体内大量产生活性氧自由基(ros)，使机体处于氧化胁迫环境，进而出现早衰现象。

取实施例1制得的衣藻乙醇提取物，按终浓度100mga/ml加入到成虫初期的野生型秀丽隐杆线虫(n2)(由美国明尼苏达大学秀丽隐杆线虫遗传信息保藏中心提供)中，对照组加入等体积的smedium溶液，置于20℃培养24h后，加入终浓度为50mm的百草枯进行氧化胁迫造模，然后每隔12h统计秀丽隐杆线虫存活的比例，直至其全部死亡。秀丽隐杆线虫的存活率以生存曲线表示，结果用kaplan-meier法进行分析。结果如图1所示。

图1结果显示，衣藻乙醇提取物能够延长氧化胁迫条件下秀丽隐杆线虫的生存时间，提高其存活率。试验结果表明本发明提供的衣藻乙醇提取物能够缓解由氧化胁迫引起的早衰现象，具有显著的抗氧化和抗衰老作用。

实施例5衣藻乙醇提取物对自然条件下秀丽隐杆线虫平均寿命的影响

向同步化后的l4期野生型秀丽隐杆线虫(n2)中加入终浓度为100mga/ml的实施例1制备的衣藻乙醇提取物，对照组加入等体积的smedium溶液，置于20℃培养，然后每隔1天统计秀丽隐杆线虫的存活情况，直至其全部死亡。秀丽隐杆线虫的寿命以生存曲线表示，结果用kaplan-meier法进行分析。结果如图2所示。

图2结果显示，与对照组相比，衣藻乙醇提取物相能够延长秀丽隐杆线虫的平均寿命。试验结果表明本发明提供的衣藻乙醇提取物具有延缓衰老进程的作用。

实施例6衣藻乙醇提取物对秀丽隐杆线虫体内ros水平的影响

取24孔培养板，设试验组和对照组，每组设两个孔，每孔终体积为1ml，试验组加同步化后的l4期野生型秀丽隐杆线虫(n2)和实施例1制得的衣藻乙醇提取物，衣藻乙醇提取物的终浓度100mga/ml，对照组加同步化后的l4期野生型秀丽隐杆线虫(n2)和与试验组衣藻乙醇提取物等体积的smedium溶液，置于20℃培养24h后，每孔加入百草枯至终浓度为2mm，继续培养48h后，收集各组秀丽隐杆线虫，将其分别在冰浴条件下匀浆，将匀浆液在4℃、10000g条件下离心5min，收集上清液，向上清液中加入终浓度为50μm的dcfh-da探针(购于sigma公司，cas号：2044-85-1)溶液，利用荧光酶标仪在485nm激发波长和538nm发射波长下检测荧光强度，室温检测2h，每10min测一次。结果用f检验分析，结果如图3所示。

图3结果显示，与对照组相比，经衣藻乙醇提取物饲喂后，秀丽隐杆线虫体内ros水平显著下降。试验结果表明本发明提供的衣藻乙醇提取物能够促进体内ros的清除，显著降低体内ros水平，具有显著的抗氧化能力。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。