一种缓解海鲈内质网应激的饲料添加剂及其制备方法与应用与流程

本发明涉及饲料领域，且特别涉及一种缓解海鲈内质网应激的饲料添加剂及其制备方法与应用。
背景技术：
：近年来，养殖海鲈脂肪肝的频繁发生是养殖业面临的普遍性问题，尤其是高温季节海鲈容易出现脂肪肝。脂肪肝不仅会导致海鲈生长速度与饲料转化率下降，还会降低海鲈的抗应激能力，一旦海鲈遭受高温和高氨氮等应激，容易大量死亡，给海鲈养殖带来巨大经济损失。目前众多研究表明，内质网应激在脂肪肝的发生和危害中起到非常重要的作用，内质网应激伴随着脂肪肝的发生与发展。内质网应激会导致肝脏脂肪不能有效的转运到肝外组织，从而导致肝脏脂肪的过度蓄积。此外，内质网应激还会导致细胞氧化损伤及凋亡，从而导致海鲈的抗应激能力降低。因此，开发能够缓解海鲈内质网应激的饲料添加剂有着非常重要的意义。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种缓解海鲈内质网应激的饲料添加剂，该饲料添加剂的原料均安全、无有害残留，为生产绿色饲料和水产品创造了条件。本发明的第二目的在于提供一种上述饲料添加剂的制备方法，该制备方法简单，条件可控性好，稳定性好，具有良好的应用前景。本发明的第三目的在于提供上述饲料添加剂在制备海鲈饲料中的应用，将其应用于制备海鲈饲料，不仅能提高海鲈肝脏抗氧化能力、减少内质网氧化损伤，同时还能降低内质网应激蛋白表达，缓解内质网应激，此外，还能提高细胞内ca2+稳态，从而维持内质网的稳态。本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的：本发明提出一种缓解海鲈内质网应激的饲料添加剂，每100重量份的饲料添加剂包括20-30重量份的苜蓿皂苷、10-20重量份的蛋氨酸螯合锌、5-15重量份的牛磺酸、20-30重量份的葛根粉以及5-10重量份的葡萄籽原花青素，余量为载体。本发明还提出上述饲料添加剂的制备方法：按配比混合苜蓿皂苷、蛋氨酸螯合锌、牛磺酸、葛根粉、葡萄籽原花青素以及载体。另外，本发明还提出了上述饲料添加剂在制备海鲈饲料中的应用，例如可按质量百分数为0.5-1.5％的比例添加于海鲈饲料中。本发明较佳实施例提供的缓解海鲈内质网应激的饲料添加剂及其制备方法与应用的有益效果是：(1)所选原料均安全、无有害残留，为生产绿色饲料和水产品创造了条件。(2)产品调控靶点明确、安全高效、配方合理，各组分间具有协同作用，配伍使用比单一使用效果更好、更稳定。(3)产品可提高海鲈肝脏抗氧化能力，减少内质网氧化损伤。(4)产品可提高细胞内ca2+稳态，维持内质网的稳态。(5)产品可以抑制内质网应激相关蛋白的表达，抑制内质网过度应激(6)制备方法简单，条件可控性好，饲料稳定性好，具有很好的应用前景。(7)用于制备海鲈饲料并饲喂海鲈，不仅能提高海鲈肝脏抗氧化能力、减少内质网氧化损伤，同时还能降低内质网应激蛋白表达，缓解内质网应激，此外，还能提高细胞内ca2+稳态，从而维持内质网的稳态。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1为试验例4中正常组海鲈肝细胞在透射电镜下的结构图；图2为试验例4中高脂组海鲈肝细胞在透射电镜下的结构图；图3为试验例4中试验组3海鲈肝细胞在透射电镜下的结构图。具体实施方式为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。下面对本发明实施例的缓解海鲈内质网应激的饲料添加剂及其制备方法与应用进行具体说明。经发现，内质网是细胞加工蛋白质和贮存ca2+的主要场所，atp耗尽、大量自由基产生及ca2+稳态破坏等均可以引起内质网功能障碍，触发内质网应激。因此，鱼类脂肪肝常出现的抗应激能力降低、细胞氧化损伤及凋亡等现象都与内质网的功能障碍有着极其密切的关系。基于上述发现，本发明实施例提供的缓解海鲈内质网应激的饲料添加剂，每100重量份的饲料添加剂例如可以包括20-30重量份的苜蓿皂苷、10-20重量份的蛋氨酸螯合锌、5-15重量份的牛磺酸、20-30重量份的葛根粉以及5-10重量份的葡萄籽原花青素，余量为载体。优选地，每100重量份的上述饲料添加剂例如可以包括23-27重量份的苜蓿皂苷、12-18重量份的蛋氨酸螯合锌、8-12重量份的牛磺酸、22-28重量份的葛根粉以及6-9重量份的葡萄籽原花青素，余量为载体。更优地，每100重量份的上述饲料添加剂例如可以包括25重量份的苜蓿皂苷、15重量份的蛋氨酸螯合锌、10重量份的牛磺酸、25重量份的葛根粉以及7.5重量份的葡萄籽原花青素，余量为载体。作为可选地，上述载体包括脱脂米糠和/或稻壳粉。其中，苜蓿皂苷是从苜蓿中提取的具有独特生物学性质的活性物质。具体的，苜蓿皂苷是由糖中羟基或非糖类化合物的羟基以缩醛链脱水缩合而成的环状缩醛物，其结构为五环三萜烯类化合物。通常，苜蓿皂苷用于治疗肠胃出血、促进肠胃蠕动以及清热等。本发明实施例中，苜蓿皂苷用于起到抗凋亡、增强海鲈体内抗氧化酶活性、提高海鲈细胞内ca2+稳态等作用，从而保护海鲈内质网，缓解内质网应激。蛋氨酸螯合锌在本发明方案提供的饲料添加剂中主要用于抑制内质网应激蛋白表达以及激活抗氧化酶活性。锌作为重要的微量元素之一，对维持海鲈的免疫系统功能和抗氧化系统功能、调节营养物质代谢、调节dna复制以及核酸合成均具有重要作用。目前，为了补充锌的含量，通常是补充无机锌盐或简单的有机酸锌盐。上述无机酸锌盐例如可以是硫酸锌、氯化锌和醋酸锌等，简单的有机酸锌盐例如可以是乳酸锌、葡萄糖酸锌以及甘草锌等。但无机锌盐对海鲈的消化吸收具有不良的刺激作用，并且生物效价偏低；而简单的有机酸锌盐虽吸收效率较无机锌好，但其合成复杂，产率及吸收率均较低，适用范围有限。鉴于此，本发明实施例中采用蛋氨酸螯合锌的方式，使螯合物中的锌离子不但能与蛋氨酸形成配位键，而且还能与其羧基构成离子键形成五元或六元环，从而使锌离子被封闭在螯合物的螯环内，显现出良好的稳定性。并且，蛋氨酸螯合锌能够通过蛋氨酸对锌离子所起的保护作用，使其免受食物中其它成分和胃肠中胃酸等不良作用，保护了锌的理化性质，拮抗作用少，提高了锌的生物利用率。此外，蛋氨酸螯合锌中含有蛋氨酸，能够避免脂质过氧化物损害初级和次级溶酶体膜，导致溶酶体内含有的作为水解的酸性磷酸酶释放出来而对细胞和内质网等重要的细胞器造成损害。此外，蛋氨酸还能够促进肝细胞膜磷脂甲基化，使膜流动性增强，减少肝细胞内胆汁的淤积，加强转硫基作用，减少胆汁酸在肝内聚积，具有较佳的解毒作用。通过采用同时含有蛋氨酸与锌的蛋氨酸螯合锌，不仅能够兼具蛋氨酸以及锌的作用，而且还能较单独的蛋氨酸或者锌具有更高的生物效价。因此，本发明实施例中采用的蛋氨酸螯合锌不仅降低了锌的用量，还减少了生产成本。较佳地，上述蛋氨酸螯合锌中的配体比(蛋氨酸与锌元素的摩尔比)优选控制在3.5-4：1，此配体比范围内蛋氨酸螯合锌的稳定性较适合海鲈吸收利用。配体比过小会造成形成的螯合物不稳定，游离的锌离子会催化导致羟基自由基产生；配体比过大，虽螯合物稳定性增强，但其稳定性过强后，不仅不利于海鲈吸收利用，同时还会造成蛋氨酸的浪费，从而增加生产成本。较佳地，上述蛋氨酸螯合锌中锌元素的螯合率优选在89-92％，此螯合率下锌的稳定性较强，不仅可避免在海鲈体内产生不良刺激，同时也较适于海鲈的消化吸收。牛磺酸通常用于保护视网膜以及促进中枢神经发育，本发明实施例中将其作为饲料添加剂的成分之一，主要用于起到抗氧化作用并抑制海鲈的内质网应激蛋白的表达。此外，牛磺酸还能与蛋氨酸螯合锌协同增加脂质和胆固醇的溶解性，解除胆汁阻塞，降低某些游离胆汁酸的细胞毒性。葛根粉通常用于解热除烦、生津止渴以及降血压，本发明实施例中其主要起到抗氧化、清除自由基、维持细胞内ca2+的浓度以及缓解内质网应激的作用。葡萄籽原花青素具有超强的抗氧化效率，能够提高免疫力，在本发明实施例中其主要用于抑制内质网应激蛋白表达。上述原料成分除了各自具有单独的作用外，各原料之间还具有协同增效作用，例如：苜蓿皂苷与葛根粉能够协同抗氧化，清除自由基，协同维持细胞内ca2+稳态，抑制内质网应激。蛋氨酸螯合锌、牛磺酸以及葡萄籽原花青素可协同抑制内质网应激蛋白表达。承上所述，本发明实施例的饲料添加剂中的原料配合使用后，不仅能提高海鲈肝脏抗氧化能力、减少内质网氧化损伤，同时还能降低内质网应激蛋白表达，缓解内质网应激，此外，还能提高细胞内ca2+稳态，从而维持内质网的稳态。此外，本发明实施例还提供了一种上述饲料添加剂的制备方法，也即按上述配比混合苜蓿皂苷、蛋氨酸螯合锌、牛磺酸、葛根粉、葡萄籽原花青素以及载体即可。鉴于各原料在饲料添加剂的含量各异且各原料的性质不同，为使各原料得以均匀混合，本发明实施例中例如可将原料按以下方式分步混合：先将葡萄籽原花青素与部分载体混合，然后与牛磺酸混合，再依次与葛根粉以及苜蓿皂苷混合，得第一混合物，将剩余的载体与蛋氨酸螯合锌混合后再与第一混合物混合。较佳地，在混合前，可将所有原料进行超微粉碎，然后过80-100目筛，以提高固体原料的颗粒均一性，改善饲料添加剂的可食性和消化率。此外，本发明实施例还提供了一种上述饲料添加剂的应用，例如可将其用于制备海鲈饲料并饲喂海鲈，从而能够有效提高海鲈肝脏抗氧化能力、减少内质网氧化损伤，降低内质网应激蛋白表达，缓解内质网应激，维持内质网的稳态。作为可选地，该饲料添加剂例如可以按质量百分数为0.5-1.5％添加于海鲈饲料中，例如可以按0.5wt％、1wt％和1.5wt％加入海鲈饲料中，优选按1wt％加入至海鲈饲料中。该添加比例下，饲料添加剂的性价比最佳。以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。实施例1混合前，将所有原料进行超微粉碎并过80目筛，按每100重量份的饲料添加剂含有20重量份的苜蓿皂苷、10重量份的蛋氨酸螯合锌、5重量份的牛磺酸、20重量份的葛根粉以及5重量份的葡萄籽原花青素，余量为脱脂米糠的比例将各原料进行混合，得缓解海鲈内质网应激的饲料添加剂。其中，蛋氨酸螯合锌的配体比为3.5：1，蛋氨酸螯合锌中锌元素的螯合率为89％。实施例2本实施例与实施例1的区别在于：混合前，将所有原料进行超微粉碎并过100目筛，按每100重量份的饲料添加剂含有30重量份的苜蓿皂苷、20重量份的蛋氨酸螯合锌、15重量份的牛磺酸、30重量份的葛根粉以及10重量份的葡萄籽原花青素，余量为脱脂米糠的比例将各原料进行混合，得缓解海鲈内质网应激的饲料添加剂。实施例3本实施例与实施例1的区别在于：混合前，将所有原料进行超微粉碎并过90目筛，按每100重量份的饲料添加剂含有23重量份的苜蓿皂苷、12重量份的蛋氨酸螯合锌、8重量份的牛磺酸、22重量份的葛根粉以及6重量份的葡萄籽原花青素，余量为脱脂米糠的比例将各原料进行混合，得缓解海鲈内质网应激的饲料添加剂。实施例4本实施例与实施例1的区别在于：按每100重量份的饲料添加剂含有27重量份的苜蓿皂苷、18重量份的蛋氨酸螯合锌、12重量份的牛磺酸、28重量份的葛根粉以及9重量份的葡萄籽原花青素，余量为脱脂米糠的比例将各原料进行混合，得缓解海鲈内质网应激的饲料添加剂。实施例5本实施例与实施例1的区别在于：按每100重量份的饲料添加剂含有25重量份的苜蓿皂苷、15重量份的蛋氨酸螯合锌、10重量份的牛磺酸、25重量份的葛根粉以及7.5重量份的葡萄籽原花青素，余量为脱脂米糠的比例将各原料进行混合，得缓解海鲈内质网应激的饲料添加剂。实施例6本实施例与实施例1的区别在于：蛋氨酸螯合锌中的配体比为4：1。实施例7本实施例与实施例1的区别在于：蛋氨酸螯合锌中的配体比为3.75：1。实施例8本实施例与实施例1的区别在于：蛋氨酸螯合锌中锌元素的螯合率为92％。实施例9本实施例与实施例1的区别在于：蛋氨酸螯合锌中锌元素的螯合率为90％。实施例10本实施例与实施例1的区别在于：载体为稻壳粉。实施例11本实施例与实施例1的区别在于：载体为脱脂米糠与稻壳粉的混合物。实施例12本实施例与实施例1的区别在于：混合过程中，先将葡萄籽原花青素与部分载体混合，然后与牛磺酸混合，再依次与葛根粉以及苜蓿皂苷混合，得第一混合物，将剩余的载体与蛋氨酸螯合锌混合后再与第一混合物混合。实施例13本实施例提供一种缓解海鲈内质网应激的饲料添加剂的应用，将其按质量百分数为0.5％添加于海鲈饲料中。实施例14本实施例提供一种缓解海鲈内质网应激的饲料添加剂的应用，将其按质量百分数为1％添加于海鲈饲料中。实施例15本实施例提供一种缓解海鲈内质网应激的饲料添加剂的应用，将其按质量百分数为1.5％添加于海鲈饲料中。试验例重复实施上述实施例1-12，得到足够多的缓解海鲈内质网应激的饲料添加剂。以实施例1、3、5为例作为试验组1-3，采用单因子设计，将试验鱼驯化一周后，挑选体格健壮、规格均一(均重为200±3g)的海鲈1500尾，随机分成5组(正常组、高脂组、试验组1-3)，每组3个重复，每个重复100尾。海鲈养殖于15个海水网箱中(规格为2.0m×2.0m×2.0m)中养殖。养殖试验期间，每日投喂2次(7:30和17:30)，饱食投喂，养殖周期为10周。每组饲料配方如表1所示，正常组饲料脂肪含量11％，高脂组：饲料脂肪水平为20％(本实验室前期研究表明：20％脂肪会导致内质网应激)，试验组：饲料脂肪水平为20％，并添加本实施例中的添加剂。用小型颗粒机加工成粒径为5mm左右的颗粒，常温风干后置于4℃冰箱保存备用。养殖试验结束，禁食24h。统计每一网箱中鱼的尾数。将鱼用浓度为100mg/l的ms-222(sigma，美国)麻醉，置于冰盘上采集肝脏，用于测试以下指标。试验结果如表2至表3所示。表1各组饲料配方组％注：表1中维生素预混物(mg或g/kg饲料)分别含有硫胺素25mg，核黄素45mg，盐酸吡哆醇20mg，维生素b120.1mg，维生素k310mg，肌醇800mg，泛酸60mg，烟酸200mg，叶酸20mg，生物素1.2mg，维生素a乙酸酯32mg，维生素d35mg，α-生育酚120mg，乙氧基喹啉150mg，胆碱(50％)5000mg。矿物质预混料(mg/kg饲料)分别含有一水硫酸镁4000mg，一水硫酸锌50mg，碘化钾(1％)100mg，氯化钴(1％)100mg，五水硫酸锌20mg，一水硫酸亚铁260mg，一水硫酸锌150mg，亚硒酸钠(1％)50mg。表2不同处理组对海鲈肝脏内质网应激蛋白表达的影响基因相对表达量正常组高脂组试验组1试验组2试验组3grp781.00c5.98a2.12b2.01b1.92bcrt1.00c7.62a2.69b3.69b2.57batf-6α1.00c4.21a1.25bc1.59b1.39bcaspase121.00c3.79a1.58b1.67b1.49b注：同行上标没有相同字母表示差异显著(p<0.05)。由表2可以看出，添加实施例1、3、5所提供的饲料添加剂后，试验组的海鲈的内质网应激蛋白(基因为grp78、crt、atf-6α以及caspase12)的表达均较高脂组显著降低(p<0.05)，表明添加本发明实施例提供的饲料添加剂可显著降低内质网应激蛋白表达，缓解内质网应激。由试验组1-3可以看出，试验组3的效果较试验组1和试验组2均更佳，说明试验组3的原料配比更利于降低海鲈的内质网应激蛋白表达。表3不同处理组内质网氧化损伤指标注：同行上标没有相同字母表示差异显著(p<0.05)。由表3可以看出，添加实施例1、3、5所提供的饲料添加剂后，试验组海鲈的总超氧化物歧化酶sod活性较高脂组显著升高(p<0.05)，表明本发明实施例提供的饲料添加剂具有增强抗氧化功能的作用。此外，添加实施例1、3、5所提供的饲料添加剂后，试验组海鲈的脂质过氧化物mda以及细胞内ros含量较高脂组显著降低(p<0.05)，并与正常组无显著差异，表明本发明实施例提供的饲料添加剂可降低内质网遭受的氧化损伤程度。由试验组1-3可以看出，试验组3的效果较试验组1和试验组2均更佳，说明试验组3的原料配比更利于提高海鲈的总超氧化物歧化酶sod活性、降低海鲈的脂质过氧化物mda以及细胞内ros含量。按照上述试验例的方法对实施例2、4以及6-12所得的缓解海鲈内质网应激的饲料添加剂进行试验，其结果同样显示通过饲喂含有本发明实施例提供的缓解海鲈内质网应激的饲料添加剂的海鲈饲料，可较高脂组降低内质网应激蛋白(基因为grp78、crt、atf-6α以及caspase12)表达、提高总超氧化物歧化酶sod活性、降低脂质过氧化物mda以及细胞内ros含量。并且其中，实施例4较实施例2所起的综合效果更佳，对比实施例1-5，实施例5较实施例1-4对海鲈内质网的综合效果更优且实施3-4较实施例1-2更优。此外，实施例12较实施例5对降低内质网应激蛋白(基因为grp78、crt、atf-6α以及caspase12)表达、提高总超氧化物歧化酶sod活性、降低脂质过氧化物mda以及细胞内ros含量的效果更佳，说明在制备过程中，将原料分步混合较同时混合更有利于维持内质网结构以及改善其功能。试验例2按试验例1的试验方法，设置对照组1-4，对照组1-4与实施例5的区别分别在于：对照组1中蛋氨酸螯合锌中的配体比为1:1，对照组2中蛋氨酸螯合锌中的配体比为2:1，对照组3中蛋氨酸螯合锌中的配体比为5:1，对照组4中蛋氨酸螯合锌中的配体比为6:1。对实施例5-7以及对照组1-4进行测定，其结果显示：较高脂组相比，实施例5-7均较对照组1-4在内质网应激蛋白(基因为grp78、crt、atf-6α以及caspase12)表达降低更为显著，且实施例5的降低程度最显著。此外，实施例5-7均较对照组1-4在提高总超氧化物歧化酶sod活性以及在降低脂质过氧化物mda和细胞内ros含量更为显著，且实施例5的改善程度最显著。试验例3按试验例1的试验方法，设置对照组5-7，对照组5-7与实施例5的区别分别在于：对照组5中蛋氨酸螯合锌中锌元素的螯合率为80％，对照组6中蛋氨酸螯合锌中锌元素的螯合率为85％，对照组7中蛋氨酸螯合锌中锌元素的螯合率为98％。对实施例5、8、9以及对照组5-7进行测定，其结果显示：较高脂组相比，实施例5、8、9均较对照组5-7在内质网应激蛋白(基因为grp78、crt、atf-6α以及caspase12)表达降低更为显著，且实施例5的降低程度最显著。此外，实施例5、8、9均较对照组5-7在提高总超氧化物歧化酶sod活性以及在降低脂质过氧化物mda和细胞内ros含量更为显著，且实施例5的改善程度最显著。试验例4将试验例1中试验期结束时的试验组3以及正常组和高脂组的海鲈的肝细胞于透射电镜下观察，其结果如图1-3所示。由图1-3可以看出：正常组海鲈的肝细胞内内质网排列规则、内质网上附着核糖体，基质均匀，膜清晰。高脂组海鲈的内质网排列不规则、内质网肿胀严重并断裂、核糖体脱落。试验组较高脂组能够恢复内质网超微结构、缓解内质网的肿胀。由此说明，通过饲喂含本发明实施例提供的缓解海鲈内质网应激的饲料添加剂的海鲈饲料，有利于维持海鲈内质网的超微结构完整。综上所述，本发明实施例提供的缓解海鲈内质网应激的饲料添加剂的原料均安全、无有害残留，为生产绿色饲料和水产品创造了条件。其制备方法简单，条件可控性好，稳定性好，具有良好的应用前景。将上述饲料添加剂应用于制备海鲈饲料，不仅能提高海鲈肝脏抗氧化能力、减少内质网氧化损伤，同时还能降低内质网应激蛋白表达，缓解内质网应激，此外，还能提高细胞内ca2+稳态，从而维持内质网的稳态。以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。当前第1页12