一种褐藻提取物及在抑制饵料微藻扩繁中剧毒卡罗藻增殖的应用的制作方法

本发明属于饵料微藻扩繁培养技术领域，具体涉及一种褐藻提取物及其在抑制饵料微藻扩繁过程中的有毒有害甲藻剧毒卡罗藻增殖中的应用。

背景技术：

饵料微藻是一类主要从自然水域中分离、纯化和筛选的微型藻类，是具有高营养、高饵料效果的有益经济微藻。饵料微藻高生物量扩繁培养是水产养殖中贝类育苗、动物性饵料饲料制备、以及调节养殖水体水质等不可或缺的一类微藻大量培养的过程。

但是饵料微藻的扩繁培养过程中，常常会受到有毒有害甲藻的污染，一方面导致饵料微藻大量增殖培养的失败；另一方面，有毒有害甲藻被摄食后，可能导致养殖生物致害，造成养殖失败；或者导致毒素在贝类等养殖生物中的累积和食物链传递，形成生态风险。

剧毒卡罗藻是全球海湾环境和海水养殖环境中广泛分布的一种典型有毒甲藻，并在全球生态退化的海湾养殖水域均有爆发赤潮导致养殖有害的记录，是健康养殖水体退化的重要指标。该藻细胞微小难于常规检出，并且能在沉淀池等黑暗环境中维持生存，常发生于饵料微藻扩繁水体中。该甲藻既能光合自养增殖，又具有摄食其他微藻的混合营养能力，一旦侵入增殖，不仅在微藻扩繁中很难消除，并能摄食饵料微藻、导致微藻扩繁失败。另一方面，该藻产生典型的卡罗藻系列毒素(kmtxs)，具有鱼毒、细胞毒等多种毒性，导致养殖贝类死亡。因此，在饵料微藻扩繁培养过程中，消除和降低其污染、抑制其细胞增殖，是一个重要环节。但是目前尚无有效解决方法。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种褐藻提取物，在水产养殖饵料微藻扩繁培养过程中添加此提取物，用于抑制和防控常常出现的混合营养型有毒甲藻剧毒卡罗藻；以提高饵料微藻成功扩繁的几率、减少养殖生物受害以及藻毒素的食物链传递等风险，实现健康养殖；从而弥补现有技术不足。

本发明所要提供的褐藻提取物，其制备方法如下：

1)将新鲜褐藻或冰冻保存的褐藻用海水清洗后，再用蒸馏水清洗藻体；

2)将乙醇加入到步骤1)清洗后的褐藻中，在0-25℃、避光浸提后对提取液进行抽滤，得到浸提液；

3)将浸提液合并于棕色瓶中于10-25℃的条件下，真空旋转蒸发直至溶液中含醇量小于35％；

4)将步骤3)旋转蒸发后得到的溶液，过滤除去黑绿色沉淀，得到浓缩液；

5)浓缩液继续低温浓缩，浓缩产物进行冷冻干燥，得到褐藻提取物粉剂。

步骤1)中所述的褐藻为铜藻、鼠尾藻、羊栖菜、海带、马尾藻、墨角藻、鹅肠菜、海蒿子、昆布、裙带菜、铁钉菜、巨藻等。

步骤(2)中所述的乙醇为无水乙醇或50—99％(v/v)的乙醇水溶液。

本发明所提供的褐藻提取物用于抑制典型水产养殖饵料微藻扩繁过程中的剧毒卡罗藻的繁殖，

其一种具体方法，是在水产养殖饵料微藻扩繁水体中，加入上述褐藻提取物，形成褐藻提取物在藻液中的终浓度为500-600ppm。该方法抑制剧毒卡罗藻细胞分裂，但对饵料微藻没有影响，从而在饵料微藻扩繁过程中实现对该有毒微藻的防控。

其中饵料微藻为等鞭金藻、小硅藻或小球藻。

本发明能有效抑制饵料微藻或海产经济微藻扩繁过程中常发的有毒甲藻剧毒卡罗藻的增殖，但不影响饵料微藻的正常增殖，提高饵料微藻扩繁的成功几率、防止有害甲藻侵袭，减少养殖生物受害、降低藻毒素的食物链传递风险。

附图说明

图1：褐藻提取物对饵料微藻等鞭金藻以及剧毒卡罗藻增殖的影响。

图2：褐藻提取物对饵料微藻小硅藻以及剧毒卡罗藻增殖的影响。

图3：褐藻提取物对饵料微藻小球藻以及剧毒卡罗藻增殖的影响。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明进行详细的描述。

实施例1：褐藻提取物的制备：

将新鲜铜藻用海水清洗3遍，去除表面杂质，再用蒸馏水清洗2遍，去除藻体表面的盐离子，然后用脱脂棉吸干表面水分。称取200g铜藻放入1000ml三角烧杯中，加入80％(v/v)乙醇水溶液800ml，用两层保险膜封住三角烧杯口，在黑暗中浸提48小时，滤过。继续向经过上述浸提处理的铜藻中再次加入80％(v/v)乙醇水溶液800ml，用两层保险膜封住三角烧杯口，在黑暗中浸提48小时，滤过。将铜藻重复避光浸提直至浸提液无色；

将上述各次浸提液合并倒入棕色瓶中，20℃下真空旋转蒸发，浓缩至溶液含醇量为30％时，溶液中逐步出现大量黑绿色沉淀，滤过，去除色素杂质；取滤液继续20℃真空浓缩直至溶液的固含量为3％；进行真空干燥，得到褐藻提取物粉剂。

上述褐藻除铜藻外，还可以是羊栖菜、海带、马尾藻、墨角藻、鹅肠菜、海蒿子、昆布、裙带菜、铁钉菜或巨藻等褐藻。

通过低温乙醇浸提，得到的浸提液含有多种脂溶性成分，包括多酚类物质、植物激素，脂质、叶绿素类、甾类等，以上多种脂溶性物质在同种溶剂中具有不同的溶解度，利用溶解度的明显差异，达到选择性提取目的，得到不同成分的有效分离；在旋转蒸发浓缩提取液时，逐渐浓缩，使其他脂溶性杂质基本析出完全，而水溶性物质如多酚类物质和植物激素等能大部分保留在浓缩液中，进行冻干，得到提取物冻干粉。

实施例2：褐藻提取物对饵料微藻球等鞭金藻(3011)以及剧毒卡罗藻增殖的影响。

取自然海水过滤消毒，分别添加kno3100mg/l、k2hpo410mg/l、mnso40.25mg/l、fec6h5o72.5mg/l、na2edta20mg/l、vb120.5mg/l、vb15mg/l各物质形成微藻培养基。接种水产养殖贝类育苗常用饵料微藻球等鞭金藻(3011)到上述培养液中。在饵料培养藻液中，分别接种入剧毒卡罗藻(纯化自浙江养殖水域)。培养液盐度20‰，培养水体体积100ml，各6平行。各组取3平行，分别加入上述铜藻中提取的褐藻提取物粉剂，充分溶解，使其中在藻液中的褐藻提取物终浓度为550ppm。另外3平行不添加褐藻提取物。全部实验组置于培养温度22℃，光照4000lx(d:l＝12:12)白色led灯光源的培养室内培养。每天上下午摇瓶1次。隔天取样检测各藻细胞密度，实验共7天。

细胞增殖过程图如图1(0-7d)所示。结果显示，褐藻提取物对常用饵料藻球等鞭金藻细胞增殖没有影响，添加与不添加褐藻提取物的藻液中，细胞数有相同的增殖，都从起始时的约5×10³个/ml增殖到约2.5×10⁴个/ml。相反，添加褐藻提取物实验组中的剧毒卡罗藻细胞增殖受到显著抑制，对照组相对起始密度增殖了近2.50倍，而添加提取物的实验组相对于起始密度增加0.60倍。

实施例3：褐藻提取物对饵料微藻小球藻以及剧毒卡罗藻增殖的影响。

取自然海水过滤消毒，分别添加kno3100mg/l、k2hpo410mg/l、mnso40.25mg/l、fec6h5o72.5mg/l、na2edta20mg/l、vb120.5mg/l、vb15mg/l各物质形成微藻培养基。接种水产养殖贝类育苗常用饵料微藻小球藻到上述培养液中。在饵料培养藻液中，分别接种卡罗藻(纯化自浙江养殖水域)。培养液盐度20‰，培养水体体积100ml，各6平行。各组取3平行，分别加入按照实施例1的方法从羊栖菜中提取的褐藻提取物粉剂，充分溶解，使其中在藻液中的褐藻提取物终浓度为550ppm。另外3平行不添加褐藻提取物。全部实验组置于培养温度22℃，光照4000lx(d:l＝12:12)白色led灯光源的培养室内培养。每天上下午摇瓶1次。隔天取样检测各藻细胞密度，实验共7天。

细胞增殖过程图如图2(0-7d)所示。结果显示，褐藻提取物对常用饵料微藻小球藻细胞增殖没有影响，添加与不添加褐藻提取物的藻液中，细胞数有相同的增殖，都从起始时的约9×10³个/ml增殖到约3.8×10⁴个/ml的最高密度。相反，添加褐藻提取物实验组中的剧毒卡罗藻细胞增殖受到显著抑制，对照组相对起始密度增殖了近1.30倍，而添加提取物的实验组相对于起始密度增加0.50倍。

实施例3：褐藻提取物对饵料微藻小硅藻以及剧毒卡罗藻增殖的影响。

取自然海水过滤消毒，分别添加kno3100mg/l、k2hpo410mg/l、mnso40.25mg/l、fec6h5o72.5mg/l、na2edta20mg/l、vb120.5mg/l、vb15mg/l各物质形成微藻培养基。接种水产养殖贝类育苗常用饵料微藻小硅藻(小新月菱形藻)到上述培养液中。在饵料培养藻液中，分别接种入剧毒卡罗藻(纯化自浙江养殖水域)。培养液盐度20‰，培养水体体积100ml，各6平行。各组取3平行，加入按照实施例1的方法从羊栖菜中提取的褐藻提取物粉剂，充分溶解，使其在藻液中的褐藻提取物终浓度为550ppm。另外3平行不添加褐藻提取物。全部实验组置于培养温度22℃，光照4000lx(d:l＝12:12)白色led灯光源的培养室内培养。每天上下午摇瓶1次。隔天取样检测各藻细胞密度，实验共7天。

细胞增殖过程图如图3(0-7d)所示。结果显示，褐藻提取物对常用饵料微藻小硅藻细胞增殖没有影响。添加与不添加褐藻提取物的藻液中，细胞数有相同的增殖，都从起始时的约9×10³个/ml增殖到约2.5×10⁴个/ml。相反，添加褐藻提取物实验组中的剧毒卡罗藻细胞增殖受到显著抑制，对照组相对起始密度增殖了近2.40倍，而添加提取物的实验组相对于起始密度增加0.68倍。

上述结果表明，本发明的方法能够显著抑制饵料微藻扩繁过程中的剧毒卡罗藻生物量，但是不会影响三种常用饵料微藻3011、小硅藻和小球藻的正常生长。