一种灭活非洲猪瘟病毒的方法及其活性检测与流程

1.本发明是一种灭活非洲猪瘟病毒的方法及其活性检测，具体涉及采用高能电子束灭活饲料中的非洲猪瘟病毒（asfv）的技术以及用于辐照后病毒的活性检测方法，属于食品安全领域。


背景技术：

2.非洲猪瘟是由asfv(african swine fever virus，asfv)感染引起的。asfv是asfv科的唯一成员，尚未发现有亲缘的病毒。asfv可以感染家猪和野猪，并引起急性出血热（非洲猪瘟），致死率接近100%。
3.非洲猪瘟最早于1900年在非洲东部暴发并相继传播至非洲西部及撒哈拉沙漠以南的许多国家。1957在葡萄牙里斯本报道了欧洲的首例非洲猪瘟疫情。到1990年非洲猪瘟已经扩散到了中、西欧洲以及加勒比海地区和南美洲。2007年格鲁吉亚和俄罗斯报道了非洲猪瘟疫情，此后东欧国家亦相继暴发非洲猪瘟。2018年8月我国辽宁沈阳首次首例非洲猪瘟疫情，并且传播迅速，截至 2018年底，已有23个省超过100多起家猪感染非洲猪瘟的报道。
4.asfv的基因组和病毒颗粒十分复杂，侵染方式、成熟方式多样等原因，非洲猪瘟疫苗开发的进程缓慢，但至今仍未研制出可以商用的asfv疫苗。所以asfv的防控重点还是监测并切断各种可能的传播、感染途径。asfv传播方式多样化，而且可以在各种猪肉制品和环境中存活相当长的时间，给asfv的防控带来了相当大的挑战。据报道，饲料也是传播asfv的途径之一，并且单次饲喂被污染的饲料引起感染的最低剂量为10
4 tcid
50
。随着饲料中asfv含量和受污染饲料饲喂次数的增加，感染机率也会逐步增加。如何灭活被污染饲料中的asfv并且检测其活性是降低饲料途径传播asfv的关键。
5.辐照很早便被应用于食品的杀菌。广泛的营养评估、毒性研究和喂养试验表明辐照食品不存在任何风险，且辐照产生的营养变化甚至比巴氏杀菌产生的营养变化幅度都要小。近年来，电子束辐照陈为了食品辐照杀菌消毒的热点。已经有研究表明使用不同电子束辐照剂量对新城疫病毒、1型牛疱疹病毒和鸡传染性法氏囊病毒活性物质进行照射，可以完全灭活这3种病毒。有关辐照灭活病毒，如现有专利文献cn103167880a（灭活的水痘带状疱疹病毒疫苗、其生产方法及用途，2013.06.19）、cn105431171a（用于使用电子束射线来病毒灭活的方法，2016.03.23）等。
6.例如cn105431171a采用50至300 kgy的电子束辐照来灭活液体样品中病毒的免疫原成分或是疫苗，可灭活的病毒包括多种有/无包膜、单链/双链rna和单链/双链dna病毒，并通过滴定法检测了电子束辐照灭活后病毒的tcid
50
值来反映病毒活性。cn105431171a还发现电子束灭活病毒后几乎完好地保存了病毒结构和抗原性，某些病毒如prrsv（猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒）可在灭活后用于制备疫苗。
7.asfv是单链dna病毒，基因组长达180~196 kb。研究表明，asfv基因组两端也存在重复序列和变异区，中间为中心保守区。除此外，asfv自带dna修复系统，但保真性十分低，
所以其基因组变异较大，给pcr检测asfv带来了一定难度。但qpcr和lamp仍是从环境样品中快速检测asfv的主要方法。目前在asfv的快速检测方面，已有专利文献cn110106290a（一种基于crispr/cas系统用于检测asfv的现场快速检测方法及试剂盒, 2019.08.09）， cn110453010a（一种用于检测非洲猪瘟病毒asfv的lamp引物组、试剂和试剂盒,2019.11.15）。
8.多种辐照都可以引起dna不同形式的损伤，如单链/双链断裂、形成嘧啶二聚体。pcr过程中聚合反应的进行需要相对完整的dna链，任何断裂、嘧啶二聚体都会阻断聚合反应。所以pcr已被广泛应用于检测断裂、形成嘧啶二聚体等细胞dna损伤。病毒的繁殖亦要求相对完整的基因组dna，所以已有文献表明可以尝试通过pcr法检测辐照后病毒基因组的完整性而评价其活性。比如r.a. rodri
ı
guez和s. bounty结合long-range pcr和qpcr对紫外照射后腺病毒2型的活性进行了评价（long-range quantitative pcr for determining inactivationof adenovirus 2 by ultraviolet light）；brian m. pecson建立了评价经紫外辐照的噬菌体ms2的活性的方法（framework for using quantitative pcr as a nonculture based methodto estimate virus infectivity）。
9.对于饲料生产企业而言，除了需要asfv检测技术以检测饲料生产过程中是否受到污染外，如何灭活被污染的饲料并检测灭活处理后病毒是否仍具有活性，是降低生产损失的关键之一。这对于规模化的生猪养殖场而言同样重要，所以迫切需要一种可以灭活饲料或器材中asfv的技术和快速检测其活性的方法。


技术实现要素：

10.本发明的目的在于提供一种灭活非洲猪瘟病毒的方法，采用高能电子束辐照技术对受污染饲料中非洲猪瘟病毒asfv进行灭活，实验表明，该技术可以使饲料中的asfv含量降到单次饲喂的传染剂量之下。
11.本发明的另一目的在于提供一种非洲猪瘟病毒的活性检测方法，可实现辐照后饲料中asfv活性的快速检测，实验表明，该检测方法的准确性可以达到90%，可以不需要进行依赖于细胞培养的病毒滴定，快速检测电子束辐照后饲料中残存的病毒的活性。
12.本发明通过下述技术方案实现：一种灭活非洲猪瘟病毒的方法，以受非洲猪瘟病毒asfv污染的饲料为对象，采用高能电子束进行辐照。
13.根据辐照前，饲料中非洲猪瘟病毒asfv浓度及其水分活度，选择高能电子束辐照的剂量范围。
14.采用lamp技术可视化的检测辐照前饲料中非洲猪瘟病毒asfv的浓度。
15.采用水分活度仪检测辐照前饲料中非洲猪瘟病毒asfv的水分活度。
16.所述高能电子束的辐照剂量控制在10～25kgy。
17.所述饲料经高能电子束辐照后，非洲猪瘟病毒asfv的tcid
50
值不高于104。
18.本发明还涉及一种非洲猪瘟病毒的活性检测方法，以上述辐照后的饲料为对象，采用long range-pcr/qpcr或long rang-pcr/lamp的方法，检测其所含非洲猪瘟病毒asfv的tcid
50
值。
19.包括以下步骤：（1）提取辐照后饲料中非洲猪瘟病毒asfv基因组dna；
（2）采用long-range pcr对基因组dna进行扩增，获得long range
ꢀ-ꢀ
pcr扩增产物，再依次进行步骤（3）、（4）或者依次进行步骤（5）、（6）；（3）对long-range pcr扩增产物进行qpcr或lamp扩增；（4）根据qpcr或lamp扩增结果，计算得到非洲猪瘟病毒asfv的tcid
50
值；（5）在long-range pcr扩增产物中加入染料后，再进行lamp扩增，使lamp扩增的结果可视化；（6）将lamp扩增产物进行颜色比对，得到非洲猪瘟病毒asfv的tcid
50
值。
20.所述步骤（4）中，按以下公式计算非洲猪瘟病毒asfv的tcid
50
值，tcid
50
=e
b-ax
其中x为对long range-pcr产物进行qpcr时达到所预设的阈值所需要的循环数。
21.所述步骤（5）中，染料为对ph敏感的染料溴甲酚紫、百里香酚蓝或是萘酚。
22.一种用于检测非洲猪瘟病毒活性的引物组，针对非洲猪瘟病毒asfv的衣壳蛋白p72的编码基因b646l（gene id: 22220311）设计引物组，引物组为lamp引物组、pcr引物组或qpcr引物组。
23.所述lamp引物组的序列号为：f3：5'-gtagacgcaatatacgcttta-3'，b3：5'
-ꢀ
gccatttaagagcagacatt
ꢀ-
3'，fip：5'
-ꢀ
gaccaagtgcttatatccagtcatttttt ggatcc atatagttcggatgt
ꢀ-
3'，bip：5'
-ꢀ
ggaggtatcggtggagggaatttt gaattcgcaaatcatgaatgt
ꢀ-
3'。
24.所述qpcr引物组的序列号为：forward primer：5'
-ꢀ
caaaaaggcccgactggttg
ꢀ-
3'，reverse primer：5'
-ꢀ
cagttccgtttcgtcctcca
ꢀ-
3'。
25.所述qpcr引物组的序列号为：forward primer：5'
-ꢀ
taaagtacgcccgcatacg
ꢀ-
3'，reverse primer：5'
-ꢀ
ggtgtttggttgtcccagt
ꢀ-
3'。
26.一种用于检测非洲猪瘟病毒活性的试剂，包括上述用于检测非洲猪瘟病毒活性的引物组。
27.一种用于检测非洲猪瘟病毒活性的试剂盒，包括上述用于检测非洲猪瘟病毒活性的引物组或权利要求15所述用于检测非洲猪瘟病毒活性的试剂。
28.本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：（1）本发明提供了针对被asfv污染的饲料进行高能电子束灭活的具体技术，和具体的评判标准，并给出了针对asfv的高能电子束灭活的具体工艺参数，以避免在饲料中过高剂量照射引起的浪费。
29.（2）本发明提供了在辐照灭活后，可以替代依赖于细胞培养的病毒滴定检测病毒活性的基于pcr的辐照后病毒灭活检测方法，缩短了辐照后检测病毒活性的时间，便于现场快速检测。
30.（3）本发明相对于以往现场快速检测asfv的方法无法检测其活性的缺陷，本发明提供了适用于辐照后可以快速检测病毒活性的方法。
具体实施方式
31.下面将本发明的发明目的、技术方案和有益效果作进一步详细的说明。
32.应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对所要求的本发明提供进一步的说明，除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
33.非洲猪瘟病毒african swine fever virus，asfv具有多种可能的传播和感染途径，其中饲料也是传播途径中的一种，为了降低感染几率，本发明提出了对饲料中非洲猪瘟病毒asfv进行灭活的方法，该方法可使被污染的饲料中的非洲猪瘟病毒的tcid
50
低于单次饲喂被污染的饲料引起感染的最低剂量，为更好保证该方法在使用过程中的有效性，本发明还提供了灭活后饲料中非洲猪瘟病毒活性的检测方法，已提供更全面、更有效的阻止非洲猪瘟病毒的感染途径。
34.以下是对本发明所述灭活方法及其活性检验方法的具体概述：以受非洲猪瘟病毒asfv污染的饲料为对象，首先，使用lmap技术和水分活度仪分别测定被非洲猪瘟病毒asfv污染的饲料中非洲猪瘟病毒asfv浓度以及水分活度，以确定高能电子束辐照的剂量，其辐照剂量通常控制在10～25kgy，可根据非洲猪瘟病毒asfv浓度以及水分活度进行选择，例如10～20 kgy或者进一步控制在10～15kgy。在经过高能电子束辐照处理后，采集部分饲料样品通过long-range pcr/qpcr或long-range pcr/lamp的方法检测高能电子束辐照后饲料中非洲猪瘟病毒asfv的tcid
50
值，并通过tcid
50
值判断饲料辐照灭活是否达标。
35.使用高能电子束灭活饲料中asfv的技术包括：辐照前被污染饲料asfv含量的测定和水分活度的测定、合适剂量的高能电子束辐照处理、tcid
50
值的测定及灭活效果的评判。
36.辐照前测定被污染饲料中asfv的含量是为了确定合适的辐照剂量，尽量降低电子束辐照的成本。被污染饲料中asfv的含量越高，需要采用的辐照剂量越高。本发明采用lamp技术检测被污染饲料中asfv的含量，在lamp扩增前加入ph敏感染料，使lmap的结果可视化，能够快速判定asfv被污染饲料中asfv的含量。本发明针对asfv的衣壳蛋白p72的编码基因b646l设计了lamp引物组，用于快速检测被污染饲料中asfv的含量。此外影响高能电子束灭活被污染饲料中的asfv的效果的因素很多，本发明主要考虑了饲料的水分对于灭活效果的影响，对于不同水分活度采用不同的辐照剂量。
37.基于辐照后一种非洲猪瘟病毒的活性检测方法包括：采集辐照后饲料样品中的非洲猪瘟病毒asfv基因组dna，采用long-range pcr/qpcr或long-range pcr/lamp的方法，检测其所含非洲猪瘟病毒asfv的tcid
50
值。
38.包括以下步骤：（1）提取辐照后饲料中非洲猪瘟病毒asfv基因组dna；（2）采用long-range pcr对基因组dna进行扩增，获得long-range pcr扩增产物，再依次进行步骤（3）、（4）或者依次进行步骤（5）、（6）；（3）对long-range pcr扩增产物进行qpcr或lamp扩增；（4）根据qpcr或lamp扩增结果，计算得到非洲猪瘟病毒asfv的tcid
50
值；（5）在long-range pcr扩增产物中加入染料后，再进行lamp扩增，使lamp扩增的结果可视化；
（6）将lamp扩增产物进行颜色比对，得到非洲猪瘟病毒asfv的tcid
50
值。
39.进行long-range pcr的目的在于减少假阳性结果。单纯的qpcr或是lamp法无法用于病毒灭活检测的原因即在于其扩增的片段过短，很可能因为在扩增区域未因辐照出现断裂、嘧啶二聚体而出现假阳性结果。已有文献表明结合不同长度片段的long-range pcr可以对qpcr或是lamp的结果进行修正，使之更能反应病毒灭活的真实情况。
40.本发明针对包含asfv的衣壳蛋白p72的编码基因b646l在内左右长达11.2 kb的片段设计了long-range pcr引物。
41.针对asfv的衣壳蛋白p72的编码基因b646l设计了qpcr的引物，采用的lamp引物组同辐照前检测被污染饲料中asfv的含量所使用的lamp引物组。
42.在活性检测方法中，利用对ph敏感染料来使lamp的结果可视化，通过一定循环数lamp扩增后的颜色来反应扩增模板本来的含量。在辐照后进行检测时，可以对照通过实验建立的的体系（比色卡）快速判断饲料中残存的asfv的tcid
50
值。
43.本发明建立了qpcr结果与饲料中残存的asfv的tcid
50
值的换算方法，如下：tcid
50
=e
b-ax
其中x为对long range-pcr产物进行qpcr时达到所预设的阈值所需要的循环数（ct值）。
44.下面以几个典型实施例来列举说明本发明的具体实施方式，当然，本发明的保护范围并不局限于以下实施例。
45.实施例1：（一）从饲料样品中提取asfv基因组dna。
46.使用病毒基因组dna提取试剂盒，按照试剂盒使用说明，从饲料样品中提取asfv的基因组dna。
47.（二）lamp可视化检测辐照前饲料中asfv含量。
48.针对asfv的衣壳蛋白p72的编码基因b646l设计lamp引物组，引物组、扩增条件和扩增后的片段，如下表1所示。
49.表1 lamp可视化检测设计引物组、扩增条件和扩增后的片段扩增时加入ph敏感染料，lamp完成后对照ph敏感染料的比色卡，计算辐照前饲料样品中asfv的含量。
50.（三）检测辐照前饲料的水分活度。
51.采用水分活度仪检测饲料的水分活度。
52.（四）采用高能电子束对饲料进行辐照。
53.针对辐照前饲料不同的病毒含量、水分活度采取不同的辐照剂量，具体如下表2。
54.表2 病毒含量、水分活度与辐照剂量实施例2：以实施例1中辐照后的饲料为对象，采用long-range pcr方法对其进行检测。
55.首先，针对asfv基因组dna中包含衣壳蛋白p72编码基因b646l在内的长达11.2 kb的片段（自b475l基因左端92.6 kb处至b66l基因右端103.8 kb处）设计long-range pcr引物，引物、扩增片段在asfv基因组的具体位置如下表3所示。
56.表3 引物及扩增片段长度辐照处理之后按照实施例1所述方法从饲料中提取asfv的基因组dna，采用本发明所述方法进行低循环数的long-range pcr扩增。扩增产物使用核酸酶s1进行消化，去除其中的long-range pcr引物和单链末端，并稀释适当倍数。
57.实施例3：以实施例1中辐照后的饲料为对象，采用long-range pcr方法对其进行检测，并计算其所含asfv的tcid
50
值。
58.针对asfv衣壳蛋白p72的编码基因b646l设计qpcr引物，引物和扩增后的片段如下表4所示。
59.表4 扩增对象、引物及扩增后片段
对long-range pcr的产物进行核酸酶s1处理后，加入qpcr引物进行扩增。根据以下公式计算辐照后asfv的tcid
50
值：tcid
50
=e
b-ax
其中x为对long-range pcr产物进行qpcr时达到所预设的阈值所需要的循环数（ct值）。
60.实施例4：以实施例1中辐照后的饲料为对象，采用long-range pcr方法对其进行检测，并计算其所含asfv的tcid
50
值。
61.lamp扩增各项同实施例1。
62.对long rane-pcr的产物进行核酸酶s1处理后，加入lmap引物组进行扩增。lamp扩增前，加入ph敏感的染料，使lamp扩增的结果可视化，对比ph敏感染料的比色卡得出辐照后饲料样品中asfv的tcid
50
值。
63.实施例5：辐照灭活效果的评判。
64.评判标准，以文献报道的单次饲喂引起感染的最低剂量为准： tcid
50
值小于104，优选tcid
50
值小于102、更优选tcid
50
值小于101，还更优选的是辐照之后病毒的活性已经不能被检测到。
65.实施例6：本实施例涉及一种用于检测非洲猪瘟病毒活性的引物组。
66.针对非洲猪瘟病毒asfv的衣壳蛋白p72的编码基因b646l设计引物组，引物组可以是lam引物组、pcr引物组或qpcr引物组，其设计方式参见上述实施例1、实施例2和实施例3。在使用上述引物组对非洲猪瘟病毒进行活性检测时，该引物组中还可以包括其他可以使用且能满足活性检测条件的物质，例如：dntp、bst酶、buffer等。
67.实施例7：本实施例涉及一种用于检测非洲猪瘟病毒活性的试剂。
68.该试剂包括上述实施例6中涉及的任意一种引物组，还可以包括其他可以使用且能满足活性检测条件的物质，例如：dntp、bst酶、buffer等。
69.实施例8：本实施例涉及一种用于检测非洲猪瘟病毒活性的试剂盒。
70.该试剂盒包括上述实施例6所述引物组或者实施例7所述试剂，该试剂盒的检测评判标准参见上述实施例5。
71.以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化，均落入本发明的保护范围之内。