多酚改性的玉米醇溶蛋白纳米粒子包埋缓释姜黄素的方法与流程

本发明属于食品包埋领域，涉及姜黄素的包埋技术，尤其是一种多酚改性的玉米醇溶蛋白纳米粒子包埋缓释姜黄素的方法。

背景技术：

姜黄素是从姜科、天南星科中的一些植物的根茎中提取的一种化学成分，具有降血脂、抗肿瘤、抗炎、利胆、抗氧化等作用。然而水溶性差、不稳定、生物利用率低等问题限制了其在食品中的应用。为解决上述问题，利用纳米包埋技术，以天然生物大分子为材料，制备可以递送姜黄素的载体。

玉米醇溶蛋白是一种醇溶谷蛋白，在玉米的胚乳及子粒中占比很高，分子量约为44kda，是其中主要的贮存蛋白质，它的含量约占总蛋白质的60％。玉米醇溶蛋白含有的疏水性氨基酸约占总氨基酸含量的50％以上，其中谷氨酸的含量最高，占比约30％，携带电荷的碱性、酸性以及极性氨基酸含量却很少。这种极度不平衡的氨基酸组成，导致其可溶于50％-90％的乙醇和丙酮，但在水中和无水乙醇中的溶解性极低。

玉米醇溶蛋白会因乙醇浓度降低，溶剂极性提高，从而使得溶解度降低，在这个过程中会引起蛋白质构象改变，使分子出现聚集的现象，此过程称为玉米醇溶蛋白的自组装。当溶液极性逐渐增加，玉米醇溶蛋白分子会由以α-螺旋结构为主变为主要为β-折叠的结构，由于疏水作用的存在，β-折叠结构慢慢变为反向，形成首尾连在一起卷曲的条带，最终形成zein纳米粒子。正是由于这一特性，玉米醇溶蛋白粒子成为了一种适用于包埋和递送活性物质及药物的优良载体。

虽然玉米醇溶蛋白纳米颗粒有很多优点，但由于其对酶的敏感性差、包封性能不高及缓释性能不好等问题，它的应用受到限制。为了克服这些弊端，有大量研究表明玉米醇溶蛋白与酪蛋白酸盐、多糖或表面活性剂形成具有核-壳结构的玉米醇溶蛋白纳米颗粒，可以用来提高颗粒性能并扩大应用范围。因此，如何提高其缓释性能是扩大玉米醇溶蛋白颗粒应用的范围的关键性技术。

研究表明，蛋白质与多酚结合之后，可以增加稳定性，降低消化率。多酚类物质含有丰富的羟基，可以与包括蛋白质在内的其他化合物形成氢键，或与蛋白质的羰基之间发生非共价相互作用。这些作用可以有利于提高玉米醇溶蛋白纳米颗粒在胃肠道中的稳定性及缓释性能。因此，玉米醇溶蛋白交联多酚是一种使玉米醇溶蛋白纳米颗粒更稳定更加缓释的一种选择。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种利用多酚改性的玉米醇溶蛋白纳米包埋缓释姜黄素的方法，采用碱处理法共价交联和反溶剂法制备纳米颗粒。采用碱处理的方式，将多酚与玉米醇溶蛋白通过共价方式连接，随后采用反溶剂法制备具有缓释功能的纳米颗粒。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明公开了具有缓释功能的多酚改性的玉米醇溶蛋白纳米颗粒的制备方法，分为以下步骤：

步骤1：称量取1g玉米醇溶蛋白粉末溶于50ml乙醇水溶液(70％，v/v)，充分搅拌，充分溶解，离心取上清液待用；

步骤2：称量取0.2g多酚溶于50ml乙醇水溶液(70％，v/v)，充分搅拌，充分溶解，离心取上清液待用；

步骤3：将步骤1和步骤2得到的澄清溶液，分别用0.1m的naoh溶液将其ph调至9.0；

步骤4：将步骤3得到的两种溶液混合，暴露在空气环境中，室温持续搅拌，使玉米醇溶蛋白和多酚充分反应；

步骤5：将步骤4得到的反应液置于透析袋内，放在磁力搅拌器上透析，以去除游离多酚；

步骤6：称量取姜黄素适量，将其加入到步骤5得到的混合溶液中，使得玉米醇溶蛋白和姜黄素的质量比为100：(1-5)；

步骤7：在磁力搅拌下，使用注射器将步骤5得到的姜黄素/玉米醇溶蛋白-多酚溶液滴加到水中，使得最终的蛋白质浓度为1、2、3、4mg/ml。搅拌30min，形成载姜黄素的玉米醇溶蛋白-多酚纳米颗粒。

优选地，步骤1所用的乙醇水溶液，其浓度为70％(v/v)。

优选地，步骤1所用的玉米醇溶蛋白，其纯度为99.9％。

优选地，步骤2所用的多酚，可以是表没食子儿茶素没食子酸酯、绿原酸或单宁酸中的一种。

优选地，步骤4中搅拌所需时间为24小时。

优选地，步骤5中所用透析袋的规格为3500da，透析时间为48小时。

优选地，步骤7中滴加的速度为2滴/秒。

优选地，步骤7中搅拌速度为100rmp，搅拌时间为30min。

本发明具有以下优点：

1.本发明所采用的原料均是天然生物大分子，可以降解，廉价易得；

2.本发明采用多酚作为共价交联物，具有大量酚羟基，交联效果好；

3.本发明采用多酚作为共价交联物，提高了纳米颗粒的稳定性，赋予其较高的胃肠道稳定性；

4.本发明所采用的具有一定生理功能的原料，使得在包埋姜黄素提高稳定性的同时，还可以提高与姜黄素协同增强其抗氧化活性。

附图说明

图1为实施案例1,2,3中姜黄素的缓释动力学曲线图；

图2为实施案例1,2,3中所制纳米粒子的傅里叶红外光谱图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变更或改进，均属于本发明的保护范围。

实施例1

1.常温常压下，称取1.0g的玉米醇溶蛋白，溶于50ml的70％(v/v)的乙醇-水溶液，在常温常压下，通过磁力搅拌器搅拌30min至溶液均匀透明，配制成20mg/ml的玉米醇溶蛋白溶液。

2.常温常压下，称取0.2g的表没食子儿茶素没食子酸酯，溶于50ml的70％(v/v)的乙醇-水溶液，在常温常压下，通过磁力搅拌器搅拌30min至溶液均匀透明，配制成4mg/ml的多酚溶液。

3.常温常压下，将玉米醇溶蛋白溶液和多酚溶液，分别用0.1m的氢氧化钠溶液将其ph调至9.0；之后将两种溶液混合，暴露在空气环境中，室温持续搅拌，使玉米醇溶蛋白和多酚充分反应；随后，将反应液置于透析袋内，放在磁力搅拌器上透析，以去除游离多酚。

4.常温常压下，称取姜黄素适量，将其加入透析得到的反应液中，使得玉米醇溶蛋白和姜黄素的质量比为100:1；

5.在磁力搅拌下，使用注射器将步骤5得到的姜黄素/玉米醇溶蛋白-多酚溶液滴加到水中，使得最终的蛋白质浓度为1mg/ml。搅拌30min，形成载姜黄素的玉米醇溶蛋白-多酚纳米颗粒。

实施例2

2.常温常压下，称取0.2g的绿原酸，溶于50ml的70％(v/v)的乙醇-水溶液，在常温常压下，通过磁力搅拌器搅拌30min至溶液均匀透明，配制成4mg/ml的多酚溶液。

3.常温常压下，将玉米醇溶蛋白溶液和多酚溶液，分别用0.1m的氢氧化钠溶液将其ph调至9.0；之后将两种溶液混合，暴露在空气环境中，室温持续搅拌，使玉米醇溶蛋白和多酚充分反应；随后，将反应液置于透析袋内，放在磁力搅拌器上透析，以去除游离多酚。

4.常温常压下，称取姜黄素适量，将其加入透析得到的反应液中，使得玉米醇溶蛋白和姜黄素的质量比为100:1；

5.在磁力搅拌下，使用注射器将步骤5得到的姜黄素/玉米醇溶蛋白-多酚溶液滴加到水中，使得最终的蛋白质浓度为1mg/ml。搅拌30min，形成载姜黄素的玉米醇溶蛋白-多酚纳米颗粒。

实施例3

1.常温常压下，称取1.0g的玉米醇溶蛋白，溶于50ml的70％(v/v)的乙醇-水溶液，在常温常压下，通过磁力搅拌器搅拌30min至溶液均匀透明，配制成20mg/ml的玉米醇溶蛋白溶液。

2.常温常压下，称取0.2g的单宁酸，溶于50ml的70％(v/v)的乙醇-水溶液，在常温常压下，通过磁力搅拌器搅拌30min至溶液均匀透明，配制成4mg/ml的多酚溶液。

3.常温常压下，将玉米醇溶蛋白溶液和多酚溶液，分别用0.1m的氢氧化钠溶液将其ph调至9.0；之后将两种溶液混合，暴露在空气环境中，室温持续搅拌，使玉米醇溶蛋白和多酚充分反应；随后，将反应液置于透析袋内，放在磁力搅拌器上透析，以去除游离多酚。

4.常温常压下，称取姜黄素适量，将其加入透析得到的反应液中，使得玉米醇溶蛋白和姜黄素的质量比为100:1；

5.在磁力搅拌下，使用注射器将步骤5得到的姜黄素/玉米醇溶蛋白-多酚溶液滴加到水中，使得最终的蛋白质浓度为1mg/ml。搅拌30min，形成载姜黄素的玉米醇溶蛋白-多酚纳米颗粒。

实施例4

1.常温常压下，称取1.0g的玉米醇溶蛋白，溶于50ml的70％(v/v)的乙醇-水溶液，在常温常压下，通过磁力搅拌器搅拌30min至溶液均匀透明，配制成20mg/ml的玉米醇溶蛋白溶液。

2.常温常压下，称取0.2g的表没食子儿茶素没食子酸酯，溶于50ml的70％(v/v)的乙醇-水溶液，在常温常压下，通过磁力搅拌器搅拌30min至溶液均匀透明，配制成4mg/ml的多酚溶液。

3.常温常压下，将玉米醇溶蛋白溶液和多酚溶液，分别用0.1m的氢氧化钠溶液将其ph调至9.0；之后将两种溶液混合，暴露在空气环境中，室温持续搅拌，使玉米醇溶蛋白和多酚充分反应；随后，将反应液置于透析袋内，放在磁力搅拌器上透析，以去除游离多酚。

4.常温常压下，称取姜黄素适量，将其加入透析得到的反应液中，使得玉米醇溶蛋白和姜黄素的质量比为100:1；

5.在磁力搅拌下，使用注射器将步骤5得到的姜黄素/玉米醇溶蛋白-多酚溶液滴加到水中，使得最终的蛋白质浓度为2mg/ml。搅拌30min，形成载姜黄素的玉米醇溶蛋白-多酚纳米颗粒。

实施例5

1.常温常压下，称取1.0g的玉米醇溶蛋白，溶于50ml的70％(v/v)的乙醇-水溶液，在常温常压下，通过磁力搅拌器搅拌30min至溶液均匀透明，配制成20mg/ml的玉米醇溶蛋白溶液。

2.常温常压下，称取0.2g的表没食子儿茶素没食子酸酯，溶于50ml的70％(v/v)的乙醇-水溶液，在常温常压下，通过磁力搅拌器搅拌30min至溶液均匀透明，配制成4mg/ml的多酚溶液。

3.常温常压下，将玉米醇溶蛋白溶液和多酚溶液，分别用0.1m的氢氧化钠溶液将其ph调至9.0；之后将两种溶液混合，暴露在空气环境中，室温持续搅拌，使玉米醇溶蛋白和多酚充分反应；随后，将反应液置于透析袋内，放在磁力搅拌器上透析，以去除游离多酚。

4.常温常压下，称取姜黄素适量，将其加入透析得到的反应液中，使得玉米醇溶蛋白和姜黄素的质量比为100:2；

5.在磁力搅拌下，使用注射器将步骤5得到的姜黄素/玉米醇溶蛋白-多酚溶液滴加到水中，使得最终的蛋白质浓度为1mg/ml。搅拌30min，形成载姜黄素的玉米醇溶蛋白-多酚纳米颗粒。

实施例6

1.常温常压下，称取1.0g的玉米醇溶蛋白，溶于50ml的70％(v/v)的乙醇-水溶液，在常温常压下，通过磁力搅拌器搅拌30min至溶液均匀透明，配制成20mg/ml的玉米醇溶蛋白溶液。

2.常温常压下，称取0.2g的表没食子儿茶素没食子酸酯，溶于50ml的70％(v/v)的乙醇-水溶液，在常温常压下，通过磁力搅拌器搅拌30min至溶液均匀透明，配制成4mg/ml的多酚溶液。

3.常温常压下，将玉米醇溶蛋白溶液和多酚溶液，分别用0.1m的氢氧化钠溶液将其ph调至9.0；之后将两种溶液混合，暴露在空气环境中，室温持续搅拌，使玉米醇溶蛋白和多酚充分反应；随后，将反应液置于透析袋内，放在磁力搅拌器上透析，以去除游离多酚。

4.常温常压下，称取姜黄素适量，将其加入透析得到的反应液中，使得玉米醇溶蛋白和姜黄素的质量比为100:2；

5.在磁力搅拌下，使用注射器将步骤5得到的姜黄素/玉米醇溶蛋白-多酚溶液滴加到水中，使得最终的蛋白质浓度为2mg/ml。搅拌30min，形成载姜黄素的玉米醇溶蛋白-多酚纳米颗粒。

实施例7

1.常温常压下，称取1.0g的玉米醇溶蛋白，溶于50ml的70％(v/v)的乙醇-水溶液，在常温常压下，通过磁力搅拌器搅拌30min至溶液均匀透明，配制成20mg/ml的玉米醇溶蛋白溶液。

2.常温常压下，称取0.2g的表没食子儿茶素没食子酸酯，溶于50ml的70％(v/v)的乙醇-水溶液，在常温常压下，通过磁力搅拌器搅拌30min至溶液均匀透明，配制成4mg/ml的多酚溶液。

3.常温常压下，将玉米醇溶蛋白溶液和多酚溶液，分别用0.1m的氢氧化钠溶液将其ph调至9.0；之后将两种溶液混合，暴露在空气环境中，室温持续搅拌，使玉米醇溶蛋白和多酚充分反应；随后，将反应液置于透析袋内，放在磁力搅拌器上透析，以去除游离多酚。

4.常温常压下，称取姜黄素适量，将其加入透析得到的反应液中，使得玉米醇溶蛋白和姜黄素的质量比为100:5；

5.在磁力搅拌下，使用注射器将步骤5得到的姜黄素/玉米醇溶蛋白-多酚溶液滴加到水中，使得最终的蛋白质浓度为1mg/ml。搅拌30min，形成载姜黄素的玉米醇溶蛋白-多酚纳米颗粒。

实施例8

1.常温常压下，称取1.0g的玉米醇溶蛋白，溶于50ml的70％(v/v)的乙醇-水溶液，在常温常压下，通过磁力搅拌器搅拌30min至溶液均匀透明，配制成20mg/ml的玉米醇溶蛋白溶液。

2.常温常压下，称取0.2g的表没食子儿茶素没食子酸酯，溶于50ml的70％(v/v)的乙醇-水溶液，在常温常压下，通过磁力搅拌器搅拌30min至溶液均匀透明，配制成4mg/ml的多酚溶液。

3.常温常压下，将玉米醇溶蛋白溶液和多酚溶液，分别用0.1m的氢氧化钠溶液将其ph调至9.0；之后将两种溶液混合，暴露在空气环境中，室温持续搅拌，使玉米醇溶蛋白和多酚充分反应；随后，将反应液置于透析袋内，放在磁力搅拌器上透析，以去除游离多酚。

4.常温常压下，称取姜黄素适量，将其加入透析得到的反应液中，使得玉米醇溶蛋白和姜黄素的质量比为100:5；

5.在磁力搅拌下，使用注射器将步骤5得到的姜黄素/玉米醇溶蛋白-多酚溶液滴加到水中，使得最终的蛋白质浓度为2mg/ml。搅拌30min，形成载姜黄素的玉米醇溶蛋白-多酚纳米颗粒。

实施例9

1.常温常压下，称取1.0g的玉米醇溶蛋白，溶于50ml的70％(v/v)的乙醇-水溶液，在常温常压下，通过磁力搅拌器搅拌30min至溶液均匀透明，配制成20mg/ml的玉米醇溶蛋白溶液。

2.常温常压下，称取0.2g的绿原酸，溶于50ml的70％(v/v)的乙醇-水溶液，在常温常压下，通过磁力搅拌器搅拌30min至溶液均匀透明，配制成4mg/ml的多酚溶液。

3.常温常压下，将玉米醇溶蛋白溶液和多酚溶液，分别用0.1m的氢氧化钠溶液将其ph调至9.0；之后将两种溶液混合，暴露在空气环境中，室温持续搅拌，使玉米醇溶蛋白和多酚充分反应；随后，将反应液置于透析袋内，放在磁力搅拌器上透析，以去除游离多酚。

4.常温常压下，称取姜黄素适量，将其加入透析得到的反应液中，使得玉米醇溶蛋白和姜黄素的质量比为100:1；

5.在磁力搅拌下，使用注射器将步骤5得到的姜黄素/玉米醇溶蛋白-多酚溶液滴加到水中，使得最终的蛋白质浓度为2mg/ml。搅拌30min，形成载姜黄素的玉米醇溶蛋白-多酚纳米颗粒。

实施例10

1.常温常压下，称取1.0g的玉米醇溶蛋白，溶于50ml的70％(v/v)的乙醇-水溶液，在常温常压下，通过磁力搅拌器搅拌30min至溶液均匀透明，配制成20mg/ml的玉米醇溶蛋白溶液。

2.常温常压下，称取0.2g的单宁酸，溶于50ml的70％(v/v)的乙醇-水溶液，在常温常压下，通过磁力搅拌器搅拌30min至溶液均匀透明，配制成4mg/ml的多酚溶液。

3.常温常压下，将玉米醇溶蛋白溶液和多酚溶液，分别用0.1m的氢氧化钠溶液将其ph调至9.0；之后将两种溶液混合，暴露在空气环境中，室温持续搅拌，使玉米醇溶蛋白和多酚充分反应；随后，将反应液置于透析袋内，放在磁力搅拌器上透析，以去除游离多酚。

4.常温常压下，称取姜黄素适量，将其加入透析得到的反应液中，使得玉米醇溶蛋白和姜黄素的质量比为100:1；

5.在磁力搅拌下，使用注射器将步骤5得到的姜黄素/玉米醇溶蛋白-多酚溶液滴加到水中，使得最终的蛋白质浓度为2mg/ml。搅拌30min，形成载姜黄素的玉米醇溶蛋白-多酚纳米颗粒。

对比例

1.常温常压下，称取1.0g的玉米醇溶蛋白，溶于100ml的70％(v/v)的乙醇-水溶液，在常温常压下，通过磁力搅拌器搅拌30min至溶液均匀透明，配制成10mg/ml的玉米醇溶蛋白溶液。

2.常温常压下，称取姜黄素适量，将其加入玉米醇溶蛋白溶液中，使得玉米醇溶蛋白和姜黄素的质量比为100:1；

3.在磁力搅拌下，使用注射器将步骤2得到的姜黄素/玉米醇溶蛋白溶液滴加到水中，使得最终的蛋白质浓度为1mg/ml。搅拌30min，形成载姜黄素的玉米醇溶蛋白纳米颗粒。

表1不同姜黄素添加量、不同终止浓度对zein-多酚纳米粒子包封的影响

以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。