本发明涉及一种复合发酵型鲨鱼软骨粉保健饮品，尤其是一种利用微生物协同发酵制备高免疫保健功效的鲨鱼软骨粉保健饮品，属于生物
技术领域：
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背景技术：
：鲨鱼是世界上最古老、最长寿的深海海洋生物之一，在地球上已生存了四亿年之久，它具有完善免疫系统，生命力极强，几乎不被疾病感染，即使受到外伤，伤口也能很快复原，鲨鱼患癌症的几率约为1/百万。我国鲨鱼药用始见于《本草经集注》，其软骨主要由软骨细胞和含有胶原纤维及大量蛋白多糖和细胞外基质构成，从鲨鱼软骨中提取的多糖在临床上主要用于治疗神经痛、偏头痛、腹腔手术后疼痛等。在欧、美、日等发达国家，鲨鱼软骨多糖作为保健食品或保健药品长期应用于防治冠心病、心绞痛、心肌梗死等疾病，无明显的毒副作用。近年来研究表明鲨鱼软骨中除富含钙、磷、镁等矿物质外，还含有多种粘多糖及硫酸软骨素，具有显著的抗凝血、降血脂、抗病毒和抗肿瘤等功用，是不可多得的天然食品资源。由于鲨鱼软骨粉具备促进人体软骨再生，抑制新生血管的天然功效，因此鲨鱼软骨粉是一种优良的补钙原料。近年来，鲨鱼翅骨粉保健食品开发得到快速发展，但仍存在保健产品原料单一、功能活性成分无法充分利用、产品食用不便等缺陷，制约鲨鱼翅骨粉保健食品产业可持续发展。本发明以鲨鱼软骨粉为组方基础，配伍葛根和石斛等中草药，利用复合微生物菌剂与具有保健治疗作用的中药进行复合型发酵，制备一种全新的具有鲨鱼软骨粉和中草药双重健康作用的保健饮品，拓展了中鲨鱼软骨粉的应用途径，既保重复发挥其营养保健功效，克服目前鲨鱼软骨粉多直接食用造成营养消化率低的技术弊端。技术实现要素：为了克服上述现有技术的不足，实现鲨鱼软骨粉功能活性物质高效提取及抗氧化能力显著提升，本申请提供一种复合发酵型鲨鱼软骨粉保健饮品，集成现代生物分离技术、生物酶解技术、混菌微生物发酵技术、中草药配伍应用技术，研制开发出高免疫增强能力的鲨鱼软骨粉保健饮品，满足保健、医疗、食品等领域对鲨鱼软骨粉的应用需求，该工艺技术发酵工艺简单高效、所得产品免疫增强能力强，并具有显著的抗肿瘤功效，生产成本低，易于工业化规模生产。本发明通过下述技术方案实现上述技术效果：一种复合发酵型鲨鱼软骨粉保健饮品，其特征在于鲨鱼软骨粉保健饮品制备过程中添加葛根和石斛，其配伍比例为：鲨鱼软骨粉100份、葛根2～5份、石斛1～2份。上述中草药原料进行如下预提取处理：将葛根和石斛原料清除杂质后粉碎，过80-150目筛，然后加入中草药原料质量比10倍的纯净水，在40～60℃条件下浸泡30min；加入中草药原料质量比2%的纤维素酶，在微波辅助提取2min，微波功率为250～400w，然后静置30min以上。本申请提供一种复合发酵型鲨鱼软骨粉保健饮品，其特征在于通过好氧发酵和二步厌氧发酵工艺制备，具体工艺包括：（1）发酵液制备：将粉碎后的鲨鱼软骨粉与预处理后的中草药原料混合，加入20倍的纯净水，然后加入发酵液质量比0.15～0.20%(nh4)2so4、0.10～0.15%kh2po4、0.1%mgso4；（2）灭菌：在121℃条件下灭菌15min；（3）好氧发酵：向酶解后的酶解液中加入酶解液质量比2～3%的复合微生物菌剂，在28～35℃条件下好氧发酵6～12h；（4）厌氧发酵：好氧发酵结束后加入1～2%的乳酸杆菌粉，在28～35℃条件下厌氧发酵8～16h；（5）过滤：进行粗过滤除去发酵菌体；（6）离心：以10000r/min速率离心分离，分离上清液；（7）陈酿：为促进饮品的稳定和澄清，在0～10℃条件下陈酿10～20d；（8）复配：加入1～1.5g/l木糖醇、1～2g/l低聚异麦芽糖、5～10g/l柠檬酸、5～10g/l乳酸钙、3～5g/l蔗糖；（9）膜过滤：用孔径为0.15μm的微孔膜过滤鲨鱼软骨粉保健饮品；（10）无菌灌装：在无菌灌装生产线中灌装封口制得复合发酵型鲨鱼软骨粉保健饮品。上述步骤（3）中的复合微生物菌剂为黑曲霉、酿酒酵母和地衣芽孢杆菌的混合菌，其接种量量比为1:2:1。上述黑曲霉的种子液的制备方法为：在无菌条件下，采用土豆培养基在35～40℃条件下培养24h，制得黑曲霉种子液，要求种子液的有效活菌数≥109cfu/ml。上述酵母菌种子液制备方法为：在无菌操作条件下，从酵母菌ydp斜面上用接种环挑取两环菌种，接种到500ml装300mlpda液体培养基的三角瓶内，28℃～32℃，140r/min振荡培养24h后，然后按照上述工艺接种种子罐扩大培养制备酵母菌种子液，要求种子液的有效活菌数≥109cfu/ml。上述地衣芽孢杆菌种子液制备方法为：在无菌条件下，采用lb培养基在28～32℃条件下培养24h，制得液体芽孢杆菌种子液，要求种子液的有效活菌数≥109cfu/ml。本发明提供一种复合发酵型鲨鱼软骨粉保健饮品，所得鲨鱼软骨粉保健饮品富含氨基糖、糖胺聚糖、黄酮、皂甙等多种功能活性物质，具有显著的免疫增强功效，而且具有显著的抗肿瘤功效，适合中老年消费者群体，其介于保健酒和保健饮料之间，是一种新型的高效保健饮品。本发明提供一种复合发酵型鲨鱼软骨粉保健饮品，与现有技术相比，具有以下显著优势：（1）本申请科学配伍鲨鱼软骨粉、葛根和石斛，既可以充分利用葛根、石斛等中草药对微生物的促生长作用；又通过中草药间的协同作用显著提升鲨鱼软骨粉保健饮品的免疫增强功效，实验结果表明中草药间的协同作用是复合微生物发酵取得预料不到功效的主要原因；（2）本申请利用好氧菌（黑曲霉、酵母菌、地衣芽孢杆菌）共同发酵中草药原料提取鲨鱼软骨粉，充分利用微生物间的协同作用，提升鲨鱼软骨粉的提取率和体外抗氧化能力，其中：黑曲霉能在髙温下分解纤维素，打破纤维素对鲨鱼软骨粉功能活性成分（黄酮、多酚等）逸出的束缚；酵母菌在发酵过程中会产生各种降解细胞壁的酶类，使得更多的黄酮等活性物质从细胞壁中释放出来，且酵母是产生能够释放结合态酚酸的酶类，有利于提升鲨鱼软骨粉的体外抗氧化能力；地衣芽孢杆菌在高温发酵过程中能够杀灭发酵液中的致病菌，并具有较强的产淀粉酶、蛋白酶等能力，可以将大分子淀粉、蛋白物质降解为微生物所利用；（3）本申请通过好氧发酵和二步厌氧发酵显著提升了鲨鱼软骨粉保健饮品的功能性，取得了“1+1>2”的技术效果。（4）采用液体发酵，提高了菌体的生长速率，缩短了发酵时间，提升了生产效率，发酵工艺条件温和，生产成本低，且易于规模化生产，对提升行业经济效益及规模化推广应用具有重要作用。具体实施方式以下实施例中微生物菌种活化方法均采用以下工艺：（1）黑曲霉的种子液的制备方法为：在无菌条件下，采用土豆培养基在35～40℃条件下培养24h，制得黑曲霉种子液，要求种子液的有效活菌数≥109cfu/ml。（2）酵母菌种子液制备方法为：在无菌操作条件下，从酵母菌ydp斜面上用接种环挑取两环菌种，接种到500ml装300mlpda液体培养基的三角瓶内，28℃～32℃，140r/min振荡培养24h后，然后按照上述工艺接种种子罐扩大培养制备酵母菌种子液，要求种子液的有效活菌数≥109cfu/ml。（3）地衣芽孢杆菌种子液制备方法为：在无菌条件下，采用lb培养基在28～32℃条件下培养24h，制得液体芽孢杆菌种子液，要求种子液的有效活菌数≥109cfu/ml。实施例1一种复合发酵型鲨鱼软骨粉保健饮品，具体工艺步骤包括：（1）配料：按鲨鱼软骨粉100份、葛根3份、石斛1份比例准确配伍原料（2）中草药预处理：将葛根和石斛原料清除杂质后粉碎，过80-150目筛，然后加入中草药原料质量比10倍的纯净水，在40～60℃条件下浸泡30min；加入中草药原料质量比2%的纤维素酶，在微波辅助提取2min，微波功率为250～400w，然后静置30min以上；（3）发酵液制备：将粉碎后的鲨鱼软骨粉与预处理后的中草药原料混合，加入20倍的纯净水，然后加入发酵液质量比0.15～0.20%(nh4)2so4、0.10～0.15%kh2po4、0.1%mgso4；（4）灭菌：在121℃条件下灭菌15min；（5）好氧发酵：向酶解后的酶解液中加入酶解液质量比2～3%的复合微生物菌剂，在28～35℃条件下好氧发酵6～12h；所述复合微生物菌剂为黑曲霉、酿酒酵母和地衣芽孢杆菌的混合菌，其接种量量比为1:2:1；（6）厌氧发酵：好氧发酵结束后加入1～2%的乳酸杆菌粉，在28～35℃条件下厌氧发酵8～16h；（7）过滤：进行粗过滤除去发酵菌体；（8）离心：以10000r/min速率离心分离，分离上清液；（9）陈酿：为促进饮品的稳定和澄清，在0～10℃条件下陈酿10～20d；（10）复配：加入1.5g/l木糖醇、2g/l低聚异麦芽糖、5g/l柠檬酸、5g/l乳酸钙、3g/l蔗糖；（11）膜过滤：用孔径为0.15μm的微孔膜过滤鲨鱼软骨粉保健饮品；（12）无菌灌装：在无菌灌装生产线中灌装封口制得复合发酵型鲨鱼软骨粉保健饮品。实施例2一种复合发酵型鲨鱼软骨粉保健饮品，具体工艺步骤包括：（1）配料：按鲨鱼软骨粉100份、葛根5份、石斛2份比例准确配伍原料（2）中草药预处理：将葛根和石斛原料清除杂质后粉碎，过80-150目筛，然后加入中草药原料质量比10倍的纯净水，在40～60℃条件下浸泡30min；加入中草药原料质量比2%的纤维素酶，在微波辅助提取2min，微波功率为250～400w，然后静置30min以上；（3）发酵液制备：将粉碎后的鲨鱼软骨粉与预处理后的中草药原料混合，加入20倍的纯净水，然后加入发酵液质量比0.15～0.20%(nh4)2so4、0.10～0.15%kh2po4、0.1%mgso4；（4）灭菌：在121℃条件下灭菌15min；（5）好氧发酵：向酶解后的酶解液中加入酶解液质量比2～3%的复合微生物菌剂，在28～35℃条件下好氧发酵6～12h；所述复合微生物菌剂为黑曲霉、酿酒酵母和地衣芽孢杆菌的混合菌，其接种量量比为1:2:1；（6）厌氧发酵：好氧发酵结束后加入1～2%的乳酸杆菌粉，在28～35℃条件下厌氧发酵8～16h；（7）过滤：进行粗过滤除去发酵菌体；（8）离心：以10000r/min速率离心分离，分离上清液；（9）陈酿：为促进饮品的稳定和澄清，在0～10℃条件下陈酿10～20d；（10）复配：加入1.5g/l木糖醇、2g/l低聚异麦芽糖、5g/l柠檬酸、5g/l乳酸钙、3g/l蔗糖；（11）膜过滤：用孔径为0.15μm的微孔膜过滤鲨鱼软骨粉保健饮品；（12）无菌灌装：在无菌灌装生产线中灌装封口制得复合发酵型鲨鱼软骨粉保健饮品。实施例3一种复合发酵型鲨鱼软骨粉保健饮品，具体工艺步骤包括：（1）配料：按鲨鱼软骨粉100份、葛根5份、石斛1份比例准确配伍原料（2）中草药预处理：将葛根和石斛原料清除杂质后粉碎，过80-150目筛，然后加入中草药原料质量比10倍的纯净水，在40～60℃条件下浸泡30min；加入中草药原料质量比2%的纤维素酶，在微波辅助提取2min，微波功率为250～400w，然后静置30min以上；（3）发酵液制备：将粉碎后的鲨鱼软骨粉与预处理后的中草药原料混合，加入20倍的纯净水，然后加入发酵液质量比0.15～0.20%(nh4)2so4、0.10～0.15%kh2po4、0.1%mgso4；（4）灭菌：在121℃条件下灭菌15min；（5）好氧发酵：向酶解后的酶解液中加入酶解液质量比2～3%的复合微生物菌剂，在28～35℃条件下好氧发酵6～12h；所述复合微生物菌剂为黑曲霉、酿酒酵母和地衣芽孢杆菌的混合菌，其接种量量比为1:2:1；（6）厌氧发酵：好氧发酵结束后加入1～2%的乳酸杆菌粉，在28～35℃条件下厌氧发酵8～16h；（7）过滤：进行粗过滤除去发酵菌体；（8）离心：以10000r/min速率离心分离，分离上清液；（9）陈酿：为促进饮品的稳定和澄清，在0～10℃条件下陈酿10～20d；（10）复配：加入1.5g/l木糖醇、2g/l低聚异麦芽糖、5g/l柠檬酸、5g/l乳酸钙、3g/l蔗糖；（11）膜过滤：用孔径为0.15μm的微孔膜过滤鲨鱼软骨粉保健饮品；（12）无菌灌装：在无菌灌装生产线中灌装封口制得复合发酵型鲨鱼软骨粉保健饮品。实施例4不同工艺条件对鲨鱼软骨粉保健饮品免疫增强能力的影响1、指标测定方法根据张秀娟等《鲨鱼软骨粉对s180荷瘤小鼠免疫细胞调节功能的影响》文中所述试验方法测定本申请保健饮品对对s180荷瘤小鼠脾淋巴细胞增殖功能和吞噬细胞吞噬活性的影响。2、试验方法及分组小鼠随机分成10组,保健饮品灌胃给予100mg·kg-1，阴性对照组给予同体积生理盐水,每组10只。无菌抽取接种第7天的生长良好的s180荷瘤小鼠腹水(活细胞数>97%),生理盐水1∶3稀释,按0.2ml/只,小鼠右前腋皮下接种。接种24h后给药,1次/d,连续给药10d,停药次日眼球采血；分组方法为：实施例1-3组分别灌胃实施例1-3所述保健饮品；对照1组灌胃实施例1中未经厌氧发酵的保健饮品；对照2组灌胃实施例1中未经好氧发酵的保健饮品；对照3组灌胃实施例2中未经厌氧发酵的保健饮品；对照4组灌胃实施例2中未经好氧发酵的保健饮品；对照5组灌胃实施例3中未经厌氧发酵的保健饮品；对照6组灌胃实施例3中未经好氧发酵的保健饮品；试验方法均相同。3、试验结果表2不同工艺条件对鲨鱼软骨粉保健饮品营养保健能力的影响试验组别a570值a490值阴性对照组0.27620.8137实施例1试验组0.56791.4928实施例2试验组0.48311.4015实施例3试验组0.45961.3724对照1组0.46731.1564对照2组0.31490.9742对照3组0.49641.2163对照4组0.33161.0012对照5组0.48301.1936对照6组0.32980.9895实施例4试验结果表明，中草药原料间的配伍及发酵菌种间的协同作用对复方鲨鱼软骨粉保健饮品营养保健性能有着显著的影响。以上实施例仅用于说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对被发明进行了详细的说明，但对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而对这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。当前第1页12