一种利用黑曲霉液体发酵制备苦荞可溶性膳食纤维的方法与流程

本发明属于食品加工领域，具体涉及一种利用黑曲霉液体发酵苦荞制取可溶性膳食纤维的方法。

背景技术：

苦荞(tartarybuckwheat)，属于荞麦的一种，是一种重要的食药两用杂粮。苦荞含有丰富的蛋白质和氨基酸，如天门冬氨酸在苦荞中含量很高，非常容易被人体所吸收，且在抗疲劳方面也发挥着作用；苦荞中矿质元素丰富，尤其是微量元素硒，可增强免疫力、解毒排毒；苦荞中富含大量维生素，如维生素p(芦丁)是一种重要的活性成分，是清除自由基的强氧化剂。苦荞中膳食纤维含量丰富，在抗氧化、调节糖脂代谢等方面发挥重要的作用。总之，苦荞在抗氧化、降糖降脂、抗菌抗炎、防癌抑癌等多方面都发挥着重要的作用。

如今，膳食纤维已被称为“第七营养素”。中国卫生管理词典上定义膳食纤维又称食物纤维，是植物性食物中含有的一些不能为人体消化酶所分解的食物成分，它们虽不能被机体消化吸收进入新陈代谢，但为维持身体健康所必需。通常情况下，根据其溶解性，膳食纤维分为可溶性膳食纤维(sdf)和不溶性膳食纤维(idf)。膳食纤维在治疗和预防疾病中发挥着重要的作用，如调节血糖血脂水平、抗动脉粥样硬化、增加肠道蠕动性、预防糖尿病、结肠癌、心血管疾病等。饮食中合理的增加膳食纤维的摄入量，对于维持机体健康有积极作用。

目前报道的提取膳食纤维中可溶性膳食纤维含量的方法有很多，如化学法、酶解法、生物发酵法、物理法和联合处理法。发酵法因其成本低、操作易、产率高等特点成为目前膳食纤维改性的有效方法之一。它在提高膳食纤维中可溶性膳食纤维含量的同时，可改善膳食纤维的理化性质，如持水力、持油力、葡萄糖吸附能力等。

黑曲霉(aspergillusniger)，半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，丛梗孢科。黑曲霉是国际公认的可用于食品生产的安全菌株，它在发酵过程中能产生纤维素酶、果胶酶等丰富的酶系，可更好的作用于底物，将大分子纤维素降解成较小分子物质，提高可溶性膳食纤维的含量，同时优化可溶性膳食纤维的物化性质。

技术实现要素：

本发明通过对大量不同的菌种(如黑曲霉、绿色木霉、食药用菌等)进行筛选，发现食药用菌发酵几乎不提高苦荞可溶性膳食纤维(sdf)含量；绿色木霉发酵苦荞可溶性膳食纤维(sdf)可提升5％～8％；而一种黑曲霉(cgmcc3.11455)，其液体发酵苦荞能够显著提高可溶性膳食纤维(sdf)的含量，可提升18％～25％，因此最终利用一种黑曲霉(cgmcc3.11455)液体发酵苦荞，不仅能够显著提高可溶性膳食纤维(sdf)的含量，而且是一种操作简单、成本低的制备新方法。

本发明利用黑曲霉液体发酵苦荞制取可溶性膳食纤维的方法，包括如下步骤：

步骤1：菌种活化

在原黑曲霉菌种斜面试管中取约0.8cm×0.8cm大小的菌种接种到新的霉菌固体斜面培养基中，28℃培养10d即可长满整个斜面。不用时4℃保藏，每三个月需转接一次。

步骤2：母种培养

取一管霉菌培养基，用无菌水淋洗斜面，制成浓度为10⁸cfu/ml的孢子悬液；吸取1ml该孢子悬液于装有121℃灭菌15min的100ml种子培养基的250ml三角瓶中，摇床26℃、150r/min下活化培养48h，无菌条件下用4层纱布过滤掉菌丝体，调整制成浓度为10⁸cfu/ml的黑曲霉母种培养液。

步骤3：发酵培养液的制备

接种8～12％的黑曲霉母种培养液至苦荞液体培养基中，摇床培养，培养温度26℃，培养时间48h，摇床转速150r/min。

步骤4：可溶性膳食纤维粉的制备

将发酵后的产物于121℃灭菌15min，冷却，依次在95℃、ph6.0条件下加入0.01ml/g耐高温的α-淀粉酶酶解35min、60℃、ph7.0条件下加入0.05ml/g中性蛋白酶酶解30min、60℃、ph4.5条件下加入0.05ml/g葡萄糖苷酶酶解30min，结束后煮沸灭活备用；8000r/min条件下离心，收集上清液，将上清液旋蒸浓缩至原体积的一半，加入4倍体积的预热60℃的95％乙醇，静置过夜，离心分离，收集沉淀，冷冻干燥后即得苦荞可溶性膳食纤维。发酵处理后的可溶性膳食纤维的含量相较于未发酵可增加18％～25％。

步骤1中，所述霉菌固体斜面培养基的成分构成如下：葡萄糖1％、蛋白胨1％、酵母粉(市购)0.5％、琼脂2％、ph自然。具体配制时，称取葡萄糖10g、蛋白胨10g、酵母粉5g于1l的烧杯中，煮沸后缓慢加入琼脂20g，完全溶解后定容至1l；趁热分装至试管中，每个试管中加入约三分之一的量，加塞密封，121℃灭菌15min，灭菌后拿出摆斜面冷却备用。所述霉菌固体斜面培养基在接种前先置于26℃恒温培养箱观察3d，没有杂菌即可进行接种。

步骤1中，所述黑曲霉菌种购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(cgmcc)，菌株编号3.11455，保存于生态工程与生物技术安徽省重点实验室(安徽大学)。黑曲霉菌种保藏在霉菌固体斜面培养基中。

步骤2中，所述种子培养基的成分构成如下：马铃薯20％、葡萄糖2％、mgso40.2％、kh2o40.4％、酵母粉0.4％。具体配制时，马铃薯去皮，称重200g，切成小粒煮沸，纱布过滤，再加葡萄糖20g、mgso42g、kh2o44g、酵母粉4g，加热溶解，补足水至1l，分装至250ml三角瓶中，密封，121℃灭菌15min，冷却备用。

步骤3中，所述苦荞液体培养基的成分构成如下：苦荞50g/l，k2ho42g/l，蛋白胨0.5g/l，cacl20.3g/l，mgso4·7h2o0.3g/l，cmc-na10g/l，feso4·7h2o0.0015g/l，mnso4·h2o0.0016g/l，znso4·7h2o0.0015g/l，cocl20.002g/l；加热溶解，搅拌混匀后密封，121℃灭菌15min，冷却备用。所述苦荞预先于50℃干燥、粉碎并过60目筛。

本发明以苦荞为原料，液体发酵制备成品苦荞可溶性膳食纤维。相较于未发酵而言，发酵处理可使苦荞可溶性膳食纤维含量增加18％～25％。本发明利用黑曲霉液体发酵过程中产生大量纤维素酶、果胶酶等酶系，不仅促进苦荞可溶性膳食纤维的溶出，而且具备操作简单、成本低等特点，可为苦荞可溶性膳食纤维的功能食品开发利用提供新的途径。

附图说明

图1是不同接种量下的苦荞sdf得率。由图1可看出，随着接种量的增加，苦荞sdf的得率呈现出先上升后下降并趋于稳定的趋势，这说明液体发酵处理可明显增加苦荞sdf得率。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明技术方案进行详细的说明，实施例仅是本发明的优选实施方式，不是对本发明的限定。

实施例1：

制备霉菌固体斜面培养基：黑曲霉菌种保藏在霉菌固体斜面培养基中。霉菌培养基成分16为：葡萄糖1％、蛋白胨1％、酵母粉0.5％、琼脂2％、ph自然。葡萄糖10g、蛋白胨10g、酵母粉5g于1l的烧杯中，煮沸后缓慢加入琼脂20g，完全溶解后定容至1l。趁热分装至试管中，每个试管中加入约三分之一的量，加塞密封，121℃灭菌15min，灭菌后拿出摆斜面冷却备用。

菌种活化：接种前，先将霉菌固体斜面培养基放入26℃恒温培养箱观察3d，没有杂菌即可进行接种。使用时，在原黑曲霉菌种cgmcc3.11455斜面试管中取约0.8cm×0.8cm大小的菌种接种到新的霉菌斜面固体培养基中，28℃培养10d即可长满整个斜面。

制备母种培养液种子液：取一管霉菌培养基，用无菌水淋洗斜面，制成浓度为10⁸cfu/ml的孢子悬液，吸取1ml该孢子悬液于装有121℃灭菌15min的100ml种子培养基的250ml三角瓶中，种子培养基的具体组成为：马铃薯20％、葡萄糖2％、mgso40.2％、kh2o40.4％、酵母粉0.4％。摇床26℃、150r/min。活化培养48h，无菌条件下，用4层纱布过滤掉菌丝体，调整制成浓度为10⁸cfu/ml的黑曲霉母种培养液。

制备发酵培养液：接种8％黑曲霉母种培养液至干燥、粉碎、过60目筛的苦荞液体培养基中。摇床培养，培养温度26℃，培养时间48h，摇床转速150r/min。

酶解：将发酵后的产物于121℃灭菌15min，冷却，依次在95℃、ph6.0条件下加入0.01ml/g耐高温的α-淀粉酶酶解35min、60℃、ph7.0条件下加入0.05ml/g中性蛋白酶酶解30min、60℃、ph4.5条件下加入0.05ml/g葡萄糖苷酶酶解30min，结束后煮沸灭活，备用。

浓缩醇沉干燥：8000r/min条件下离心，收集上清，将上清旋蒸浓缩至原体积的一半，加入4倍体积预热60℃的95％乙醇，静置过夜，离心分离，收集沉淀，放置于冷冻干燥机里干燥7d。干燥后的固体即为所需的到的苦荞可溶性膳食纤维。发酵处理后的可溶性膳食纤维的含量相较于未发酵可增加19.16％。

实施例2：

制备霉菌固体斜面培养基：黑曲霉菌种保藏在霉菌固体斜面培养基中。霉菌培养基成分为：葡萄糖1％、蛋白胨1％、酵母粉0.5％、琼脂2％、ph自然。葡萄糖10g、蛋白胨10g、酵母粉5g于1l的烧杯中，煮沸后缓慢加入琼脂20g，完全溶解后定容至1l。趁热分装至试管中，每个试管中加入约三分之一的量，加塞密封，121℃灭菌15min，灭菌后拿出摆斜面冷却备用。

菌种活化：接种前，先将霉菌固体斜面培养基放入26℃恒温培养箱观察3d，没有杂菌即可进行接种。使用时，在原黑曲霉菌种cgmcc3.11455斜面试管中取约0.8cm×0.8cm大小的菌种接种到新的霉菌斜面固体培养基中，28℃培养10d即可长满整个斜面。

制备母种培养液种子液：取一管霉菌培养基，用无菌水淋洗斜面，制成浓度为10⁸cfu/ml孢子悬液，吸取1ml该孢子悬液于装有121℃灭菌15min的100ml种子培养基的250ml三角瓶中，种子培养基的具体组成为：马铃薯20％、葡萄糖2％、mgso40.2％、kh2o40.4％、酵母粉0.4％。摇床26℃、150r/min。活化培养48h，无菌条件下，用4层纱布过滤掉菌丝体，调整制成浓度为10⁸cfu/ml的黑曲霉母种培养液。

制备发酵培养液：接种10％母种培养液至干燥、粉碎、过60目筛的苦荞液体培养基中。摇床培养，培养温度26℃，培养时间48h，摇床转速150r/min。

酶解：将发酵后的产物于121℃灭菌15min，冷却，依次在95℃、ph6.0条件下加入0.01ml/g耐高温的α-淀粉酶酶解35min、60℃、ph7.0条件下加入0.05ml/g中性蛋白酶酶解30min、60℃、ph4.5条件下加入0.05ml/g葡萄糖苷酶酶解30min，结束后煮沸灭活，备用。

浓缩醇沉干燥：8000r/min条件下离心，收集上清，将上清旋蒸浓缩至原体积的一半，加入4倍体积预热60℃的95％乙醇，静置过夜，离心分离，收集沉淀，放置于冷冻干燥机里干燥7d。干燥后的固体即为即为所需的到的苦荞可溶性膳食纤维。发酵处理后的可溶性膳食纤维的含量相较于未发酵可增加22.98％。

实施例3：

制备霉菌固体斜面培养基：黑曲霉菌种保藏在霉菌固体斜面培养基中。霉菌培养基成分为：葡萄糖1％、蛋白胨1％、酵母粉0.5％、琼脂2％、ph自然。葡萄糖10g、蛋白胨10g、酵母粉5g于1l的烧杯中，煮沸后缓慢加入琼脂20g，完全溶解后定容至1l。趁热分装至试管中，每个试管中加入约三分之一的量，加塞密封，121℃灭菌15min，灭菌后拿出摆斜面冷却备用。

菌种活化：接种前，先将霉菌固体斜面培养基放入26℃恒温培养箱观察3d，没有杂菌即可进行接种。使用时，在原黑曲霉菌种cgmcc3.11455斜面试管中取约0.8cm×0.8cm大小的菌种接种到新的霉菌斜面固体培养基中，28℃培养10d即可长满整个斜面。

制备母种培养液种子液：取一管霉菌培养基，用无菌水淋洗斜面，制成浓度为10⁸cfu/ml孢子悬液，吸取1ml该孢子悬液于装有121℃灭菌15min的100ml种子培养基的250ml三角瓶中，种子培养基的具体组成为：马铃薯20％、葡萄糖2％、mgso40.2％、kh2o40.4％、酵母粉0.4％。摇床26℃、150r/min。活化培养48h，无菌条件下，用4层纱布过滤掉菌丝体，调整制成浓度为10⁸cfu/ml的黑曲霉母种培养液。

制备发酵培养液：接种12％母种培养液至干燥、粉碎、过60目筛的苦荞液体培养基中。摇床培养，培养温度26℃，培养时间48h，摇床转速150r/min。

酶解：将发酵后的产物于121℃灭菌15min，冷却，依次在95℃、ph6.0条件下加入0.01ml/g耐高温的α-淀粉酶酶解35min、60℃、ph7.0条件下加入0.05ml/g中性蛋白酶酶解30min、60℃、ph4.5条件下加入0.05ml/g葡萄糖苷酶酶解30min，结束后煮沸灭活，备用。

浓缩醇沉干燥：8000r/min条件下离心，收集上清，将上清旋蒸浓缩至原体积的一半，加入4倍体积预热60℃的95％乙醇，静置过夜，离心分离，收集沉淀，放置于冷冻干燥机里干燥7d。干燥后的固体即为所需的到的苦荞可溶性膳食纤维。发酵处理后的可溶性膳食纤维的含量相较于未发酵可增加25.01％。