抗幽门螺旋杆菌的即食型乳酸菌剂及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于食品技术领域，涉及一种乳酸菌剂，具体地说是一种抗幽门螺旋杆菌的即食型乳酸菌剂及其制备方法和应用。


背景技术：

2.幽门螺杆菌在我国人群中的感染率高达50～80％，已经证实与某些消化系统疾病(如胃癌，胃溃疡等)有关。幽门螺杆菌感染会导致患者口腔异味及慢性胃炎，症状表现为口臭、上腹饱胀、反酸、烧心、嗳气、恶心及呕吐等，还有15～20％的患者可能会出现消化性溃疡的一些相关现象，比如饥饿痛及餐后痛等，影响进食，降低患者生活质量。
3.目前，对于幽门螺杆菌感染的治疗，仍以抗生素三联法治疗为主，即采用质子泵抑制剂(ppi)和两种抗生素联用或是铋盐结合两种抗生素治疗，常用的抗生素药物是阿莫西林，克拉霉素和甲硝唑等。虽然三联法治疗的治愈率可达90％以上，但仍存在一些问题：如抗生素会引起胃肠道微生态环境紊乱，出现特殊的口气、胃肠道不适，腹部胀痛、恶心难受、腹泻及便秘等一系列消化道病症，甚至发生抗生素相关性肠炎，出现耐药性菌株等更为严重的不良反应，导致治疗反复性。
4.诸多研究表明，将含双歧杆菌及鼠李糖乳杆菌的益生菌制剂应用于胃肠道细菌感染的辅助治疗方案疗效突出。通过益生菌恢复动物体内微生态平衡，达到辅助治疗疾病的目的，益生菌不仅具有促进消化吸收和刺激免疫系统的作用，还能部分替代抗菌药物，具有使用安全、无残留、不产生抗药性等优点。但针对抗幽门螺旋杆菌的特异性菌种的选择及益生菌间的复配仍是极待解决的问题。


技术实现要素：

5.本发明的目的，是要提供一种抗幽门螺旋杆菌的即食型乳酸菌剂，以达到辅助抗幽门螺旋杆菌治疗并缓解抗生素治疗带来的口腔异味不良反应的目的；
6.本发明的另一个目的，是要提供上述抗幽门螺旋杆菌的即食型乳酸菌剂的一种制备方法。
7.本发明的还有一个目的，是要提供上述抗幽门螺旋杆菌的即食型乳酸菌剂在制备食品、保健品、药物、药物组合物中的应用。
8.为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
9.一种抗幽门螺旋杆菌的即食型乳酸菌剂，以重量份数计，制成其有效成分的原料包括：
10.副干酪乳杆菌n1115菌粉2～3份、植物乳杆菌n3117菌粉2～3份、动物双歧杆菌乳亚种i797菌粉3～4份、鼠李糖乳杆菌x253菌粉3～4份、低聚果糖10～40份、麦芽糊精10～40份及乳糖醇10～20份。
11.作为一种限定，所述原料还包括风味粉2～5份。
12.作为进一步限定，所述风味粉为水果粉。
13.其中，风味粉包括水果粉蔬菜粉等，起调味作用，增加产品风味。
14.水果粉为速溶水果粉，是食品加工领域常用组分，取果肉榨得果汁后，分离果汁与果渣，用3倍体积的25％乙醇除杂，得滤汁，将滤汁浓缩结晶后研磨得果汁粉；取果渣干燥粉碎得果渣粉，取果汁粉与果渣粉混匀过筛即得水果粉。
15.作为另一种限定，所述副干酪乳杆菌n1115菌粉和植物乳杆菌n3117菌粉的含菌量均≥1
×
108cfu/g；所述动物双歧杆菌乳亚种i797菌粉和鼠李糖乳杆菌x253菌粉的含量均≥0.8
×
108cfu/g。
16.副干酪乳杆菌n1115菌株已于2011年3月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏编号：cgmcc no.4691，拉丁文名称是lactobacillus paracasei n1115，其在专利号为201110357058.8的中国发明专利中首次公开；
17.植物乳杆菌n3117菌株已于2014年12月05日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号为cgmcc no.10133，拉丁文名称是lactobacillus plantarum n3117。
18.动物双歧杆菌乳亚种i797是从婴儿或幼儿肠道菌群中分离筛选出来的，该菌株已于2019年8月20保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为cgmcc no.18403，拉丁文名称是bifidobacterium animalis subsp.lactis，其在申请号为202010259210.8的在线专利申请文件中首次公开。
19.鼠李糖乳杆菌x253是从我国新疆传统发酵乳制品中分离筛选出来的，该菌株己于2019年8月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为cgmcc no.18404，拉丁文名称是lactobacillus rhamnosus，其在申请号为202010258772.0的在线专利申请文件中首次公开；
20.本发明还提供了上述抗幽门螺旋杆菌的即食型乳酸菌剂的一种制备方法，是取所有原料混匀即得。
21.将制得的抗幽门螺旋杆菌的即食型乳酸菌剂通过灌装机灌装、密封，获得2g/条的单独包装乳酸菌剂；经质量检验合格后储藏于阴凉、干燥、通风良好的仓库中，防止高温，仓库温度不高于30℃。
22.作为一种限定，所述原料是经粉碎、过筛所得。
23.本发明也提供了上述抗幽门螺旋杆菌的即食型乳酸菌剂在制备食品、保健品或药物组合物中的应用。应用时将抗幽门螺旋杆菌的即食型乳酸菌剂添加入所制备产品的原料中使用。
24.所述食品为乳制品、调制乳粉、复合益生菌或饮品。
25.所述药物组合物的剂型为胶囊、片剂、丸剂或粉末。
26.由于采用了上述技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的技术进步在于：
27.本发明的抗幽门螺旋杆菌的即食型乳酸菌剂通过合理配比，筛选抗幽门螺旋杆菌的特异性菌种，将副干酪乳杆菌n1115、植物乳杆菌n3117、动物双歧杆菌乳亚种i797和鼠李糖乳杆菌x253四种乳酸菌以特定比例配比，充分利用菌种间的协同增效相互作用；相较于使用单一菌种，抗幽门螺旋杆菌效果显著增强，能够辅助抗幽门螺旋杆菌治疗并缓解抗生素治疗带来的不良反应，可有效改善口腔异味，且胃肠液的耐受及肠道上皮细胞粘附性好；
28.本发明的抗幽门螺旋杆菌的即食型乳酸菌剂风味独特具有丰富的口感；原料来源
广、易获得，制备工艺步骤简单，适于大范围工业生产；
29.本发明的抗幽门螺旋杆菌的即食型乳酸菌剂适用于幽门螺旋杆菌感染人群食用。
具体实施方式
30.下面通过具体实施例对本发明做进一步详细说明，应当理解所描述的实施例仅用于解释本发明，并不限定本发明。
31.实施例1一种抗幽门螺旋杆菌的即食型乳酸菌剂的制备方法
32.本实施例中抗幽门螺旋杆菌的即食型乳酸菌剂的制备方法，包括依次进行的以下步骤：
33.1)菌粉的制备
34.i)取240g酪蛋白胨、240g牛肉膏、120g酵母膏、480g葡萄糖、120g乙酸钠、50g柠檬酸二胺、24g吐温～80、50g k2hpo、3g mgso4·
7h2o、1g mnso4·
7h2o和20kg蒸馏水，混匀制备成mrs液体培养基。
35.取0.2kg的副干酪乳杆菌n1115、植物乳杆菌n3117、动物双歧杆菌乳亚种i797和鼠李糖乳杆菌x253种子液接种至10kg的mrs液体培养基中(鼠李糖乳杆菌x253或动物双歧杆菌乳亚种i797的接种量均为相应mrs液体培养基重量的2％)，37℃增殖培养24h后，所得相应的菌液分别在4℃经12000r/min离心分离10min，除去上清液，取相应下沉物用10kg生理盐水洗涤至菌体洁白，得相应的菌体；
36.ii)取2200g脱脂乳粉、1700g海藻糖、1300g麦芽糊精、300g谷氨酸钠和200g山梨糖醇加至水中，定容至20l，即得冻干保护剂溶液；
37.分别取副干酪乳杆菌n1115、植物乳杆菌n3117、动物双歧杆菌乳亚种i797和鼠李糖乳杆菌x253菌体重悬于10l上述冻干保护剂溶液中混匀，再置于冻干机中进行真空冷冻干燥，所得冻干品经磨粉、过40目筛，收集冻干粉，即为副干酪乳杆菌n1115菌粉、植物乳杆菌n3117菌粉、动物双歧杆菌乳亚种i797菌粉或鼠李糖乳杆菌x253菌粉。
38.经检测，副干酪乳杆菌n1115菌粉和植物乳杆菌n3117菌粉的含菌量均≥1
×
108cfu/g；动物双歧杆菌乳亚种i797菌粉和鼠李糖乳杆菌x253菌粉的含量均≥0.8
×
108cfu/g。
39.2)水果粉的制备
40.按提取橙子果肉，压榨出汁，将果汁与果渣分离；
41.取果汁加入3倍体积的25％乙醇溶液，摇匀混合，过滤絮状物，将滤汁真空浓缩并结晶，研磨成粉末得果汁粉；取果渣通风晾干，在温度为20℃，研成果渣粉，将果汁粉与果渣粉混合过800目筛，混匀即得水果粉，备用。
42.3)抗幽门螺旋杆菌的即食型乳酸菌剂的制备
43.取副干酪乳杆菌n1115菌粉2kg、植物乳杆菌n3117菌粉2kg、动物双歧杆菌乳亚种i797菌粉4kg、鼠李糖乳杆菌x253菌粉4kg、低聚果糖20kg、麦芽糊精30kg、乳糖醇10kg及水果粉2kg，搅拌混匀，过40目筛，通过灌装机灌装、密封，制得2g/条的单独包装的抗幽门螺旋杆菌的即食型乳酸菌剂，标记为j1；经质量检验合格后储藏于阴凉、干燥、通风良好的仓库中，防止高温，仓库温度不高于30℃。
44.经质量检验，抗幽门螺旋杆菌的即食型乳酸菌剂中副干酪乳杆菌n1115、植物乳杆
菌n3117、动物双歧杆菌乳亚种i797和鼠李糖乳杆菌x253的含量均≥1
×
109cfu/g。
45.本实施例制备的抗幽门螺旋杆菌的即食型乳酸菌剂应用时将乳酸菌剂j1添加入所制备乳制品、代餐粉、药物组合物的原料中制备相应产品或撕开即食。
46.实施例2～6抗幽门螺旋杆菌的即食型乳酸菌剂的制备方法
47.实施例2～6分别为一种抗幽门螺旋杆菌的即食型乳酸菌剂的制备方法，它们的步骤与实施例1基本相同，不同之处仅在于原料用量不同，具体详见表1：
48.表1抗幽门螺旋杆菌的即食型乳酸菌剂中的原料用量一览表
[0049][0050]
实施例2～6其它部分的内容，与实施例1相同。
[0051]
对比例1’～5’：对比例1’～5’分别为一种抗幽门螺旋杆菌的即食型乳酸菌剂的制备方法，它们的基本方法和参数与实施例1基本相同，不同之处仅在于原料中菌粉种类不同，具体为：
[0052]
对比例1’不添加任何菌粉，所制得的抗幽门螺旋杆菌的即食型乳酸菌剂标记为d1；
[0053]
对比例2’仅添加鼠李糖乳杆菌x253菌粉，所制得的抗幽门螺旋杆菌的即食型乳酸菌剂标记为d2；
[0054]
对比例3’仅添加副干酪乳杆菌n1115菌粉，所制得的抗幽门螺旋杆菌的即食型乳酸菌剂标记为d3；
[0055]
对比例4’仅添加植物乳杆菌n3117菌粉，所制得的抗幽门螺旋杆菌的即食型乳酸菌剂标记为d4；
[0056]
对比例5’仅添加动物双歧杆菌乳亚种i797菌粉，所制得的抗幽门螺旋杆菌的即食型乳酸菌剂标记为d5。
[0057]
实施例7抗幽门螺旋杆菌的即食型乳酸菌剂的应用
[0058]
将抗幽门螺旋杆菌的即食型乳酸菌剂j1
‑
6分别添加入益生菌奶片原料中，将原料过筛混匀压制成型，用于制备抗幽门螺旋杆菌的益生菌奶片，依次标记益生菌奶片为p1
‑
6；
[0059]
将对比例1’～5’制得的抗幽门螺旋杆菌的即食型乳酸菌剂d1～5分别代替抗幽门螺旋杆菌的即食型乳酸菌剂，分别添加入益生菌奶片原料中，用于制备抗幽门螺旋杆菌的益生菌奶片，依次标记益生菌奶片为dp1～5，其余原料及用量与表2相同。
[0060]
其中上述益生菌奶片原料如表2所示：
[0061]
表2益生菌奶片原料用量一览表
[0062][0063]
实施例8抗幽门螺旋杆菌抑菌实验
[0064]
一、菌粉溶液制备
[0065]
实验分11组进行，分别是克林霉素阳性对照组、4组单一益生菌菌粉组及6组分别按实施例1～6比例混匀的混合益生菌粉组；
[0066]
各组取2g菌粉(或克林霉素)分别与8g无菌纯化水混匀，制成20％浓度的菌粉溶液。
[0067]
二、采用牛津杯双层平板法进行抑菌实验
[0068]
(1)2.0％素琼脂培养基冷却至50℃左右，取10ml倾倒于无菌平皿中混匀铺平，洁净工作台中晾干；
[0069]
(2)无菌镊子取灭菌牛津杯放在倒有素琼脂的平皿中静置10min；
[0070]
(3)将1ml幽门螺旋杆菌或2ml戈登链球菌加入到100ml冷却至50℃的bhi半固体培养基中并充分混匀；
[0071]
(4)在放好牛津杯的平板上倾倒10ml上述bhi半固体培养基，待凝固后，将牛津杯夹出，形成牛津杯孔；
[0072]
(5)在孔中注入100μl的20％浓度的菌粉溶液或克林霉素溶液，于37℃厌氧培养18～20h，设置5组平行实验，用游标卡尺测量抑菌圈直径大小。
[0073]
三、实验结果
[0074]
结果如表3、4所示：
[0075]
表3抑菌实验组别变量及结果表
[0076][0077]
表4抑菌实验组别变量及结果表
[0078][0079]
结果表明，副干酪乳杆菌n1115、植物乳杆菌n3117、动物双歧杆菌乳亚种i797和鼠李糖乳杆菌x253四种乳酸菌以特定比例配比，能充分利用菌种间的协同增效相互作用，相较于使用单一菌种，抑菌圈直径更大，抗幽门螺旋杆菌效果显著增强。
[0080]
实施例9模拟胃肠液的耐受特性实验
[0081]
将待测副干酪乳杆菌n1115、植物乳杆菌n3117、动物双歧杆菌乳亚种i797和鼠李糖乳杆菌x253四种乳酸菌及分别按照实施例1～6比例混合的四种菌株分别进行以下操作：
[0082]
菌株活化3代后得10组菌液，各组菌液分别取1ml，分别置于含9ml过滤除菌处理的ph值为3.0的人工胃液中，震荡均匀并在37℃条件下厌氧培养，在开始培养和培养2h时分别取样，测定其活菌数。然后取在ph值3.0的人工胃液中消化2h后的培养液1ml，分别接种于9ml过滤除菌的ph值为8.0的人工肠液(bile salts(difco)0.9g/100ml)中，继续置37℃下培养，并分别在0h，4h，6h时测定活菌数。计算胃液或肠液存活率及消化液存活率。
[0083]
胃液或肠液存活率(％)＝(cfu n1/cfu n0)
×
100％；
[0084]
式中，n1：经胃液或肠液处理6h的活菌数，n0：经胃液或肠液处理0h的活菌数；
[0085]
消化液存活率就是通过胃液再通过肠液的存活率，计算方法为胃液存活率乘肠液
存活率。
[0086]
结果如表5所示。
[0087]
表5模拟胃液肠液耐受结果
[0088][0089]
结果显示，混合菌株组最终的消化液存活率明显高于单菌株组，可能是由于不同菌株间存在凝集作用，减少了对于酸碱的接触从而起到了一定得协同耐酸碱作用，从而保证了益生菌更容易进入肠道发挥作用。
[0090]
实施例10肠道上皮细胞粘附性实验
[0091]
本实施例对实施例9中制得的五组菌液进行肠道上皮细胞粘附性实验，检测各组菌液菌株粘附作用，具体方法是：
[0092]
将培养好的caco
‑
2细胞进行消化，用dmem的不完全培养液稀释细胞使浓度并计数(约1x105cell/ml)，于co2培养箱中37℃孵育。待细胞长至单层时，无菌pbs洗涤1次，各组培养皿加入1ml各组菌液(1
×
108cfu/ml)，孵育2.5h，用无菌pbs洗涤4次。加入1ml灭菌的1％(v/v)triton
×
100，混匀后静置10min，以裂解细胞。将混合物转移到试管中，经系列稀释后，平板菌落计数。
[0093]
caco
‑
2细胞粘附菌数(个/细胞)＝黏附细菌数/细胞数
[0094]
表6肠道上皮细胞粘附性实验结果
[0095][0096]
肠上皮细胞粘附作用，是益生菌是否能够在人体肠道中长期定植，发挥其与肠道有害菌竞争性占位功能的前提，因此菌株通过混合，各自与不同的肠上皮细胞靶点吸附，同时这四种乳酸菌间也有很好地吸附作用，从而增加了混合菌株组的粘附数量，表6的结果表明，合理配比的副干酪乳杆菌n1115、植物乳杆菌n3117、动物双歧杆菌乳亚种i797和鼠李糖乳杆菌x253四种乳酸菌混合菌株能够更好的在肠道发挥其作用。
[0097]
实施例11口腔异味改善效果实验
[0098]
招募110名受试者，每组10人，采用问卷调查的方式对实施例7制得的抗幽门螺旋杆菌的益生菌奶片为dp1～5及p1～6分别进行试吃实验，检测应用本发明的方法制得的益生菌奶片对口腔异味的改善效果。
[0099]
每两周向所有受试者发放两周内使用数量的益生菌奶片，确保受试者一日三次、一次1片(0.8g/片)，将片剂置于口中含服，在口腔中至少保持2
‑
3min后咽下；每日早、中、晚餐30min后各食用一次，食用半小时内不刷牙、不进食、不漱口；食用期间按原有习惯保持口腔卫生，不使用含氟牙膏。
[0100]
每周向受试者发放调查问卷，调查指标包括：
[0101]
①
口腔异味a评分(自我评价)
[0102]
每周填写问卷前，闭口1分钟左右，手合拢成封闭的碗装，将鼻子和嘴巴同时捂住，然后呼出气息直接判断并对异味进行打分：0分表示口腔无异味；1分表示几乎闻不到异味；2分表示口腔异味轻；3分表示口腔异味；4分表示强烈的异味；5分表示难以忍受的异味。
[0103]
②
口腔异味b评分(他人评价)
[0104]
对一周内他人对自我口腔异味的反应情况进行统计，并根据他人的反应频率进行打分：0分表示从不；1分表示很少；2分表示有时；3分表示经常；4分表示总是。
[0105]
收集调查问卷并整理数据，结果如表7、8所示：
[0106]
表7口腔异味调查问卷结果统计表
[0107][0108][0109]
表8口腔异味调查问卷结果统计表
[0110][0111]
注：以上数据表示方式为均数
±
标准偏差；“*”表示数据在p＜0.05下显著水平，“**”表示数据在p<0.01下显著水平，与试用前相比有统计学差异；“a”、“b”表示组间数据具有显著差异，p＜0.05。
[0112]
结果表明，组内比较结果显示，与试用前的第0周相比，第4周仅含鼠李糖乳杆菌x253、仅含植物乳杆菌n3117和混合菌组口腔异味a评分显著降低(p<0.05)，仅含副干酪乳杆菌n1115和仅含动物双歧杆菌乳亚种i797组评分均有降低趋势，但结果不具备显著性差异(p>0.05)；组间比较结果显示，试用前各组间口腔异味a评分无显著差异(p>0.05)，第4周混合菌组口腔异味a评分显著低于其余组(p<0.05)。以上结果说明，试用含片四周后，受试人群的口腔异味a程度较试用前显著改善，对照组、n1115、i797组有所改善，但结果并不显著；n3117、x253和等比例混合组改善效果明显，尤其等比例混合组改善效果显著强于其他组。表示x253、n3117对改善口腔异味a作用显著且混合比例组出现了协同作用。
[0113]
组内比较结果显示，与试用前相比，第4周仅含鼠李糖乳杆菌x253、仅含植物乳杆菌n3117和混合菌组口腔异味b的评分均极显著降低(p<0.01)，不含菌的对照组无显著性差异(p>0.05)；组间比较结果显示，试用前及第4周各组间口腔异味b评分均无显著差异(p>0.05)，但第4周混合菌组评分最低，这一结果说明，混合菌组受试者的口腔异味b程度较试用前均表现出了极显著改善效果，表示等比例混合组相较其他组起效抑制口腔异味作用更明显。
[0114]
综上，通过菌株特定组合的方式，菌株间互作提高了抑制幽门螺旋杆菌的能力，同时对于口腔异味和肠道粘附功能均具有协同作用，对于协助抗幽门治疗以及缓解服用抗生素带来的口腔异味，肠道不适具有良好的改善功能。
[0115]
需要说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域技术人员来说，其依然可以对
上述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明权利要求保护的范围之内。