一种能够提高红螯光壳螯虾低温环境下抗应激能力的饲料

1.本发明涉及水产增养殖技术领域，更具体地涉及一种能够提高红螯光壳螯虾低温环境下抗应激能力的饲料。


背景技术：

2.温度是影响变温水生动物生理生化反应的重要环境因子，季节变化引起的水温变化是影响水生生物生理生化变化最重要的原因。温度的变化对水生动物的摄食、生长、存活等都具有重要影响，变化的环境温度会对水生动物产生一定的环境压力，为了应对这种压力，水生动物会调节自身的代谢反应来应对这种改变，当自身的调节不足以应对环境改变带来的压力时，水生动物就会产生一系列的病理反应，甚至死亡。红螯光壳螯虾原产自澳大利亚，1992年开始引入我国，在我国广东珠海及长三角地区进行试养，该虾具有个体大、生长速度快、抗病力强等养殖优势，具有广阔的经济前景。但由于红螯光壳螯虾是温水养殖虾，因此其具有不耐低温的生理特点。
3.低温、缺氧、亚硝酸盐胁迫等不良环境会对水生动物造成应激反应，进而影响其生长、存活及免疫等。利用营养学方法提高水产动物的免疫力和抗病力,是实现健康养殖、生产绿色水产品和保证水产养殖业可持续发展的重要途径。目前,水产动物营养与免疫的研究在鱼类中较多，在虾蟹中的研究也正逐渐展开。较常见的免疫添加剂包括一些抗氧化剂如vc、ve、硒、谷胱甘肽等。脂肪酸作为水生动物必需的能量来源和营养物质之一,在机体内具有重要的生物学作用和生理学调控功能。已有研究表明,饵料中的脂肪酸影响鱼类在应激条件下的抗应激能力。脂肪酸还是构成生物膜的主要成分之一，细胞膜中不饱和脂肪酸含量的变化可以调节细胞膜的流动性，当细胞膜中不饱和脂肪酸含量增加时，细胞膜的流动性也随之增加，生物体常通过调节细胞膜中不饱和脂肪酸含量的变化来维持温度、盐度等环境变化引起的细胞膜流动性的改变。有关红螯光壳螯虾生长过程中脂质需求的研究已经有过一些报道，但其在低温等不良环境下营养需求的研究尚未见报道。


技术实现要素：

4.本发明的组合物及红螯光壳螯虾的饲料配方，有效提高红螯光壳螯虾提高抵御低温能力，如提高肝胰腺、血淋巴和/或鳃组织中的抗氧化酶活性和免疫酶活性，并降低转氨酶活性，从而减少低温环境对红螯光壳螯虾的不良影响。
5.本发明的第一方面，提供了一种组合物在制备提高红螯光壳螯虾抵御低温能力的饲料中的用途，所述组合物包含鱼油和大豆油，并且鱼油和大豆油的质量比为3:1-1:2。
6.在另一优选例中，所述鱼油和大豆油的质量比为2:1。
7.在另一优选例中，所述提高抵御低温能力包括：提高抗氧化酶活性、提高免疫酶活性、降低血淋巴中转氨酶活性。
8.在另一优选例中，提高抗氧化酶活性包括提高sod酶活性、提高gpx酶活性、和/或提高总抗氧化酶活性；和/或提高抗氧化酶活性包括提高肝胰腺、血淋巴和/或鳃组织中的
抗氧化酶活性。
9.在另一优选例中，提高免疫酶活性包括提高akp酶活性和/或acp酶活性；和/或提高免疫酶活性包括提高肝胰腺、血淋巴和/或鳃组织中的免疫酶活性。
10.在另一优选例中，降低转氨酶活性包括降低gop酶活性和/或gpt酶活性。
11.在另一优选例中，所述低温为20℃及以下，优选地为15℃及以下，更优选地为9℃及以下。
12.在另一优选例中，所述组合物在饲料中的质量百分比为2-10％，优选地6％。
13.本发明还提供了一种组合物用于提高红螯光壳螯虾抵御低温能力的用途，所述组合物包含鱼油和大豆油，并且鱼油和大豆油的质量比为3:1-1:2，优选地2:1。
14.本发明的第二方面，提供了一种提高红螯光壳螯虾抵御低温能力的饲料，所述饲料的组分以及各组分的质量百分比包括：酪蛋白40-50％，明胶6-10％，鱼油和大豆油的组合物2-10％，玉米淀粉25-30％，复合维生素2％，复合矿物质2％，甜菜碱0-0.8％，氯化胆碱0.3-0.8％，胆固醇0-0.8％，羧甲基纤维1-4％，α-纤维素余量，其中所述鱼油和大豆油的质量比为3:1-1:2。
15.在另一优选例中，所述饲料的组分以及各组分的质量百分比包括：酪蛋白40-50％，明胶6-10％，鱼油和大豆油的组合物2-10％，玉米淀粉25-30％，复合维生素2％，复合矿物质2％，甜菜碱0-0.8％，氯化胆碱0.3-0.8％，胆固醇0-0.8％，羧甲基纤维1-4％，α-纤维素余量，其中所述鱼油和大豆油的质量比为2:1。
16.在另一优选例中，所述饲料的组分及各组分的质量百分比包括：酪蛋白45％，明胶8％，鱼油4％，豆油2％，玉米淀粉26％，复合维生素2％，复合矿物质2％，甜菜碱0.5％，氯化胆碱0.5％，胆固醇0.5％，羧甲基纤维2％，α-纤维素余量。
17.应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
18.图1为不同含量高不饱和脂肪酸对低温下红螯光壳螯虾肝胰腺抗氧化的影响。其中a为肝胰腺sod酶活性变化；b为肝胰腺gpx酶活性变化；c为肝胰腺总抗氧化酶活性变化；d为肝胰腺mda含量。1-4分别表示group 1-4,即所投喂饲料分别为100％鱼油(fo)，鱼油与豆油比为2:1(so33)，鱼油与豆油比为1:2(so67)以及100％豆油(so)。不同字母代表差异显著(p《0.05)。
19.图2为不同含量高不饱和脂肪酸对低温下红螯光壳螯虾血淋巴抗氧化的影响。其中a为血淋巴sod酶活性变化；b为血淋巴gpx酶活性变化；c为血淋巴总抗氧化酶活性变化；d为血淋巴mda含量。1-4分别表示group 1-4,即所投喂饲料分别为100％鱼油(fo)，鱼油与豆油比为2:1(so33)，鱼油与豆油比为1:2(so67)以及100％豆油(so)。不同字母代表差异显著(p《0.05)。
20.图3为不同含量高不饱和脂肪酸对低温下红螯光壳螯虾鳃组织抗氧化的影响。其中a为鳃组织sod酶活性变化；b为鳃组织gpx酶活性变化；c为鳃组织总抗氧化酶活性变化；d为鳃组织mda含量。1-4分别表示group 1-4,即所投喂饲料分别为100％鱼油(fo)，鱼油与豆
油比为2:1(so33)，鱼油与豆油比为1:2(so67)以及100％豆油(so)。不同字母代表差异显著(p《0.05)。
21.图4为不同含量高不饱和脂肪酸对低温下红螯光壳螯虾肝胰腺碱性磷酸酶和酸性磷酸酶活性的影响。其中a为肝胰腺akp酶活性变化；b为肝胰腺acp酶活性变化。1-4分别表示group 1-4,即所投喂饲料分别为100％鱼油(fo)，鱼油与豆油比为2:1(so33)，鱼油与豆油比为1:2(so67)以及100％豆油(so)。不同字母代表差异显著(p《0.05)。
22.图5为不同含量高不饱和脂肪酸对低温下红螯光壳螯虾血淋巴碱性磷酸酶和酸性磷酸酶活性的影响。其中a为血淋巴akp酶活性变化；b为血淋巴acp酶活性变化。1-4分别表示group 1-4,即所投喂饲料分别为100％鱼油(fo)，鱼油与豆油比为2:1(so33)，鱼油与豆油比为1:2(so67)以及100％豆油(so)。不同字母代表差异显著(p《0.05)。
23.图6为不同含量高不饱和脂肪酸对低温下红螯光壳螯虾鳃组织碱性磷酸酶和酸性磷酸酶活性的影响。其中a为鳃组织akp酶活性变化；b为鳃组织acp酶活性变化。1-4分别表示group 1-4,即所投喂饲料分别为100％鱼油(fo)，鱼油与豆油比为2:1(so33)，鱼油与豆油比为1:2(so67)以及100％豆油(so)。不同字母代表差异显著(p《0.05)。
24.图7为不同含量高不饱和脂肪酸对低温下红螯光壳螯虾血淋巴转氨酶活性的影响。其中a为血淋巴中gop酶活性变化；b为血淋巴中gpt酶活性变化。1-4分别表示group 1-4,即所投喂饲料分别为100％鱼油(fo)，鱼油与豆油比为2:1(so33)，鱼油与豆油比为1:2(so67)以及100％豆油(so)。不同字母代表差异显著(p《0.05)。
具体实施方式
25.为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本技术中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。
26.术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。
27.本发明的组合物指包含鱼油和大豆油的组合物，并且所述鱼油和大豆油的质量比为3:1-1:2，优选地2:1。
28.本发明所述的“提高抵御低温能力”指的是提高海水养殖动物(优选地红螯光壳螯虾)的低温抗应激能力。
29.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(new york:cold spring harbor laboratory press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
30.通用方法
31.1.实验饲料
32.本发明实验用饲料为半纯化饲料，蛋白源选用酪蛋白(甘肃华羚酪蛋白股份有限公司)和明胶(国药试剂)，脂肪源选用鱼油(厦门新沙药业有限公司)和豆油(国家金龙鱼业有限公司)，糖源选用玉米淀粉(昆山臻乐门食品有限公司)，多矿和多维选用虾用预混料
(浙江民生生物科技有限公司)，具体成分见表1。分别调节鱼油和豆油的比例，配制四种不同脂肪酸含量的饲料，其脂肪源组成分别为：100％鱼油(fo)、鱼油与豆油比为2:1(so33)、鱼油与豆油比为1:2(so67)以及100％豆油(so)。所有原料粉碎后均过80目筛，然后逐级放大混匀，后用绞肉机制成直径为3mm大小的颗粒饲料，自然风干后储存于-20℃冰箱。各组饲料中不饱和脂肪酸的组成见表2。
33.表1不同实验组中饲料各组分
[0034][0035]a由浙江民生生物科技有限公司提供
[0036]
表2不同组饲料中脂肪酸含量的组成
[0037][0038]
a sfa:14:0,15:0,16:0,17:0,18:0,20:0.
[0039]
b mufa:16:1,17:1 18:1n-9,20:1n-9,22:1n-9,c24:1n-9.
[0040]
c pufa:18:2n-6,18:3n-3,20:2,22:2.
[0041]
d hufa:20:3n-6,20:5n-3,22:6n-3.
[0042]
e n-3fa:18:3n-3,20:5n-3,22:6n-3.
[0043]
f n-6fa:18:2n-6,20:3n-6.
[0044]
2.实验用虾的养殖
[0045]
养殖实验在上海市金山漕泾特种水产养殖基地进行，实验用虾取自养殖基地螯虾
养殖塘，选取400只附肢完整、大小均一的螯虾进行暂养，暂养时水温保持25
±
1℃，连续充氧，养殖用水为曝气48h以上的自来水，ph为7-8，暂养期间投喂商业饲料。暂养一周后，选取320活力强的螯虾进行养殖实验，每个养殖箱放入10只螯虾，实验共分为4组，每组8个重复，分别投喂四种不同脂防酸含量的饲料，4组饲料中脂肪源组成分别为100％鱼油(fo)、鱼油与豆油比为2:1(so33)、鱼油与豆油比为1:2(so67)以及100％豆油(so)，所投喂的鳌虾组分别命名为group 1-4。养殖用箱大小为长
×
宽
×
高＝66
×
45
×
36cm，初始体重为34.63
±
3.96g，箱中放入pvc管作为遮蔽和螯虾栖息场所。每天上午8:00和下午5:00投喂两次饲料，投喂量为虾体重的3％左右，其余养殖条件与暂养期间相同，每天吸走粪便和残饵后换水，换水量为总水量的1/3，投喂周期为4周。4周结束后开始低温胁迫实验，将4个饲料组中的虾再分别分为4个温度组，其中一组作为对照组，另外三组以1℃/12h的速度进行降温，使最后的养殖温度分别为25
±
1℃、20
±
1℃、15
±
1℃和自然低温，每个温度组两个重复，进行四周的温度胁迫实验，水温的调节方式为用加热棒控制，自然低温组不放置加热棒，当水温低于7℃时，适当加温并加泡沫箱进行保温，使其温度保持在9
±
2℃。饲料的投喂方式与前4周相同，投喂量根据每组虾的摄食量进行调整，保证每组虾均为饱食投喂，其中自然低温组不投喂饲料。
[0046]
3.样品的采集
[0047]
8周实验结束后，饥饿处理24h，之后进行称重计数。于每缸中随机选取三只处于蜕壳间期的虾，冰浴麻醉后抽取血淋巴，抗凝剂(柠檬酸钠3.52g；柠檬酸8.42；nacl 8.96g；edta-2na 0.74g；双蒸水200ml；ph 7.3-7.4)与血淋巴的比例为1:1，其中一部分用于血细胞计数，另一部分4000rpm，4℃离心15min，分离血细胞和血清，用于后续的实验。分别取肝胰腺、胃、肠、肌肉等组织于离心管中，迅速放入液氮速冻，后放于-80℃冰箱长期保存。存活率和肝体指数用以下公式进行计算：
[0048]
存活率(survival,％)＝100
×
(实验结束时放虾尾数/实验开始时放虾尾数)；
[0049]
肝体指数(his,％)＝100
×
肝脏鲜重/虾体重。
[0050]
4.酶活性的测定
[0051]
称取肝胰腺组织0.1g，按1:9的比例加入无菌预冷的0.86％的生理盐水，冰浴匀浆，然后将样品置于冷冻离心机内4℃，3500rpm离心15分钟，吸取上清于新的离心管中。所有上清液先用考马斯亮蓝法检测其蛋白浓度而后再测其它酶的活性。所有酶活力测定试剂盒均购于南京建成生物工程研究所，测定具体方法详见说明书，所有组织匀浆的酶活性均在两周内测定完毕。
[0052]
5.数据统计与分析
[0053]
实验所得数据以平均值(mean,m)
±
标准差(stdeva,sd)表示，所得数据采用spss 19软件进行统计分析。不同饲料投喂及不同温度组的生长、存活和相关酶活力的差异，同时采用双因素方差分析方法(two-way anova)分析法进行显著性检验，以p《0.05作为显著性差异。
[0054]
实施例1.饲料中添加不同含量不饱和脂肪酸对不同温度下红螯光壳螯虾抗氧化酶活性的影响
[0055]
分别投喂表1中的四种不同脂防酸含量的饲料4周后，开始低温胁迫实验，将4个饲料组中的虾再分别分为4个温度组，其中一组作为对照组，另外三组以1℃/12h的速度进行
降温，使最后的养殖温度分别为25
±
1℃、20
±
1℃、15
±
1℃和自然低温，每个温度组两个重复，进行四周的温度胁迫实验。在温度胁迫后检测红螯光壳螯虾肝胰腺、血淋巴和鳃组织中抗氧化酶活性及mda含量。
[0056]
1.饲料中添加不同含量不饱和脂肪酸对不同温度下红螯光壳螯虾肝胰腺中抗氧化酶活性及mda含量的影响
[0057]
肝胰腺sod酶活性变化如图1a所示，双因素方差分析结果显示，sod酶活性仅受温度变化影响，高不饱和脂肪酸含量变化对其无显著影响，不同组中sod酶活性均随着温度的降低而呈下降趋势，其中9℃与其余各组相比sod酶活性均显著降低(p《0.05)。
[0058]
肝胰腺gpx酶活性变化如图1b所示，双因素方差结果显示，温度变化和高不饱和脂肪酸含量的变化均对红螯光壳螯虾肝胰腺gpx活性产生了显著影响，随着温度的降低，gpx酶活性也呈现了不同程度的下降趋势。对同一温度，不同高不饱和脂肪酸添加组进行分析发现，100％鱼油组中gpx酶活性在20℃、15℃和9℃组中与100％豆油组相比出现了显著的升高现象。对于15℃组和9℃组，随着高不饱和脂肪酸添加量越高，肝胰腺gpx酶活性越高，其中group1(100％鱼油组)和group2(鱼油：豆油2:1组)明显高于100％豆油组。
[0059]
肝胰腺总抗氧化酶活性变化如图1c所示，双因素方差结果显示，温度变化和高不饱和脂肪酸含量的变化均对红螯光壳螯虾肝胰腺总抗氧化酶活性产生显著影响，随着温度的降低，总抗氧化酶活性呈逐渐下降趋势。同一温度下不同高不饱和脂肪酸添加水平分析结果显示，在20℃组中，group1(100％鱼油组)、group2(鱼油：豆油2:1组)和group3(鱼油：豆油1:2组)中肝胰腺总抗氧化酶活性与100％豆油组相比显著升高。在15℃组中，100％鱼油组与其余三个添加组相比均显著升高。在9℃组中，100％鱼油组肝胰腺总抗氧化酶活性最高，各个添加组的总抗氧化酶活性无显著差异。
[0060]
肝胰腺mda含量如图1d所示，双因素方差分析结果显示，肝胰腺中mda含量主要受温度变化影响，而不同高不饱和脂肪酸含量对其无显著影响。随着温度的降低，肝胰腺中mda含量呈逐渐升高趋势，其中9℃中mda含量与其余各组相比mda含量显著升高。
[0061]
表3温度和高不饱和脂肪酸含量对红螯光壳螯虾肝胰腺抗氧化双因素方差分析
[0062][0063]
2.饲料中添加不同含量不饱和脂肪酸对不同温度下红螯光壳螯虾血淋巴中抗氧化酶活性及mda含量的影响
[0064]
血淋巴中sod酶活性如图2a所示，双因素方差分析结果显示，血淋巴中sod酶活性既受温度变化影响也受高不饱和脂肪酸添加量的影响。其中100％鱼油添加组各个温度组sod酶活性变化不显著，而鱼油：豆油2:1的添加组中除了20℃中酶活性出现降低外，其余各组间差异不显著。鱼油：豆油为1:2的添加组中9℃组时sod酶活性最低，其余各组间差异不显著。100％豆油组中，除25℃组外，其余各组sod酶活性均显著降低。而在相同温度不同高不饱和脂肪酸组中发现，除了25℃组中sod酶活性无显著变化，其余各温度组中sod酶活性均随着鱼油添加量的减少而呈逐渐降低趋势。尤其是15℃组和9℃组中，100％添加组、鱼油：豆油2:1添加组的血淋巴中sod酶活性显著高于鱼油：豆油1:2添加组和100％豆油组。
[0065]
血淋巴中gpx活性变化如图2b所示，双因素方差分析结果显示，血淋巴中gpx活性只受温度变化的影响，高不饱和脂肪酸添加量对其影响不大。其中各添加组中均以9℃组时gpx酶活性最低，显著低于其余各组(p《0.05)。
[0066]
血淋巴中总抗氧化酶活性变化如图2c所示，双因素方差分析结果显示，温度和高不饱和脂肪酸添加量均对总抗氧化酶活性变化有显著影响，其变化趋势与肝胰腺中总抗氧化酶活性变化趋势相似，即随着温度的降低和鱼油添加量减少，总抗氧化酶活性整体呈下降趋势。
[0067]
血淋巴中mda含量如图2d所示，双因素方差分析结果显示，血淋巴中mda含量仅与温度变化相关，即随着温度的降低，mda含量呈逐渐升高趋势，各个组中均以9℃组中mda含量最高，显著高于其余各组。
[0068]
表4温度和高不饱和脂肪酸含量对红螯光壳螯虾血淋巴抗氧化双因素方差分析
[0069][0070]
3.饲料中添加不同含量不饱和脂肪酸对不同温度下红螯光壳螯虾鳃中抗氧化酶活性及mda含量的影响
[0071]
鳃组织中sod酶活性如图3a所示，双因素方差分析结果显示，鳃组织中sod酶活性仅与温度变化相关，即总体随温度的降低而呈下降趋势，除group 3(鱼油：豆油1:2)外，其余各组均发现，当温度为9℃时，sod酶活性与对照组相比显著降低。
[0072]
鳃组织中gpx酶活性如图3b所示，双因素方差分析结果显示，gpx酶活性仅与温度变化相关，与不饱和脂肪酸添加量无关，且各个温度组与对照组相比其gpx酶活性均显著降低(p《0.05)。
[0073]
鳃组织中总抗氧化酶活性变化如图3c所示，双因素方差分析结果显示，鳃组织中总抗氧化酶活性同时受温度变化和高不饱和脂肪酸添加量变化的影响。温度对其影响与肝胰腺和血淋巴中的变化趋势相似，即在低温组中总抗氧化酶活性降低。在20℃组中，各添加组中总抗氧化酶活性变化无显著差异。而在15℃组中，总抗氧化酶活性随着鱼油添加量的减少而呈逐渐降低趋势，100％鱼油组(group 1)中活性最高，显著高于100％豆油添加组。
[0074]
鳃组织中mda含量如图3d所示，双因素方差分析结果显示，鳃组织中mda的积累量与不饱和脂肪酸的添加量无显著差异，仅与温度变化相关，且在所有营养组中均发现，在最低温度组中，mda含量与对照组相比均显著升高(p《0.05)。
[0075]
表5温度和高不饱和脂肪酸含量对红螯光壳螯虾鳃组织抗氧化双因素方差分析
[0076][0077]
实施例2.饲料中添加不同含量不饱和脂肪酸对不同温度下红螯光壳螯虾免疫酶活性的影响
[0078]
实验方法同实施例1，并在温度胁迫后检测红螯光壳螯虾肝胰腺、血淋巴和鳃组织中免疫酶活性。
[0079]
1.饲料中添加不同含量不饱和脂肪酸对不同温度下红螯光壳螯虾肝胰腺中免疫酶活性的影响
[0080]
肝胰腺中akp酶活性如图4a所示，双因素方差分析结果显示，akp酶活性仅受温度变化影响，且随着温度的降低而呈逐渐下降趋势，且均在9℃组出现了显著降低。
[0081]
肝胰腺中acp酶活性如图4b所示，双因素方差分析结果显示，acp酶活性同时受温度变化和高不饱和脂肪酸含量变化的影响，且两者具有一定的交互作用，其中9℃组中acp酶活性最低，显著低于其余各温度组，而100％鱼油添加组中acp酶活性整体高于其余各添加组。
[0082]
表6温度和高不饱和脂肪酸含量对红螯光壳螯虾肝胰腺碱性和酸性磷酸酶活性双因素方差分析
[0083]
[0084]
2.饲料中添加不同含量不饱和脂肪酸对不同温度下红螯光壳螯虾血淋巴中免疫酶活性的影响
[0085]
血淋巴中akp酶活性如图5a所示，双因素方差分析显示，血淋巴中akp酶活性同时受温度变化和高不饱和脂肪酸添加量的影响，随着温度的降低，akp酶活性呈逐渐降低趋势，其中25℃组中akp酶活性最高，显著高于其余各温度组，而9℃中akp酶活性则显著低于其余各温度组，通过比较不同高不饱和脂肪酸添加组中akp酶活性发现，group 2(鱼油：豆油2:1)中akp酶活性显著高于同一温度下其余各添加组。
[0086]
血淋巴中acp酶活性如图5b所示，双因素方差分析显示，血淋巴中acp酶活性仅受温度变化的影响，除group 2(鱼油：豆油2:1)外，其余各添加组中acp酶活性均在25℃中最高，而在最低温度的9℃组中最低。
[0087]
表7温度和高不饱和脂肪酸含量对红螯光壳螯虾血淋巴碱性磷酸酶和酸性磷酸酶活性双因素方差分析
[0088][0089][0090]
3.饲料中添加不同含量不饱和脂肪酸对不同温度下红螯光壳螯虾鳃中免疫酶活性的影响
[0091]
鳃组织中akp酶活性如图6a所示，双因素方差分析结果显示，鳃组织中akp酶活性同时受温度变化和高不饱和脂肪酸添加量的影响，不同高不饱和脂肪酸添加组中，akp酶活性均在25℃组中最高，在9℃组中活性最低。在15℃温度条件下，随着鱼油添加量的减少而呈逐渐降低趋势。在9℃组中，100％豆油组中akp酶活性最低。
[0092]
鳃组织中acp酶活性如图6b所示，双因素方差分析结果显示，鳃组织中acp酶活性仅受温度变化的影响，随着温度的降低，acp酶活性呈逐渐下降趋势，其中各个添加组中acp酶活性均在25℃组中最高，在9℃组中活性最低。
[0093]
表8温度和高不饱和脂肪酸含量对红螯光壳螯虾鳃组织碱性磷酸酶和酸性磷酸酶活性双因素方差分析
[0094][0095]
实施例3.饲料中添加不同含量不饱和脂肪酸对不同温度下红螯光壳螯虾血淋巴中谷草及谷丙转氨酶活性的影响
[0096]
实验方法同实施例1，并在温度胁迫后检测红螯光壳螯虾血淋巴中谷草及谷丙转氨酶的活性。
[0097]
血淋巴中gop活性如图7a所示，双因素方差分析结果显示，血淋巴中gop酶活性仅受温度变化影响，随着温度的降低，血淋巴中gop酶活性呈逐渐升高趋势，其中15℃组和9℃组中gop酶活性与对照组相比均显著升高。
[0098]
血淋巴中gpt活性如图7b所示，双因素方差分析结果显示，血淋巴中gpt酶活性同时受温度变化和高不饱和脂肪酸添加量的影响，与gop酶活性变化相似，均随着温度的升高而呈逐渐升高趋势，且通过比较不同不饱和脂肪酸添加组中gpt酶活性发现，在25℃组中，各组间gop活性无显著差异，在20℃组和15℃组中，gpt酶活性在100％鱼油组中最低，而当温度降到9℃组时，两个混合油组中gpt酶活性最低，显著高于鱼油组和豆油组。
[0099]
表9温度和高不饱和脂肪酸含量对红螯光壳螯虾血淋巴转氨酶活性双因素方差分析
[0100][0101]
讨论
[0102]
低温对红螯光壳螯虾的生长、代谢、非特异性免疫等均产生了抑制，随着温度的降低，摄食量逐渐减少，在最低温度组中甚至停止摄食，通过消耗自身储存的营养物质来维持机体的代谢，因此，研究低温下红螯光壳螯虾代谢需求，并在其进入越冬环境前对其进行营养强化，对于帮助其渡过低温等不良的环境条件具有重要的意义。
[0103]
本发明选取豆油和鱼油作为脂肪源，有关红螯光壳螯虾脂肪源需求的研究已经有过报道，在最适温度下，以大豆油作为脂肪源时红螯光壳螯虾获得最佳生长效果，可能是由
于在温水养殖环境下，豆油中的高不饱和脂肪酸含量就能满足红螯光壳螯虾的生存需求。
[0104]
通过之前的研究发现，随着温度的降低，红螯光壳螯虾抗氧化酶活性也随之降低，进而导致机体内过多的ros不能被有效清除，造成机体的氧化损伤。本发明同样发现，在不同饲料添加组中，抗氧化酶活性均随着温度的降低而呈下降趋势，同时还发现，除受温度影响外，三种组织中的抗氧化酶活性还受n-3/n-6脂肪酸添加量的影响。两种免疫酶的活性的变化趋势与抗氧化酶相似，即不同饲料添加组均随着温度的降低而逐渐下降。表明低温条件下，红螯光壳螯虾抗氧化和免疫酶活性均受到抑制，这与之前的研究相似。同时还发现，抗氧化酶和免疫酶的活性还受饲料中n-3/n-6脂肪酸添加量的影响。对氧化损伤标志物mda及组织损伤标志酶谷草谷丙转氨酶的检测发现，mda含量变化仅受温度变化的影响，而不饱和脂肪酸含量的变化对其影响不大。但血淋巴中谷丙转氨酶的活性则同时受温度变化和饲料中n-3/n-6脂肪酸添加量的影响，在20℃组和15℃组中，gpt酶活性在100％鱼油组中最低，而当温度降到9℃组时，两个混合油组中gpt酶活性最低，显著低于鱼油组和豆油组，可能是由于9℃组中氧化损伤较为严重，而鱼油中不饱和脂肪酸含量增加的同时，促进了细胞膜中不饱和脂肪酸的积累，增加了细胞氧化损伤的风险，进而造成较为严重的组织损伤。
[0105]
总体来说，本发明发现随着饲料中n-3/n-6脂肪酸添加量的增加，红螯光壳螯虾组织中抗氧化酶的活性也随之增加，且氧化损伤程度有所降低，表明n-3不饱和脂肪酸对红螯光壳螯虾抵御低温胁迫具有一定的促进作用，但过高的鱼油添加量可能容易增加细胞膜脂质过氧化风险，因此，本发明认为在鱼油：豆油为2:1的比例添加效果最好。
[0106]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。