能抵抗与氧化相关的活性损失的里氏木霉葡糖淀粉酶变体及其用图
【专利说明】能抵抗与氧化相关的活性损失的里氏木霉葡糖淀粉酶变体 及其用途
[0001] 相关专利申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2012年8月14日提交的美国临时专利申请61/683, 007的权益，该临 时专利申请的内容以引用方式整体并入本文。
[0003] 序列表
[0004] 附件是包括SEQ ID NO: 1-19的序列表，以引用方式将其整体并入本文。
技术领域
[0005] 里氏木霉（Trichoderma reesei)葡糖淀粉酶（TrGA)变体可用于淀粉加工，例如 用于通过同时糖化和发酵（SSF)工艺生产醇作为终产物。本发明提供了包含TrGA变体的 组合物和将TrGA变体用于淀粉加工的方法。
【背景技术】
[0006] 工业发酵主要利用葡萄糖作为原料来生产多种蛋白质、酶、醇和其他化工终产物。 通常，葡萄糖是淀粉加工的产品，淀粉加工在常规上是催化淀粉降解的、涉及液化和糖化的 两步酶促过程。在液化过程中，不溶性颗粒态淀粉在水中调成浆液，经加热糊化，并被热稳 定性α-淀粉酶水解。在糖化期间，进一步通过葡糖淀粉酶水解液化过程中产生的可溶性 糊精。
[0007] 葡糖淀粉酶（葡聚糖1，4- α -葡糖水解酶，EC 3. 2. 1. 3)是水解淀粉的外切碳水化 合物分解酶，其催化从淀粉或者相关寡糖和多糖分子的非还原端连续去除葡萄糖单位。葡 糖淀粉酶既能水解淀粉的直链糖苷键也能水解淀粉的分支糖苷键（例如直链淀粉和支链 淀粉）。葡糖淀粉酶是商业上重要的酶类，已被用于各种各样的需要水解淀粉的应用中。例 如，葡糖淀粉酶通常用来从经过酶液化的淀粉底物生产可发酵糖类。可发酵糖类例如低分 子量糖类如葡萄糖然后可1)通过其他酶类（例如葡萄糖异构酶）转化为果糖；2)进行结 晶；或者3)用于发酵以生产各种各样的终产物（例如醇类、谷氨酸一钠、琥珀酸、维生素、氨 基酸、1，3-丙二醇和乳酸）。可同时进行发酵和糖化（即SSF工艺）来实现更大的经济性 和效率。
[0008] 葡糖淀粉酶已被成功用于商业应用多年。例如，已在真菌葡糖淀粉酶例如里 氏木霉葡糖淀粉酶（TrGA)中引入各种突变，以增强热稳定性和比活性。参见例如WO 2008/045489 ;W0 2009/048487 ;W0 2009/048488 ;和美国专利第 8, 058, 033 号。对于提供 具有更合宜的性质的新型葡糖淀粉酶变体仍存在着需求。
【发明内容】
[0009] 具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的里氏木霉葡糖淀粉酶（TrGA)变体CS4,已在 美国专利第8,058,033号中公开。〇54是通过将五个置换仏417￥、了43(^、0511拟5391?和 N563I)引入到具有SEQ ID N0:2的氨基酸序列的TrGA中获得的。相比于亲本TrGA，CS4表 现出改进的性质，例如热稳定性提高且比活性提高。不过，发现TrGA和CS4在较长时间的 储存后活性降低。在一些情况下，这个活性损失已被归因于所述酶的M50残基的氧化等因 素。CS4的位置50处的甲硫氨酸（M50)被甘氨酸（G)、苯丙氨酸（F)、赖氨酸⑷或酪氨酸 (Y)置换导致产生能抵抗与氧化相关的活性损失的变体。在这些变体当中，携带M50Y置换 的那个变体在SSF最终产物产率和DP4+水解效率两方面都表现出与CS4相当的性能。因 此，这个包涵 SEQ ID NO:2 的]?50￥、1^417￥、了43(^、0511!1、45391?和阳631置换的1'冗4变体 将有利地可用于各种淀粉加工应用。
[0010] 本发明涉及一种葡糖淀粉酶变体（1)，其与SEQ ID NO:2具有至少90%、95%、 97%或 99%序列同一性，且（2)包含与 SEQ ID NO:2 的位置 50、417、430、511、539 和563 或者亲本葡糖淀粉酶中的相应位置对应的氨基酸置换。在一个方面，该葡糖淀粉酶变体在 SEQ ID NO: 2的位置50或者亲本葡糖淀粉酶中的相应位置处具有氨基酸置换M50Y、G、F或 K。在另一个方面，该葡糖淀粉酶变体在SEQ ID NO: 2的位置50或者亲本葡糖淀粉酶中的相 应位置处具有氨基酸置换M50Y。在又另一个方面，该葡糖淀粉酶变体的位置417、430、511、 539和563处的氨基酸置换分别为L417V、T430A、Q511H、A539R和N563I。
[0011] 在一个实施例中，该葡糖淀粉酶变体包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在另一个 实施例中，该葡糖淀粉酶变体由SEQ ID N0:6的氨基酸序列组成。
[0012] 在一个实施例中，该葡糖淀粉酶变体还可包含一个或多个额外的与SEQ ID NO: 2 的位置43、44、61、73、294、431、503或535或者亲本葡糖淀粉酶中的相应位置对应的氨基酸 置换。在另一个实施例中，该葡糖淀粉酶变体可包含以下氨基酸置换中的一个或多个：SEQ ID N0:2或者亲本葡糖淀粉酶中的对等位置的I43Q/R、D44C/R、N61I、G73F、G294C、A431L/ Q、E503A/V 和 / 或 A535R。
[0013] 在一个方面，该葡糖淀粉酶变体与亲本葡糖淀粉酶相比可表现出热稳定性提高或 者比活性提高。在另一个方面，该葡糖淀粉酶当与包含SEQ ID N0:5的氨基酸序列的第二 葡糖淀粉酶变体相比时，在相同的条件下氧化时失去的活性较少。
[0014] 本发明提供了包含该葡糖淀粉酶变体的酶组合物。该酶组合物还可包含己糖激 酶、木聚糖酶、葡萄糖异构酶、木糖异构酶、磷酸酶、植酸酶、普鲁兰酶、β-淀粉酶、α-淀 粉酶、蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶、脂肪酶、角质酶、海藻糖酶、异淀粉酶、氧化还原酶、酯 酶、转移酶、果胶酶、裂解酶、α -葡糖苷酶、β -葡糖苷酶、其他水解酶或者它们的组合。
[0015] 本发明还提供加工淀粉的方法，其包括使淀粉底物与该葡糖淀粉酶变体接触以产 生包含葡萄糖的组合物。该方法还可包括将己糖激酶、木聚糖酶、葡萄糖异构酶、木糖异 构酶、磷酸酶、植酸酶、普鲁兰酶、β-淀粉酶、α-淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶、 脂肪酶、角质酶、海藻糖酶、异淀粉酶、氧化还原酶、酯酶、转移酶、果胶酶、α -葡糖苷酶、 β -葡糖苷酶、其他水解酶或者它们的组合添加到淀粉底物。
[0016] 在一个方面，淀粉底物来自小麦、大麦、玉米、黑麦、稻、高粱、麩皮、木薯 (cassava)、买罗高梁、小米、马铃薯、甘薯、木薯淀粉（tapioca)和它们的任何组合。在另一 个方面，淀粉底物是液化淀粉、糊化淀粉或颗粒态淀粉。在又一个方面，淀粉底物为约15% 至50%、约15%至30%或者约15%至25%。
[0017] 在一个实施例中，将淀粉底物糖化得到高葡萄糖糖浆。在另一个实施例中，该方法 还包括将可发酵糖类发酵成终产物。终产物可为醇，或者任选为乙醇。终产物还可以是有 机酸、氨基酸、生物燃料和其他生物化工品，包括但不限于乙醇、柠檬酸、乳酸、琥珀酸、谷氨 酸一钠、葡糖酸、葡糖酸钠、葡糖酸钙、葡糖酸钾、衣康酸和其他羧酸、葡糖酸-S -内酯、异 抗坏血酸钠、赖氨酸、ω 3脂肪酸、丁醇、异戊二烯、1，3_丙二醇和生物柴油）。在另一个实 施例中，糖化和发酵作为同时糖化和发酵（SSF)工艺来执行。
[0018] 在一个实施例中，所设想的葡糖淀粉酶变体以范围在约0. 1至约2. 0GAU、约0. 2至 约I. OGAU或者约0. 2至约0. 5GAU或者约0. 325GAU每克干固形物的量投与。在另一个实 施例中，糖化还包括添加己糖激酶、木聚糖酶、葡萄糖异构酶、木糖异构酶、磷酸酶、植酸酶、 普鲁兰酶、β-淀粉酶、α-淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶、脂肪酶、角质酶、海藻糖 酶、异淀粉酶、氧化还原酶、酯酶、转移酶、果胶酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶或者它们的 组合。
【附图说明】
[0019] 将附图并入本说明书中，提供多个实施例的非限制性例证。在附图中：
[0020] 图1A-1F示出成熟的TrGA(SEQ ID ΝΟ:2)与来自木霉属（Trichoderma)/肉座菌 属（Hypocrea)家族簇（family cluster)的几个成员的全长葡糖淀粉酶的ClustalW比 对。所述全长葡糖淀粉酶来自梓檬肉座菌美国变种（Hypocrea citrine var.americana) (SEQIDN0:7;另参见美国专利第 7,413,879 号的SEQIDN0:6);酒红肉座菌（Hypocrea vinosa) (SEQ ID N0:8 ;另参见美国专利第7, 413, 879号的SEQ ID N0:8);木霉属 (Trichodermasp·)(SEQIDN0:9;另参见美国专利第 7,413,879 号的SEQIDN0:10);胶 质肉座菌（Hypocreagelatinosa)(SEQIDN0:10 ;另参见美国专利第 7,413,879 号的SEQ ID N0:12);东方肉座菌（Hypocrea orientalis) (SEQ ID N0:11;另参见 U.S.7, 413,879 的SEQIDN0:14);康长木霉（Trichodermakonilangbra)(SEQIDN0:12;另参见美国专 利第 7,413,879 号的SEQIDN0:16);木霉属（Trichodermasp·)(SEQIDN0:13;另参 见美国专利第 7,413,879 号的SEQIDN0:29);哈茨木霉（Trichodermaharzianum)(SEQ IDN0:14 ;另参见美国专利第 7,413,879 号的SEQIDN0:31);长枝木霉（Trichoderma longibrachiatum) (SEQ ID N0:15;美国专利第 7,413,879 号的 SEQ ID N0:33);棘孢木 霉（