一种利用水产品下脚料制备活性肽饲料添加剂的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种利用水产品下脚料制备活性肽饲料添加剂的方法，属于水产品加工与利用领域。
【背景技术】
[0002]自20世纪50年代以来，在动物饲养和饲料中广泛使用抗生素、化学合成药物、激素、兴奋剂、重金属、镇静剂等促生长保健剂。抗生素等促生长保健剂在饲料中的应用历史由来已久，它创造了养殖业和饲料工业的革命，使得规模养殖在全世界范围内得到了迅速发展，动物的生产数量和饲料转化率得到大幅度提高。但是，正如所有工业文明的成果都有它的负面影响一样，长期以来使用抗生素等非绿色饲料添加剂，导致了如下的问题:畜禽和水产产品中药物残留严重，直接危害人体健康；畜禽和水产产品品质下降，缺乏市场竞争力和信任感；细菌耐药性增强、耐药菌株增多，威胁人类安全；破坏生态环境等。随着饲料工业和畜牧水产业的迅猛发展，目前我国的畜产品和水产品已从短缺转变为阶段性过剩，人们更关心食品是否安全、卫生，因而绿色消费已成为今后的发展趋势，加之我国已加Awt O,发达国家对我国出口的农产品要求越来越严格，目前药物残留问题成为我国畜产品和水产品走出国门的主要障碍之一。因此加速开发、推广和应用新型绿色饲料添加剂势在必行。
[0003]大量的文献表明，在日粮中添加不同来源的活性肽均能提高不同饲养动物的生产性能，活性肽的促生长性能已得到饲料行业的公认。因而，作为一种新型绿色饲料添加剂，活性肽饲料添加剂有着良好的应用前景。生物活性肽可分为两大类，即营养小肽和功能肽。营养性小肽是只为蛋白质合成提供氮架，不具有特殊生理调节功能的活性肽。功能肽为具有某些特殊功能的肽，如抗菌肽、抗氧化肽、免疫肽和激素肽等。
[0004]活性肽的制备主要是将大分子蛋白质用化学或酶的方法水解成小分子的肽。目前活性肽的制备方法有化学法、酶解法和微生物发酵法。化学水解法是采用酸、碱化学试剂在一定温度下促使蛋白质分子的肽链断裂形成小分子肽。化学水解法虽然简单、成木低，但是其缺点是不能进行有规则地控制生产，氨基酸会受到损害而降低其营养价值，并且对环境污染大。目前化学水解法多用于试验，生产实践中使用较少。酶解法生产活性肽是以蛋白原料为底物，运用蛋白酶的酶解作用，生产小分子肽。酶解法易于控制，作用条件温和适合活性肽的生产。但酶解法需要大量的蛋白酶，生产成本高。因此，酶解法制备活性肽多用于食品与医药行业，低端的饲用活性肽产品很少采用酶解的方法。微生物发酵法是以大分子蛋白质为原料，接入产蛋白酶的微生物，利用微生物发酵过程产生的蛋白酶的酶解作用，生成小分子肽。微生物发酵法把蛋白酶的发酵生产和酶解过程有机结合在一起，降低了活性肽的生成成本，更适合活性肽的生产。专利CN200410029787.0 “一种活性肽饲料添加剂及制备方法和用途”公开了一种发酵发制备活性肽饲料添加剂的方法，它是以植物蛋白和动物蛋白的一种或几种的混合物，经芽孢杆菌等发酵降解，使其水解度控制在20?35 %，然后经过后处理可得到活性肽饲料添加剂。但由于发酵过程蛋白酶的浓度的不可控性，再加上酶解的随机性，因而以上方法制备的活性肽多为营养小肽，而缺乏功能肽，特别是饲料工业急需的抗菌肽。
[0005]作为饲用抗生素的一种替代品，抗菌肽通常具有耐热、抗菌谱广、水溶性好和不易产生耐药性等特性，近年来备受关注。抗菌肽的来源于动物、植物和微生物，但动植物源抗菌肽由于来源有限，应用受到了限制；而微生物抗菌肽可以大规模生产，成本相对较低，因而微生物源抗菌肽更有应用前景。目前微生物源抗菌肽研宄最多的是乳酸菌的抗菌肽，而国际上对枯草芽孢杆菌产生的枯草菌素这种新型细菌素类抗菌肽研宄则很少，国内更是少见。
【发明内容】
[0006]针对目前发酵法制备的活性肽饲料添加剂多为营养小肽，而缺乏抗菌肽，使得其功效不够突出。本发明的目的是制备一种富含抗菌肽的活性肽饲料添加剂，在进一步提高活性肽饲料添加剂促生长性能的基础上，还赋予其抗病能力。从而显著提高活性肽饲料添加剂的功效，以促进活性肽饲料添加剂在饲料工业的广泛应用。
[0007]为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下:一种利用水产品下脚料制备活性肽饲料添加剂的方法，包括如下步骤:
(1)将斜面保藏的能产枯草菌素的枯草芽孢杆菌(^3ci77i/5.subtil is) HL-1接入到灭菌后冷却的LB液体培养基中，于37 V、150r/min培养16h，制备成枯草芽孢杆菌iBaciIIussub tills') HL-1种子液备用；
(2)将新鲜的水产品下脚料绞碎后备用；
(3 )将步骤(2 )制得的绞碎的水产品下脚料放入到发酵罐中，并向发酵罐中加入水和营养物，混匀后得到发酵培养基；
(4)将步骤(3)获得的发酵罐中的发酵培养基于115°C灭菌20min;
(5)将步骤(4)获得的灭菌后的发酵培养基冷却至室温，然后接入步骤(I)所制备的枯草芽抱杆菌〈Bacillus subtil is) HL-1种子液；
(6)发酵过程的控制:发酵温度为28°C?30°C，无菌空气通入量为0.5vvm?2.5vvm，发酵罐的转速为150rpm?350rpm，发酵时间为35h?45h ；
(7)成品处理:发酵结束后发酵液升温至90°C保温灭酶5min;灭酶后的发酵液冷却至室温后，经过滤去除沉淀而得到滤液；滤液再经真空浓缩和喷雾干燥后而得到活性肽饲料添加剂成品。
[0008]所述步骤(I)中接入的枯草芽孢杆菌HL-1能产生枯草菌素，该菌已于2015年I月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.10379，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研宄所。
[0009]所述步骤(2)中的水产品下脚料为虾头、扇贝裙边、去掉内脏与鱼皮的罗非鱼下脚料、去掉内脏与鱼皮的鳕鱼下脚料、去掉内脏与鱼皮的鲤鱼下脚料、去掉内脏与鱼皮的青鱼下脚料、去掉内脏与鱼皮的鲢鱼下脚料、去掉内脏与鱼皮的草鱼下脚料和去掉内脏与鱼皮的鲣鱼下脚料中的一种。所述步骤(3)中发酵罐中水产品下脚料的加入量以添加的水产品下脚料的质量占水总质量百分比计，为10%?20%。
[0010]所述步骤(3)中的营养物为葡萄糖、氯化亚铁和磷酸氢二钾所组成的混合物；所述步骤(3)中的营养物的加入量以添加的营养物的质量占水总质量百分比计，分别为:葡萄糖0.01%?5%，氯化亚铁0.01%?5%，磷酸氢二钾0.01%?5%。
[0011]所述步骤(5)中枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL_l种子液的接种量以接入的种子液的质量占发酵培养基总质量百分比计，为0.1%?5%。
[0012]本发明跟现有的技术相比，本发明采用能产枯草菌素的枯草芽孢杆菌subtilis.)进行目的性发酵，在得到营养小肽的同时还得到了枯草菌素这种细菌素类抗菌肽，因而本发明方法制备的活性肽饲料添加剂富含抗菌肽。富含抗菌肽，使得本发明制备的饲料添加剂在进一步提高活性肽饲料添加剂促生长性能的基础上，还赋予其抗病能力，显著提高了活性肽饲料添加剂的功效。
[0013]本发明提供了一种利用水产品下脚料制备活性肽饲料添加剂的方法。本发明得到的活性肽饲料添加剂在华南地区的猪、鸡、对虾的养殖试验表明，用本发明生产的活性肽饲料添加剂配合的饲料，不但可提高饲养动物的生长效果，而且还可提高饲养动物的免疫力和抗病力，可直接用来配制绿色饲