一种松木层孔菌超临界萃取物作为抑菌剂的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种松木层孔菌提取物的应用，特别涉及一种松木层孔菌超临界萃取 物作为抑菌剂的应用。 (二）
【背景技术】
[0002] 每年世界上食品因微生物腐败造成的损失不计其数，食品腐败变质不仅会使食品 丧失营养价值，还会造成食物中毒。为了延长食品贮运和保藏期限，在食品加工过程中除杀 (灭）菌外，还普遍采用通过添加防腐剂的手段，使微生物丧失活性、延缓或阻止其生长。食 品防腐剂按来源通常分为合成防腐剂与天然防腐剂两大类。目前国内外大量使用的食品防 腐剂仍以化学合成为主，如对羟基苯甲酸酯、苯甲酸、山梨酸及其盐类等化学合成防腐剂。 但是，经过长期的应用和研究发现，这些化学防腐剂对人体都会有或多或少的毒害作用，尤 其在长期使用或过量使用时，一些合成防腐剂还存在诱癌性、致畸性和易引起食物中毒等 问题。
[0003]相比上述的化学合成防腐剂，天然防腐剂，尤其是食品来源，或经长期使用的药用 植物或真菌来源，不仅具有安全无毒的优点，而且通常还具有一定的营养和保健功效。随着 社会和经济发展，消费者健康意识的增强，天然防腐剂已成为研究和开发的趋势。
[0004] 食药真菌是一类具有较高营养或药用价值的高等真菌，普遍具有抗肿瘤、降血糖、 降血脂、抗病毒和增强免疫力等诸多功效。另外一些食药真菌的子实体或菌丝体的提取物 也显示了一定的防腐抑菌作用，如桦褐孔菌、红菇、松乳菇、杨树菇、木蹄层孔菌、蒙古口蘑、 巨大口蘑、棘托竹荪、虎奶菇、大秃马勃、大球盖菇、鲍鱼菇、巴西蘑菇等。但有些采用了有毒 有害的有机溶剂萃取，从安全性考虑，不可避免对食品应用有少许残留，因此无实际食品的 防腐应用价值，另外有机溶剂易燃易爆，生产安全性也较差。如2009年，刘迎秋等人采用纸 片法研究了桦褐孔菌的水、甲醇、丙酮、氯仿、石油醚提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌 的抑制作用，发现桦褐孔菌各提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有不同程度的抑制作 用。2009年，方熹君等人研究表明，在10~40mg/mL的浓度范围内，虎奶菇发酵液不同组 分的抑菌作用大小依次为正丁醇萃取物 > 乙酸乙酯萃取物> 萃余发酵液，正己烷萃取物无 活性。2010年，陈敬华等人申请的"具有抑菌活性的竹荪子实体提取物及其应用"（申请号 201010578196. 4)，长裙竹荪子实体经过粉粹，过筛，分别依次用石油醚、乙醚、乙酸乙酯、无 水乙醇、甲醇经索氏提取器提取，提取液分别减压浓缩至干，得到各溶剂提取物，各提取液 对常见致病、致腐微生物有较好的抑制作用。
[0005] 本发明涉及的松木层孔菌（Phellinuspini)，又名松针层孔菌、松白腐菌、 黄芝、松黄灵、红缘树舌、松生层孔、红缘层孔菌，隶属于担子菌门、伞菌纲，锈革孔菌目 (Hymenochaetales)，锈革孔菌科（Hymenochaetaceae)，木层孔菌属（Phellinus)，是一种 能引起树材腐朽的白腐真菌，主要寄生于云杉、落叶松等针叶树活立木上，集中产地在东 北、华北、西北、西南等原始森林地区。已有研究表明松木层孔菌在抑制肿瘤、治疗肝炎、提 高免疫力、降血糖、抗氧化等方面显示了较强的功效。但尚未发现松木层孔菌及其提取物在 防腐抑菌方面的报道。
[0006] 超临界流体萃取（supercriticalfluidextraction，简称SFE)，是近几十年发展 起来的一种新兴分离技术，与传统的化学溶剂萃取法相比，具有无化学溶剂消耗和残留、无 污染、利于热敏物质萃取和产物的生物活性保留高等特点。
[0007] 本发明通过超临界萃取，得到的松木层孔菌提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌 和枯草芽孢杆菌均显示了较好的抑菌效果，工艺和制备过程安全，不涉及有毒有害溶剂，是 一种良好的天然抑菌剂，同时可能还兼有松木层孔菌原有的增强免疫和抗癌等功效。 (三）
【发明内容】
[0008] 本发明目的是提供一种从松木层孔菌中超临界萃取得到的天然抑菌剂，具有使用 安全性高的特点，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌具有抑菌性，且超临界萃取 是非极性，可用于油脂类的抑菌剂，以期应用于食品的防腐和贮藏保鲜。
[0009] 本发明采用的技术方案是：
[0010] 本发明提供一种松木层孔菌超临界萃取物作为抑菌剂的应用，所述超临界萃取物 是将松木层孔菌子实体进行超临界CO2萃取获得的萃取物，所述超临界萃取条件为：以CO2 为超临流体，萃取压力为20~40MPa，时间1~3h，温度30°C-50°C，OV流速为10~20g/ min。通常得到的萃取物呈浸膏状。
[0011] 进一步，所述松木层孔菌子实体在萃取前先粉碎，过20~40目筛，40~60°C干 燥，获得松木层孔菌子实体粉末；然后将粉末加入CO2超临界萃取仪的萃取釜进行CO2超临 界萃取。
[0012] 进一步，优选所述萃取压力为30~40MPa，时间2~3h，温度30°C-50°C，OV流速 为 15 ~20g/min〇
[0013] 本发明所述抑菌剂为大肠杆菌抑菌剂、金黄色葡萄球菌抑菌剂或枯草芽孢杆菌抑 菌剂。
[0014] 本发明所述超临界萃取物对大肠杆菌或金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为 2. 5mg/mL，对枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度均为5.Omg/mL。
[0015] 本发明所述松木层孔菌（Phellinuspini)子实体，又名松针层孔菌、松白腐菌、 黄芝、松黄灵、红缘树舌、松生层孔、红缘层孔菌，隶属于担子菌门、伞菌纲，锈革孔菌目 (Hymenochaetales)，锈革孔菌科（Hymenochaetaceae)，木层孔菌属（Phellinus)，是一种 能引起树材腐朽的白腐真菌，主要寄生于云杉、落叶松等针叶树活立木上，集中产地在东 北、华北、西北、西南等原始森林地区。
[0016] 与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明对松木层孔菌进行安全 性高的超临界CO2萃取，测定发现该提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌等 几种食品常见细菌均有较好的抑制效果；本发明所述超临界萃取物对大肠杆菌或金黄色葡 萄球菌的最低抑菌浓度为2. 5mg/mL，对枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度均为5.Omg/mL;由于 超临界萃取物是非极性，可用于油脂类的抑菌剂，以期应用于食品的防腐和贮藏保鲜。 (四）
【具体实施方式】
[0017] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0018] 实施例I:
[0019] (1)松木层孔菌萃取物
[0020] 松木层孔菌子实体一剪碎至0. 3-0. 6cm3的小块一机械粉碎过30目筛一50°C干 燥一称取180g-CO2超临界萃取（超临界萃取仪：美国Thar超临界流体超细微造粒系统 SFP，美国Thar科技公司有限公司），萃取压力为30MPa，时间2h，温度40°C，OV流速为15g/ min-收集分离釜中棕色油状萃取物一称重为I. 56g，得率0. 87% -抑菌测定一松木层孔 菌抑制剂。
[0021] (2)松木层孔菌萃取物性能
[0022] 1.供试菌株：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌菌株，由浙江工业大学 生物与环境工程学院微生物实验室提供，样本在该实验室贮藏。
[0023] 2?实验方法
[0024] 2. 1供试菌株的制备：
[0025] 将所有供试菌种移接入营养琼脂试管斜面培养基上，每种菌种接多支重复。并将 接种有大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的斜面培养基置于37°C生化培养箱培养 24h。每种菌种取2支供试验用，其余冷藏备用。
[0026] 2. 2菌悬液的制备
[0027] 挑取各菌落接种营养琼脂培养基平皿，三种供试菌均培养24h，用无菌生理盐水洗 脱，分别制成含菌约IO7CFUAiL的菌悬液。
[0028] 具体制备方法：分别挑取少量细菌孢子至无菌生理盐水中洗出一玻璃珠打散一制 成菌悬液一调菌悬液浓度为10 7CFU/mL，备用。
[0029] 2. 3营养琼脂培养基平板制备：营养琼脂培养基3. 2g，加水100ml，pH自然。
[0030] 营养琼脂培养基主要成分（g/L):蛋白胨10. 0 ;牛肉浸出粉5. 0 ;氯化钠5. 0 ;琼脂 12. 0,pH7. 3±0. 1(25°C)。
[0031] 配制好的培养基，121°C湿热灭菌30min后，冷却至50-60°C，无菌操作倾注于干热 灭菌的培养皿内，每皿15-20mL。
[0032] 2. 4最低抑菌浓度（MIC)测定
[0033] ①分别取步骤（1)制备的松木层孔菌超临界萃取物，加已灭菌的二甲基亚砜 (DMSO)配制成一定梯度的稀释液（稀释浓度分别为10mg/mL，5mg/mL，2. 5mg/mL，I. 25/mL) 作为抑菌原液；并另取一支不加药品（即松木层孔菌超临界萃取物）的空白液体培养基作 为对照样品（用等量二甲基亚砜代替松木层孔菌超临界萃取物）。
[0034] ②用移液枪移取10yL的菌悬液（IO7CFUAiL)至营养琼脂培养基平板表面，用三 角涂布棒将其涂布