一种利用水产品下脚料生产抗菌营养复合型饲料添加剂的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及饲料添加剂技术领域，更具体地，涉及一种利用水产品下脚料生产抗菌营养复合型饲料添加剂的方法。
【背景技术】
[0002]我国水产品加工下脚料数量庞大，再利用水平低，浪费和环境污染严重，探寻高附加值和低排放再加工新方法成为当务之急。饲用活性肽是一种高值、低门槛产品，成为海洋低值蛋白开发和利用的新途径。抗菌肽和营养小肽作为饲用活性肽主要成员被认为是目前最具潜力的饲用抗生素替代品。
[0003]芽孢杆菌抗菌脂肽是抗菌肽家族中的一类，其成员通常有表面活性素(surfactin)、芬养素(fengycin)、伊枯草菌素(iturin)、杆菌霉素(bacillomycin)、抗霉枯草菌素(mycosubtilin)、制磷脂菌素(plipstatin)等。这类抗菌肽具有显著的抗细菌、霉菌、病毒和原虫等功效，对酸碱和热处理有非常好的稳定性，且口服是安全的；以上这些特性有助于其在饲料添加剂行业的广泛应用。芽孢杆菌抗菌脂肽的部分成员已被应用于动物养殖的抗病、促生长，其效果显著。但在应用的过程中还存在菌种产脂肽能力相对偏低；产物抗菌谱相对较窄，抗菌针对性单一；发酵产率偏低等难题。尤其是液态发酵生产芽孢杆菌抗菌脂肽，由于会产生大量泡沫，罐效低，成为产业化的瓶颈。
[0004]饲用营养小肽是蛋白质水解的中间产物，是由2个或2个以上氨基酸残基组成的化合物。营养小肽因具有高吸收性、高转化率和免疫刺激作用，添加于词料中能显著提高动物存活率，促进饲料中矿物质元素吸收利用和饲料转化，促进动物体内蛋白质的合成，并增强动物体自身免疫力，从而实现养殖大幅度增产及增效。目前，饲用活性营养小肽主要原料采用豆柏、羽毛粉、鱼粉等蛋白质资源，采用酶解法、微生物发酵法或酶解法和微生物发酵法联合进行生产。国内外参与此方面研究的企业较多，其产品已在一定范围内得到应用，但还存在产率偏低、成本较高和功能相对单一等缺点，限制了进一步大范围推广。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种利用水产品下脚料生产抗菌营养复合型饲料添加剂的方法。
[0006]本发明的第二个目的是提供上述方法获得的抗菌营养复合型饲料添加剂。
[0007]本发明的第三个目的是提供所述添加剂的应用。
[0008]本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的:
一种利用水产品加工下脚料生产抗菌营养复合型饲料添加剂的方法，包括以下步骤:
51.制备发酵配料:水产品下脚料绞碎，添加植物饲料蛋白、麸皮、甘蔗渣或稻壳，按质量比4?8:1:1:0.1?0.4混合得基料，再加入辅料和水；通过蒸煮、降温后得发酵配料；
52.固体发酵:当S1所述发酵配料温度为40°C时，接种纳豆芽孢杆菌NT-6种子液，在25?35°C下发酵，空气湿度控制在75?85%，36?72h后停止发酵；
S3.二次酶解:将发酵后的物料转至保温设备中，以3?5°C /30min的升温速率将温度升至45?55°C，并保温2?5h，最后进行烘干，烘干后物料水分控制在12%以内，粉碎后即得。
[0009]现有技术中抗菌脂肽的发酵与营养小肽的发酵是分开的，目前利用水产品下脚料生产饲用活性肽工艺，产率低、成本高，产品功能相对单一；抗菌脂肽的生产成本高，抗菌谱窄，由于现有技术中上述两种物质的生产工艺都存在一些缺点，如果能将抗菌脂肽发酵生产和营养小肽的酶解工艺相结合，不仅可以利用水产品下脚料低值蛋白作为芽孢杆菌的营养底物生产抗菌脂肽，还可以利用发酵过程中芽孢杆菌产生的复合蛋白酶酶解下脚料低值蛋白生产营养小肽；在以上思想的基础上，申请人提出了一种生产复合有抗菌脂肽和营养小肽的生产方法，即对固态发酵进行优化，并在固态发酵的基础上进行二次酶解，二次酶解后的产物富含抗菌脂肽、营养小肽、复合酶及芽孢杆菌益生菌。
[0010]优选地，S1所述蒸煮降温为:在0.2Mpa压力下通蒸汽蒸煮15?20min，蒸料后物料温度降到25?40°C。
[0011]需要强调的是，本发明所述固体发酵与二次酶解联合在一起，才能保证最终得到的产物富含抗菌脂肽、营养小肽、复合酶及芽孢杆菌益生菌。
[0012]优选地，所述纳豆芽孢杆菌NT-6种子液的接种量为发酵配料质量的0.1?5 %。
[0013]优选地，S1所述水产品下脚料为罗非鱼、鳕鱼、扇贝裙边、鲢鱼、青鳞鱼、草鱼、鲣鱼或虾。
[0014]本发明所用的发酵菌种是纳豆芽孢杆菌NT-6，又称枯草芽孢杆菌纳豆亚种(Bacillus subtilis subsp.natto) NT-6菌株，保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC N0.8121，保藏地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期是2013年9月3日。
[0015]所述纳豆芽孢杆菌NT-6种子液制备过程如下:
(1)种子培养基(g/L):胰蛋白胨10.0，酵母膏5.0，NaCl 5.0，水1000mL，ρΗ7.2 ；
(2)种子的扩大培养:纳芽孢杆菌ΝΤ-6菌株逐步扩大培养，接种于种子培养基通气培养18h后，备用。
[0016]本发明所用的抗菌脂肽生产菌株纳豆菌NT-6相对于其他芽孢杆菌产生的抗菌脂肽，其抗菌活性和抗菌谱具有明显的优势。该菌株产生的脂肽组分较目前报道的产抗菌脂肽相关菌株丰富得多，产生的抗菌脂肽组分中含有多达二十多种脂肽类同系物，这在现有脂肽产生菌株的报道中极为罕见。三组脂肽同系物的完美协同作用，使得该菌株产生的复合脂肽对多数供试的革兰氏阴性、阳性细菌、霉菌具有显著的抑制作用。此外，由于抗菌脂肽具有良好的表面活性作用，使得微生物难以产生耐药性，并具有很好的抗病毒和抗原虫作用。可用于防治动物养殖过程中的多种疾病(如耐药细菌性腹泻、球虫病、猪细小病毒病、禽流感等)，使本发明所制得的饲料添加剂的使用范围大大拓展。
[0017]优选地，S1所述植物饲料蛋白为豆柏、脱毒菜籽柏、脱毒棉籽柏、花生柏中的一种或两种。
[0018]优选地，所述辅料为糖蜜或葡萄糖、谷氨酸钠、磷酸氢二钾、MgS04.7H20o具体地，所述辅料含量为基料重量的1?5%糖蜜(或葡萄糖)、0.1?0.5%谷氨酸钠、0.05?0.5% 磷酸氢二钾、0.1 ?0.3% MgS04.7H20o
[0019]本发明提供上述方法获得的抗菌营养复合型饲料添加剂；所述饲料添加剂含有复合抗菌脂肽、粗蛋白、多肽、纳豆芽孢杆菌、木聚糖酶、蛋白酶和淀粉酶。
[0020]具体地，所述复合抗菌脂肽的含量为2?20mg/g，多肽含量10?30%，纳豆芽孢杆菌含量1.0?5.0 X 109cfu/g,木聚糖酶活5000?8000U/g，蛋白酶活600?1000U/g，淀粉酶活4000?8000U/g。
[0021]更优选地，本发明所用的下脚料获得的复合型饲料添加剂中粗蛋白含量30?60%。
[0022]以抗菌脂肽高产优良纳豆菌进行固态发酵生产饲用活性肽，产物不仅富含高活性抗菌脂肽，还含有大量营养小肽，同时终产物中还存在丰富的复合酶系和有益生作用的纳豆芽孢杆菌。将复合抗菌脂肽、营养小肽、复合酶及芽孢杆菌益生菌等四种饲用防病促生长剂合并生产，不仅可以得到高浓度的抗菌脂肽产品，还可以解决营养小肽生产中蛋白质酶解所需的生物酶源问题，生产出的产品既具有抗菌脂肽的功能，又具有营养小肽的效果；同时由于基质中抗菌脂肽的存在还可以避免下脚料原料酶解过程的腐败问题，可以采用原料免杀菌生产方式创新酶解工艺。
[0023]本发明所述复合抗菌脂肽是由iturins、fengycins和surfactins三类抗菌脂肽同系物中的部分或全部组分组成。其中iturins含有分子量为1043.2、1057.2、1071.0、1071.0Da 的同系物组分；Fengycins 含有分子量为 1491.7、1492.5、1505.7、1519.7Da 的同系物组分；Surfactins 含有分子量为 994.3、1009.0、1008.8、1009.9、1008.7、1022.7、1022.6、1036.8、1036.5、1036.6、1051.8、1050.6、1051.2、1051.6、1065.8、1080.2Da 的同系物组分。
[0024]本发明还提供所述抗菌营养复合型饲料添加剂在动物抗病中的应用。
[0025]本发明还提供所述抗菌营养复合型饲料添加剂在促进动物生长中的应用。
[0026]本发明所述饲料添加剂可以在饲料中直接添加或制成颗粒料，用于猪、牛、羊、禽和水产动物抗病促生长。
[0027]与现有技术相比，本发明具有以下有益效果:
本发明提供了一种利用水产品加工下脚料生产抗菌营养复合型饲料添加剂的方法，即以水产品加工下脚料为主要原料，辅以饲用植物蛋白、麸皮、甘蔗渣(或稻壳)，接入纳豆芽孢杆菌NT-6菌株，进行固态发酵并结合二次酶解调控技术，生产富含高活性复合抗菌脂肽、营养小肽、复合酶及芽孢杆菌益生菌的复合型饲用添加剂，本发明所用的抗菌脂肽生产方法与液态发酵相比优势明显，生产所用的原料为水产品加工副产物、饲用植物低值蛋白、麸皮和甘蔗渣等，可以显著降低生产成本；此外，发酵设备简单，单位基质浓度高，产量较高，且在生产中还可以避免出现大规模液体发酵生产抗菌脂肽过程中难以解决的泡沫问题；所述方法简化工艺，大幅度降低成本，拓展产品的使用范围，增强产品竞争力；还可以显著提高下脚料的附加值，实现无渣排放高效环保型工业化生产，推动水产养殖业的可持续发展。
【具体实施方式】
[0028]下面结合具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的简单修改或替换，均属于本发明的范围；若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。