含有巯基蛋白酶抑制剂的发酵营养组合物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本领域涉及包含蛋白质和蛋白酶抑制剂活性的营养组合物。
【背景技术】
[0002] 巯基蛋白酶（亦称为半胱氨酸蛋白酶）的特征在于它们在其活性中心具有巯基基 团。与丝氨酸蛋白酶不同，这些蛋白酶通常不是哺乳动物消化系统的蛋白酶的一部分。已 知的巯基蛋白酶是组织蛋白酶（cath印sin) (L、B、K)、钙依赖性中性蛋白酶（CAMP)、木瓜蛋 白酶和菠萝蛋白酶。
[0003] 在胃肠道中，通常是通过由巨噬细胞和上皮细胞表达的组织蛋白酶和通过细菌或 病毒的巯基蛋白酶显示这样的活性。过高的肠内巯基蛋白酶活性和组织损伤及胃肠炎症有 关，并在感染中起作用。
[0004] 人乳包含多种蛋白酶抑制剂，如乳铁蛋白、酪蛋白、胱蛋白、α1-抗-胰蛋白 酶和α?-抗-糜蛋白酶。蛋白酶抑制剂限制消化和细菌诱导的蛋白酶活性，从而预防蛋白 酶-诱导的组织损伤。在本领域中已知乳成分对巯基蛋白酶活性的抑制作用。ΕΡ1568377 公开酪蛋白或酪蛋白水解产物作为半胱氨酸蛋白酶抑制剂的用途。ΕΡ1576964公开乳铁蛋 白或乳铁蛋白水解产物作为半胱氨酸蛋白酶抑制剂的用途。W0 2012/078038公开发酵婴儿 配方减少肠道中消化性蛋白酶活性的量。Turronietal.，2010,ΑΕΜ76:3206-3219公开短 双歧杆菌（Bifidobacteriumbreve)菌株中丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的特征。
【发明内容】
[0005] 本发明人发现，与具有相似的大量营养素和微量营养素组成并处于相似pH条件 下的未发酵的乳源性营养组合物相比，具体地，乳源性营养组合物的巯基蛋白酶活性的抑 制能力是在乳酸细菌的发酵步骤后提尚。
[0006] 特别是，链球菌（Streptococcus)进行的发酵促进这种效果。由于嗜热链球菌 (Streptoccoccusthermophilus)的发酵不会导致较大蛋白质的水解，这种效果不能归因 于乳蛋白中存在的酪蛋白或乳铁蛋白的水解。
[0007] 使用木瓜蛋白酶作为模型巯基蛋白酶。由于巯基蛋白酶对于蛋白质消化作用来 说不是十分重要，但在炎症中起着重要作用，所以食用发酵的乳源性营养组合物可有益地 降低胃肠道中的巯基蛋白酶活性，从而有助于胃肠健康。胃肠道中巯基蛋白酶活性的降低 会导致治疗或预防轻度胃肠炎症、IBD、IBS以及减少绞痛（colics)、肠痉挛（intestinal cramps)和腹痛及胃肠感染。
[0008] 这对于婴儿和年幼儿童来说是十分重要的，因为其胃肠道仍在发育，并且其具有 发育中的微生物群（microbiota)，通常伴随以下状况：轻度胃炎症、降低的胃肠屏障功能 和肠道不适。
【具体实施方式】
[0009] 本发明涉及抑制巯基蛋白酶活性的方法，包括将巯基蛋白酶与包含乳源性发酵产 品的组合物接触，所述乳源性发酵产品由产乳酸细菌发酵，所述乳源性发酵产品包含i)乳 酸和/或乳酸盐，ii)选自以下的至少一种：乳清、乳清蛋白和酪蛋白。
[0010] 换句话说，本发明涉及包含由产乳酸细菌发酵的乳源性发酵产品的组合物用于抑 制巯基蛋白酶活性的用途，所述乳源性发酵产品包含i)乳酸和/或乳酸盐，ii)选自以下 的至少一种：乳清、乳清蛋白和酪蛋白。
[0011] 本发明还涉及通过降低巯基蛋白酶活性，优选地通过降低胃肠道中巯基蛋白酶活 性来治疗和/或预防人类受试者中的巯基蛋白酶介导的疾病的方法，所述疾病选自：胃肠 炎症、炎性肠病、肠易激综合征、绞痛、肠痉挛、腹痛和胃肠感染，包括向人类受试者给予包 含由产乳酸细菌发酵的乳源性发酵产品的营养组合物，所述乳源性发酵产品包含i)乳酸 和/或乳酸盐，ii)选自以下的至少一种：乳清、乳清蛋白和酪蛋白。
[0012] 还可将本发明描述为由产乳酸细菌发酵的乳源性发酵产品用于制备营养组合物 的用途，所述发酵的乳源性产品包含i)乳酸和/或乳酸盐，ii)选自以下的至少一种：乳 清、乳清蛋白和酪蛋白，所述营养组合物用于通过降低巯基蛋白酶活性，优选地通过降低胃 肠道中巯基蛋白酶活性，来治疗和/或预防巯基蛋白酶介导的疾病，所述疾病选自：胃肠炎 症、炎性肠病、肠易激综合征、绞痛、肠痉挛、腹痛和胃肠感染。
[0013] 还可将本发明描述为包含由产乳酸细菌发酵的乳源性发酵产品的营养组合物，用 于通过降低巯基蛋白酶活性，优选地通过降低胃肠道中巯基蛋白酶活性，来治疗和/或预 防巯基蛋白酶介导的疾病，所述乳源性发酵产品包含i)乳酸和/或乳酸盐，ii)选自以下的 至少一种：乳清、乳清蛋白和酪蛋白，所述疾病选自：胃肠炎症、炎性肠病、肠易激综合征、 绞痛、肠痉挛、腹痛和胃肠感染。
[0014] 在一个方面，本发明还涉及提高营养组合物中巯基蛋白酶抑制剂活性的方法，其 中，所述营养组合物包含如乳或包含乳糖以及选自以下的至少一种：乳清、乳清蛋白和酪蛋 白，所述方法包括由产乳酸细菌对所述营养组合物的发酵。
[0015] 需要注意的是，不管在本说明书中任何地方使用如"本营养组合物"或"根据（本） 发明的营养组合物"的表述，其也指根据本发明的方法和用途。
[0016] 疏基蛋白酶抑制剂
[0017] 本文使用的术语"蛋白酶"指的是能够通过裂解肽键来水解蛋白质和/或肽的酶。 本文使用的术语"巯基蛋白酶"指的是在活性中心具有巯基基团的蛋白酶。这些酶的活性 巯基基团是源自所存在的半胱氨酸残基。本发明中使用的术语巯基蛋白酶抑制剂指的是能 够抑制所述巯基蛋白酶的作用的化合物、物质和/或组合物。更优选地，被抑制的巯基蛋白 酶活性是木瓜蛋白酶和组织蛋白酶如组织蛋白酶B、D和L的活性。
[0018] 可如本领域中已知地测量巯基蛋白酶活性，如木瓜蛋白酶（也可参见实施例）。木 瓜蛋白酶活性的一个单位定义为在pH6. 2、25°C下每分钟水解1. 0μmole的N-α-苯甲酰 基-L-精氨酸乙酯（ΒΑΕΕ)(根据供应商Sigma-Aldrich的产品信息表）。木瓜蛋白酶也被 称作番木瓜蛋白酶（papainase)或木瓜肽酶I(EC3. 4. 22. 2)。
[0019] 巯基蛋白酶抑制剂的一个单位（TIU)定义为抑制具有2个单位的活性的巯基蛋白 酶制剂的50%的抑制剂的量。木瓜蛋白酶抑制剂的一个单位（PIU)定义为抑制具有2个单 位的活性的木瓜蛋白酶制剂的50%的抑制剂的量。在根据本发明的方法或用途的一个实 施方案中，所述营养组合物的巯基蛋白酶抑制剂活性为至少40个木瓜蛋白酶抑制剂单位 (PIU)/g营养组合物干重。
[0020] 发酵产品
[0021] 发酵是使用内源性的电子受体从碳水化合物（如乳中存在的乳糖）的氧化中取 得能量的过程，所述电子受体通常为有机化合物。这与细胞呼吸相反，在细胞呼吸中，电 子是通过电子传递链被供给外源性电子受体，如氧。在本发明中，产乳酸细菌对乳源性产 品（milk-derivedproduct)的发酵具有将乳源性产品中存在的碳水化合物转化成有机酸 的通常含义。除乳酸外，所形成的这些有机酸还可包含其它有机酸如乙酸。乳酸细菌也 被称为产乳酸细菌，并且包括链球菌属（Streptococcus)、乳球菌属（Lactococcus)、乳杆 菌属（Lactobacillus)、明串珠菌属（Leuconostoc)、肠球菌属（Enterococcus)、酒球菌属 (Oenococcus)、片球菌属（Pediococcus)和双歧杆菌属（Bifidobacterium)的细菌。优选 地，所述乳源性产品不是由保加利亚乳杆菌（Lactobacillusbulgaricus)发酵。保加利亚 乳杆菌发酵的产品被认为不适合于婴儿，因为在婴儿中