一种提高乳杆菌耐盐能力的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于乳酸发酵食品技术领域，涉及一种在含盐浓度较高的发酵食品中提高 其中乳杆菌耐盐性的方法。
【背景技术】
[0002] 乳酸菌发酵食品是我国食品工业的重要组成部分，在食品发酵过程中，常用盐来 抑制微生物的生长，高盐浓度是乳酸菌在发酵时遇到的一个主要环境应力。由高盐浓度引 起的溶液渗透压增高，细胞内水分外流，使得发酵品中菌体细胞质壁分离，抑制其生长，甚 至死亡，大大降低了发酵食品的营养价值，限制了其快速发展。
[0003] 由于不同乳酸菌的耐盐能力不同，即使是同属不同种，甚至不同亚种的乳酸菌，其 耐盐能力也有所不同。因此在许多腌渍发酵制品中往往需筛选耐盐性较强的菌株，但即使 相对耐盐性较高的菌株也无法避免其随发酵进行活菌数逐渐降低的问题，如发酵蔬菜、干 酪等，其限制了腌渍发酵食品的发展。此外在乳酸菌直投发酵剂的生产中，高密度培养是其 必要过程，然而在其高密度培养中目前常采用流加碱液来中和乳酸菌代谢产生的乳酸，产 生大量的盐，对乳酸菌又产生了盐胁迫。因此开发提高乳酸菌的耐盐能力的方法，不但可丰 富腌渍发酵食品中乳酸菌菌种同时还可满足乳酸菌高密度生长的要求，从而增加乳酸菌直 投发酵剂中的活菌数，对乳酸菌发酵食品的研究具有重要的实际意义。因此乳酸菌在高渗 环境中存活、生长、代谢的能力对于工业生产至关重要。
[0004] 溶液盐浓度增加会导致溶液渗透压的升高，而菌体为维持正常膨压，往往会启动 自身的抗逆保护性物质，这类物质被称为相容性溶质，是一类极性的、易溶的、生理值条件 下不带电荷并且可以在细胞内高浓度积累（能达到lmol/kg)而不影响细胞的主要功能和蛋 白质分子的正确折叠的小分子有机物质。目前这种物质在嗜盐菌中被广泛研究，然而乳酸 菌在盐胁迫下是否转运相容性溶质，转运的相容性溶质是否对其具有抗盐胁迫作用及它们 是否有交互作用，还未见报导。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种使乳酸菌在亚致死盐浓度条件下提高其活菌数，即提 高乳酸菌耐盐性的方法。
[0006] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的： 一种提高乳杆菌耐盐能力的方法，包括以下步骤： 一、 将活化好的目的菌株或直投发酵剂按要求接入到待发酵物质中，混均； 二、 所用乳杆菌耐盐保护物质为一类相容性溶质的混合物，将相容性溶质用去离子水 或待发酵液溶解，温度不得超过50°C，然后过0. 滤膜，所述相容性溶质为四氢嘧啶、甲 硫氨酸、组氨酸、赖氨酸、组氨酸或脯氨酸； 三、 将步骤二中的各种相容性溶质进行两两互配或多种组合互配，加入到步骤一中的 待发酵物中，使得各种相容性溶质在最终待发酵物中的浓度为4. 5-7. 5mmol/L，然后按待发 酵物发酵条件进行发酵。
[0007] 本发明中，所述目的菌株为乳杆菌属和双歧杆菌属，例如：保加利亚乳标菌、干酪 乳杆菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌等，其中：保加利亚乳杆菌在2%浓度下活菌数仅为4. 33X106 CFU/mL，而加入抗渗保护性相容性溶质后，活菌数可达5. 71X108CFU/mL，可显著增加该菌 的抗盐性。
[0008] 以乳酸菌为例，本发明按照要求将活化好的乳酸菌接入到含有一定盐的食物当中 按该食物发酵培养条件进行发酵，该盐浓度不能超过其亚致死浓度，在该亚致死盐浓度下， 菌体仍能缓慢生长，但生长速度和活菌数较低，通过对乳杆菌细胞膜的通透性、完整性等一 系列的研究，开发出一种增加乳杆菌抗盐能力的方法，其具有如下优点： 1、本发明可使乳杆菌在高渗溶液下与非盐胁迫保持近似的细胞膨压、Zeta电位、细胞 膜通透性及流动性，从而保持了细胞膜的稳定性，增加了乳杆菌抗盐能力，使其在亚致死条 件下仍能保持很高的活性。
[0009] 2、本发明的应用使得一些盐敏感性菌株也可应用到腌渍品中，大大提高我国腌渍 品的种类提高其营养价值。
[0010] 3、本发明还可应用到直投发酵剂生产中，提高菌体活菌数，可降低直投发酵剂的 使用量，节约生产成本。
[0011] 4、加入本发明确定了可增加乳杆菌的耐盐能力的物质为相容性溶质，该种相容性 溶质混合物及添加量，可使乳杆菌在亚致死浓度下活菌菌数提高1倍左右，所添加的相容 性溶质属氨基酸及嘧啶类相容性溶质，在提高菌体耐盐能力同时可补充氨基酸及嘧啶，所 用相容性溶质加入到食品中无毒无害，其中四氢嘧啶还有一定抗炎功效。
【附图说明】
[0012] 图1为不同条件发酵白菜pH变化； 图2为加盐加相容性溶质后发酵白菜中菌体生长变化； 图3为双歧杆菌在加相容性溶质的恒定pH发酵中菌体生长变化； 图4为200倍激光共聚焦显微镜下的德式乳杆菌保加利亚亚种荧光染色结果（只加 盐）； 图5为200倍激光共聚焦显微镜下的德式乳杆菌保加利亚亚种荧光染色结果(不加 盐）； 图6为200倍激光共聚焦显微镜下的德式乳杆菌保加利亚亚种荧光染色结果(加入相 容性溶质组合）； 图7为不同培养条件下德式乳杆菌保加利亚亚种细胞膜完整性比例变化，图中a、b、*、 林、A、B表示差异显著性，不同字母代表显著性差异（K0. 05)，相同字母代表不显著性差异 im.05)； 图8为不同培养条件下德式乳杆菌保加利亚亚种细胞膜流动性的变化，P为偏振度，ri为细胞膜微粘度。图中a、b、c、*、**表示差异显著性。不同字母代表显著性差异（代0· 05)， 相同字母代表不显著性差异（/M). 05)。
【具体实施方式】
[0013] 下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对 本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵 盖在本发明的保护范围中。
[0014] 实施例1 : 本实施例提供了一种提高乳杆菌耐盐能力的方法，该方法可在发酵酸菜中应用，具体 方法如下： 白菜原料经洗净、漂烫、晾干后，进行切分，再用10%的盐水浸泡lOmin后，放入灭菌容 器中。添加质量为蔬菜重量2倍的2%NaCl灭菌溶液，接入发酵蔬菜用的德式乳杆菌保加利 亚亚种和副干酪乳杆菌，比例为1 :1 (V/V)，总接种量为2% ;所用耐盐保护相容性溶质为 甲硫氨酸、组氨酸、赖氨酸及脯氨酸，分别将各种相容性溶质溶于部分蔬菜汁溶液中溶解， 溶解温度不超50°C，混均后过0. 滤膜，然后将各相容性溶质按发酵液重量加入，使甲 硫氨酸、组氨酸、赖氨酸及脯氨酸在待发酵蔬菜中的浓度分别为5. 2mmol/kg、6. 4mmol/kg、 4. 7mmol/kg、5. 7mmol/kg，封口之后在厌氧环境中发酵。相容性溶质的加入降低了菌体因盐 浓度导致的活菌数及生长活力下降的问题，加快了菌体产酸速度，大大缩短了发酵生产周 期。
[0015] 由图1可知：加入相容性溶质后菌体在高盐浓度下仍可继续快速代谢产酸，发酵5 天后pH开始缓慢下降，说明加入该发明的相容性溶质可以增加菌体的抗盐能力，不影响菌 体生长，仍可正常代谢产酸，而不加相容性溶质的菌体发酵蔬菜产酸速度缓慢，发酵8天后 pH仍在缓慢下降，说明菌体在该盐浓度不加任何抗盐保护物质菌体生长代谢受到了抑制。
[0016] 实施例2: 本实施例提供了一种提高乳杆菌耐盐能力的方法，该方法在发酵泡菜中应用，具体方 法如下： 将准备腌制的原料如：胡萝卜、白萝卜、卷心菜等洗净、漂烫、晾干后，进行切分，将原料 用20%-25%的食盐溶液预泡一定时间后取出沥干，放入泡菜坛中，装至距坛口 7cm左右，接 入发酵泡菜用菌株，随即注入所配制的泡菜盐水，使用盐水将蔬菜浸没后密封坛口。经20°C 发酵3天后，制品仍含很高的菌体密度，可增加产品的营养价值，且主要风味物质双乙酰及 总酯含量与不加相容性溶质的对照样无显著差别。
[0017] 发酵泡菜用菌株处理：将培养24h后的嗜酸乳杆菌与植物乳杆菌发酵液在3000 r/min离心15min后，用生理盐水清洗2次菌体然后接入到盐水浸泡的蔬菜中（总接菌量为 3%V/ff)〇
[0018] 泡菜水的配制：泡菜水含盐量以6%_8% (v/v)为宜，同时加入发酵泡菜菌株的耐 盐保护物质一一相容性溶质，该相容性溶质由甲硫氨酸、组氨酸组成，分别将其溶于部分泡 菜水中，溶解后过〇. 2μπι滤膜，然后依次加入到待发酵的蔬菜中混均，使甲硫氨酸、组氨酸 在待发酵蔬菜中的浓度为5. 2mmol/L、4. 9mmol/L。
[0019] 表1加相容性溶质后双乙酰含量
表2加相容性溶质后总酯含量
由表1和2可以看到，相容性溶质