一种利用食药真菌发酵三叶青获得的组合物及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及=叶青的加工利用领域，具体设及一种利用食药真菌发酵=叶青获得 的组合物及其制备方法。
【背景技术】
[0002] S叶青（Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg)为葡萄科崖爬藤属植物，風I 名:金线吊葫芦、石老鼠、蛇附子、属鼠李目，葡萄科草质藤本。学名叶崖爬藤，是浙江、福 建等地区传统习用青草药，W地下块根和果实的药用效果最好。在浙江民间用=叶青治疗 肿瘤较为久远，=叶青是地方性药材，极为珍稀，分布在浙江、江西、福建、安徽、广东、广西、 云南等地，=叶青具有散热、理气、活血、补脾、解毒、桂风、消炎的作用，民间用来治疗小儿 高热、慢性咽喉炎、扁桃体炎、肝炎、肺炎、胃炎、淋己结核及蛇咬伤等有奇效。现代药理研究 表明=叶青具有抗炎、镇痛及解热、抗肿瘤、抗病毒、调节免疫等作用。
[0003] 目前，=叶青中的活性成分多采用传统的提取、分离方法得到，如中国专利 化200510050649.5中公开的用于预防和治疗肿瘤的中药S叶青，其采用的是由S叶青为原 料的水和/或醇提取物作活性成分。中国专利申请CN201110264176.4中公开的超临界二氧 化碳萃取=叶青总黄酬的方法，将=叶青药材粉碎60-80目，加入超临界二氧化碳萃取罐， 通入液态二氧化碳和夹带剂，在压力20-30MPa、溫度40-50°C条件下，萃取2-3小时，分离器 中减压解析萃取物，回收试剂，干燥得S叶青总黄酬。中国专利化200810120750.7公开了一 种从=叶青中高效提取黄酬类化合物的工艺，其工艺流程为:原料=叶青，风干，切碎，加入 水于超声波提取器中提取，将提取液浓缩至一定体积，再用活性炭进行吸附脱色。接着利用 空化混悬萃取分离装置，先用乙酸乙醋萃取，回收乙酸乙醋，将水溶液部分用氯仿萃取，回 收氯仿，将水溶液部分浓缩至无有机试剂味，通过大孔吸附树脂，依次用水和50 %乙醇洗 脱，收集50 %乙醇洗脱液，回收溶剂至干，即得到=叶青提取物。
[0004] =叶青中含有多糖、黄酬、多酪等活性成分和淀粉、蛋白质等营养成分，传统的提 取、分离其活性成分工艺中，淀粉、蛋白质、刺激性成分等成分会一道提取出，增加了分离中 的处理步骤，导致最终产品中的活性成分含量偏低、活性偏低。
【发明内容】
[0005] 本发明提供了一种利用食药真菌发酵=叶青获得的组合物，该组合物中活性成分 的含量和活性高，具有良好的降血脂功能。
[0006] 本发明还提供了一种利用食药真菌发酵=叶青获得的组合物的制备方法，利用多 种真菌发酵=叶青，有助于提高最终产品中活性成分的含量和活性，得到具有降血脂功能 的发酵组合物。
[0007] 本发明发现，根据=叶青营养成分和有效成分特点，通过本发明特定的真菌发酵 及特定的工艺，并向培养基中添加白巧，能够有效地将=叶青中的营养成分和有效成分进 行生物降解和利用、有效地将=叶青中的刺激性成分去除和转化，使=叶青资源得到充分 的利用，有助于提高最终产品中活性成分的含量和活性。
[0008] 本发明采用的技术方案是：
[0009] -种利用食药真菌发酵=叶青获得的组合物的制备方法，包括步骤：
[0010] (1)取活化后的己西磨茹菌种接种到液体MRS培养基中培养2天-8天，离屯、收集第 一菌体;将第一菌体悬浮在含胆盐的液体MRS培养基中于18°C-30°C解育化-2化，离屯、收集 第二菌体;将第二菌体经PBS缓冲液清洗干净后重新悬浮于液体MRS培养基中，震荡摇匀得 到第二菌体液，将第二菌体液接种到含胆盐的液体MRS培养基中于18°C-30°C再培养1天-10 天，得到己西磨茹液体种子液；
[0011] (2)取活化后的链霉菌菌种接种到液体MRS培养基中培养化-3化，离屯、收集第S菌 体，将第S菌体悬浮在含化Cl的液体MRS培养基中于20°C -30°C解育0.化-1化，离屯、收集第 四菌体;将第四菌体经PBS缓冲液清洗干净后重新悬浮于液体MRS培养基中，震荡摇匀得到 第四菌体液，将第四菌体液接种到含化Cl的液体MRS培养基中于20°C -30°C培养化-3化，得 到链霉菌种子液；
[0012] (3)将步骤（1)的己西磨茹液体种子液接入=叶青固态发酵培养基中，在18°C-30 °C培养2天-20天，然后置于交变磁场环境中再培养5天-30天，培养产物经真空冷冻干燥、粉 碎后得=叶青固态发酵产物;所述=叶青固态发酵培养基中含有=叶青和白巧；
[0013] (4)将步骤(3)的=叶青固态发酵产物经亚临界水萃取，得到=叶青发酵亚临界萃 取物I，萃取后所剩的残渣经真空冷冻干燥后得到萃取剩余物n。
[0014] (5)将步骤(2)的链霉菌种子液接入链霉菌液体发酵培养基中，在2(TC-3(rC培养 1化-I20h，离屯、，得到链霉菌发酵产物m;所述链霉菌液体发酵培养基中含有萃取剩余物 n;
[0015] 所述利用食药真菌发酵=叶青获得的组合物为=叶青发酵亚临界萃取物I和链霉 菌发酵产物m。
[0016] 本发明进行S叶青固态发酵时，直接采用经含胆盐的液体MRS培养基两步解育处 理的己西磨茹液体种子液，并向培养基中添加白巧，能够有效地将=叶青中的营养成分和 有效成分进行生物降解和利用、有效地将=叶青中的刺激性成分去除和转化，有助于提高 最终产品中活性成分的含量和活性。步骤(4)和步骤(5)中，将=叶青固态发酵产物进行亚 临界水萃取，使萃取物中有效成分的活性得W最大程度保留、含量得W大幅提高;再将萃取 后的残渣作为链霉菌液体发酵主要的培养基，且采用经含化Cl的液体MRS培养基两步解育 处理的链霉菌种子液，通过一体化循环利用，使=叶青资源得到充分的利用，进一步提高了 最终产品中活性成分的含量和活性。
[0017]为了达到更好的效果，优选：
[0018] 步骤（1)中，所述含胆盐的液体MRS培养基中胆盐的质量百分含量为0.0 5 % -0.5%。
[0019] 所述第一菌体与用于悬浮第一菌体的含胆盐的液体MRS培养基的体积比为1:1-3， 第二菌体与用于悬浮第二菌体的液体MRS培养基的体积比为1:1-3,第二菌体液的接种量为 5%。
[0020] 步骤(2)中，所述含NaCl的液体MRS培养基中NaCl的质量百分含量为0.5 % -8 %。 [0021 ]所述第S菌体与用于悬浮第S菌体的含化Cl的液体MRS培养基的体积比为1:1-3， 第四菌体与用于悬浮第四菌体的液体MRS培养基的体积比为1:1-3,第四菌体液的接种量为 3%。
[0022] 步骤(3)中，所述=叶青采用=叶青块根;所述白巧采用白巧块根。所述=叶青固 态发酵培养基每IL中含有6.5g-9.5g =叶青块根和0.5g-3.5g白巧块根。所述=叶青固态发 酵培养基由=叶青块根、白巧块根和发酵基础培养基组成，所述发酵基础培养基采用本领 域常规的发酵基础培养基，可采用市售产品，也可采用现有配制方法配制。
[0023] 所述=叶青固态发酵培养基的制备方法，包括:将新鲜=叶青块根、白巧块根在自 来水下冲洗干净，惊干，切分为lcm-2cm长片状或小块;再将6.5g-9.5gS叶青块根和0.5g-3.5g白巧块根用发酵基础培养基定容至1L，混合均匀，pH值自然，得到=叶青固态发酵培养 基。
[0024] 所述己西磨茹液体种子液的接入量为=叶青固态发酵培养基体积的5%-25%。
[0025] 目前真菌固态发酵技术普遍存在发酵周期长、菌丝生长萌发慢、特征次生代谢代 谢产物含量低等问题。本发明发现将交变磁场处理技术应用于固态发酵中，通过特定培养 时期的适当处理等外界因素有效刺激，提高真菌菌丝在=叶青培养基料上的生长代谢，缩 短发酵时间，有效促进次生代谢产物的生成。所述交变磁场环境中磁场强度为0.1 mT-SmT, 磁场频率为2HZ-30化。
[0026] 步骤（4)中，所述亚临界水萃取的条件为：水料质量比为10-50:1，萃取压力在 4MPa-25MPa，萃取溫度为100°C-180°C，萃取时间为10min-90min。
[0027] 步骤(5)中，所述链霉菌液体发酵培养基每IL中含有0.2g-lg萃取剩余物n。所述 链霉菌液体发酵培养基由萃取剩余物n和发酵基础培养基组成，所述的发酵基础培养基采 用本领域常规的发酵基础培养基，可采用市售产品，也可采用现有配制方法配制。
[00%] -般发酵基础培养基由W下质量百分比的组分组成：葡萄糖1%-3%、K油P〇4 0.1%-〇.2%、MgS〇4 0.05%-0.1%和余量的水。
[0029] 所述链霉菌液体发酵培养基的制备方法，包括:将o.2g-ig萃取剩余物n用发酵基 础培养基定容至1L，混合均匀，pH值自然，得到链霉菌液体发酵培养基。
[0030] 所述链霉菌种子液的接入量为链霉菌液体发酵培养基体积的3%-15%。
[0031] 所述己西磨茹菌种可采用现有任意一种己西磨茹菌种，可采用市售产品，例如：己 西磨茹(Agaricus blazei Mu;rill)AC(X50645菌种，购于中国农业微生物菌种保藏管理中 屯、。
[0032] 所述链霉菌菌种可采用现有任意一种链霉菌菌种，可采用市售产品，例如:链霉菌 (Streptomyces )ACCC40462菌种，购于中国农业微生物菌种保藏管理中屯、。
[0033] 所述液体MRS培养基采用本领域常规的液体MRS培养基，可采用市售产品，也可采 用现有配制方法配制。一般液体MRS培养基的组成为:蛋白腺10.Og、牛肉浸膏10.Og、酵母浸 膏5.Og、葡萄糖20.Og、乙酸钢5. Og、巧樣酸氨二锭2. Og、吐溫-801. OmU憐酸