示了选择的烟草样品中的游离的和基质结合的NNK浓度。
[0040] 图2显示了根据本公开内容的实施方案之一通过高压灭菌从经水洗涤的白肋烟 草茎释放的NNK。
[0041] 图3显示了根据本公开内容的实施方案之一通过高压灭菌从3R4F填充物释放的 NNK0
[0042] 图4显示了根据本公开内容的实施方案之一高压灭菌和洗涤对白肋烟草茎中的 游离的和结合的NNK的影响。
[0043] 图5显示了如使用填充了玻璃绒的巴氏吸管尖部中的热电偶和试验的烟草材料 所确定的，在递增温度下NNK、NNN和烟碱从经洗涤的白肋烟草茎或经洗涤的-高压灭菌 的-经洗涤的白肋烟草茎的释放。
【具体实施方式】
[0044] 定义
[0045] 在本申请的范围内使用的技术术语和表达通常被赋予在植物和分子生物学的相 关领域中经常应用于它们的含义。所有以下术语定义适用于本申请的整个内容。词语"包 含/包括"不排除其它元件或步骤，且不定冠词"一个"或"一种"不排除多个/多种。单个 步骤可以完成在权利要求中列出的几个特征的功能。关于属性或值的术语"基本上"、"约"、 "大约"等各自也特别地限定刚好该属性或刚好该值。关于给定的数字值或范围的术语"约" 表示在给定的值或范围的20%内、10%内或5%内的值或范围。
[0046] 本文中使用的术语"减少"、"减小"、"抑制"或"遏制"包括数量的至少约5 %、至少 约10 %、至少约20 %、至少约30 %、至少约40 %、至少约50 %、至少约60 %、至少约70 %、至 少约75%、至少约80%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%或直到100% 的减少。
[0047] 本文中使用的术语"至少一部分"包括数量的至少约5%、至少约10%、至少约 20 %、至少约30 %、至少约40 %、至少约50 %、至少约60 %、至少约70 %、至少约75 %、至少 约80 %、至少约90 %、至少约95 %、至少约98 %或至少约99 %。
[0048] 术语"烟草材料"表示烟草植物的任何部分或不同烟草植物的混合物，且包括但不 限于烟草散叶、烟草绿散叶、烟草茎、在烟草加工过程中产生的烟草尘和烟草叶初生薄片条 和它们的组合。所述烟草材料可以具有经加工的烟草部分或块的形式、呈基本上天然的薄 片或茎形式的干制的和老化的烟草、烟草提取物或前述物质的混合物，例如，将提取的烟草 浆与造粒的干制的和老化的天然烟草薄片组合的混合物。所述烟草材料可以呈固体形式、 呈液体形式、呈半固体形式等。所述烟草材料可以呈已经进行匀浆化（包括、但不限于切割 和碾磨）的烟草匀浆物的形式。所述烟草匀浆物可以从完整烟草植物制备，或从已经进行 匀浆化的植物组分的混合物（诸如茎和叶的混合物）制备。所述烟草材料可以呈烟草浆的 形式，包括烟草材料或烟草匀浆物在水性溶液或溶剂中的混悬液。所述浆可以是5% (w/ v)、10% (w/v)、15% (w/v)、20% (w/v)或25% (w/v)或更高的烟草在水性溶液或溶剂中的 混合物。
[0049] 术语"烟草产品"包括吸烟制品或可抽吸的制品以及无烟烟草产品。
[0050] 本文中使用的术语"游离的亚硝胺"或其语法变体表示在烟草的提取物中计算的 亚硝胺浓度。
[0051] 本文中使用的术语"总亚硝胺"或其语法变体表示在对提取混合物进行本文所述 的方法（例如，通过加热至约130°C保持约4小时）以后计算的亚硝胺浓度。
[0052] 本文中使用的术语"结合的亚硝胺"或"基质结合的亚硝胺"或其语法变体代表"总 亚硝胺"和"游离的亚硝胺"浓度之间的差异。
[0053] 本发明可应用于预期用于人消费的、收获的烟草的处理。一般而言，所述方法可以 应用于包含一种或多种烟草特有的亚硝胺（包括NNK)的任何形式的烟草材料。适当地，一 种或多种烟草特有的亚硝胺的至少一部分结合至不溶性烟草基质。适当地，NNK的至少一部 分结合至不溶性烟草基质。用于测量游离的一种或多种亚硝胺和结合至不溶性烟草基质的 一种或多种亚硝胺的方法是本领域众所周知的且在本文描述。简而言之，提取烟草样品的 等分试样，并使用超高效液相色谱法-串联质谱法（UPLC-MS/MS)分析其中的亚硝胺含量。 通常，将一种或多种与要定量的亚硝胺对应的标准品掺入烟草样品的等分试样中。从提取 物计算的样品浓度对应于样品中的"游离的NNK"浓度。用本文所述的方法处理提取混合物 (例如，通过加热至约130°C保持约4小时）以后，再次通过UPLC-MS/MS测量亚硝胺浓度。 从这些值，可以计算样品中的"总NNK"浓度。"结合的NNK"浓度是"总NNK"和"游离的NNK" 浓度之间的差异。已经对烟草进行了许多研究，特别是关于烟草特异性的亚硝胺。新鲜收 获的烟叶被称作"绿烟草"，且认为不含有已知的致癌原，但是绿烟草不适合用于人消费。干 制绿烟草的方法取决于收获的烟草的类型。例如，弗吉尼亚烟烤（淡色（bright))烟草通 常是烟道烘烤的，而白肋烟草和某些深色品系经常是晾干的。与风干一至两个月相比，烟草 的烟道烘烤通常在五至七天的时段内进行。许多重大的化学和生化变化在干制工艺过程中 开始，且持续贯穿叶干燥的早期阶段。烟草从它的黄色至棕色的颜色转变通常导致亚硝胺 的形成和大量积累，以及增加的微生物含量。形成烟草特异性的亚硝胺的确切机制不明，但 是据信会被微生物活性增强，在干制工艺过程中在亚硝酸盐的产生中涉及微生物硝酸还原 酶。
[0054] 根据一个实施方案，本发明提供了用于降低烟草材料中的一种或多种烟草特有的 亚硝胺的水平、量或浓度的方法。根据另一个实施方案，本发明提供了用于降低烟草材料中 的至少NNK的水平、量或浓度的方法。根据一个实施方案，本发明提供了用于降低烟草材料 中的一种或多种烟草特有的亚硝胺（诸如NNK，其结合至不溶性基质）的水平、量或浓度的 方法。
[0055] 在一个方面，提供了减少烟草材料中的一种或多种烟草特有的亚硝胺的量的方 法，所述方法包括下述步骤：(a)提供烟草材料，所述烟草材料包含一种或多种烟草特有的 亚硝胺；(b)任选地将所述烟草材料与第一水性溶液或溶剂组合（例如，混合）；和（C)在 有液体或蒸汽存在下将烟草材料加热至少约30秒达到大于约100摄氏度或101摄氏度的 温度，以从所述烟草材料的不溶性烟草基质释放一种或多种烟草特有的亚硝胺的至少一部 分。在一个实施方案中，在步骤（c)中加热的烟草材料是被润湿的或湿的。例如，所述烟草 材料可以呈至少5% (w/v)混合物的形式。在一个实施方案中，步骤（c)包括加热得自步骤 (b)的含有烟草材料的混合物。通过一个或多个洗涤步骤，从烟草材料释放出释放的一种或 多种烟草特有的亚硝胺的至少一部分。所述方法可以减少烟草材料中的一种或多种烟草特 有的亚硝胺的总量。如以上所讨论的，烟草特有的亚硝胺包括4-(甲基亚硝氨基）-1- (3-吡 啶基）-1- 丁酮（NNK)、N-亚硝基烟碱（NNN)、N-亚硝基新烟草碱（NAT)和N-亚硝基八角楓 碱（NAB)。所述方法可以减少烟草材料中的至少NNK的总量。所述方法可以减少烟草材料 中结合至不溶性基质的一种或多种烟草特有的亚硝胺的总量。所述方法可以减少烟草材料 中结合至不溶性基质的至少NNK的总量。
[0056] 在一个实施方案中，所述烟草材料可以用于制备重构烟草，诸如重构烟草（叶） 片。这些片是可以用再循环的烟草碎料、烟草茎和"等级烟草"制成的纸样材料，所述"等级 烟草"由在烟草加工的任何阶段收集的通常小于30目大小的烟草颗粒组成。所述重构烟草 可以如下制备：提取烟草副产物中的可溶性化学物质，将得自提取的残余烟草纤维加工成 纸，然后将呈浓缩形式的提取的材料重新施加于纸上。
[0057] 因而，在一个方面，提供了用于生产重构烟草的方法，所述方法包括下述步骤：（a) 提供烟草材料，所述烟草材料包含一种或多种烟草特有的亚硝胺；(b)在有液体或蒸汽存 在下将所述烟草材料加热至少约30秒达到大于约100摄氏度的温度，以从所述烟草材料的 不溶性烟草基质释放一种或多种烟草特有的亚硝胺的至少一部分；（c)从所述烟草材料除 去释放的一种或多种烟草特有的亚硝胺的至少一部分；（d)将得自步骤（C)的烟草材料制 造成重构烟草；和（e)任选地将所述重构烟草掺入烟草产品中。
[0058] 在另一个方面，提供了用于生产重构烟草的方法，所述方法包括下述步骤：(a)提 供烟草材料，所述烟草材料包含一种或多种烟草特有的亚硝胺；(b)任选地将所述烟草材 料与所述第一水性溶液或溶剂组合；（c)在有液体或蒸汽存在下将所述烟草材料加热至少 约30秒达到大于约100摄氏度的温度，以从所述烟草材料的不溶性烟草基质释放一种或多 种烟草特有的亚硝胺的至少一部分；（d)从所述烟草材料除去释放的一种或多种烟草特有 的亚硝胺的至少一部分；（e)从所述烟草材料除去释放的一种或多种烟草特有的亚硝胺的 至少一部分；（f)将所述烟草材料浇铸成一个或多个片；（g)干燥所述一个或多个浇铸片； 和（h)任选地将所述一个或多个片掺入烟草产品中。
[0059] 在一个实施方案中，所述烟草材料包含干制的烟草材料，或由干制的烟草材料组 成，或基本上由干制的烟草材料组成。干制烟叶（特别是绿烟叶）的方法是本领域技术人员 众所周知的，并且包括、但不限于风干、火烤、烟道烘烤和太阳晒。干制烟草材料的方法取决 于收获的烟草的类型。例如，弗吉尼亚烟烤（淡色）烟草通常是烟道烘烤的，白肋烟草和某 些深色品系经常是晾干的，且烟斗烟草、嚼烟和鼻烟经常是火烤的。尽管可以使用得自任何 类型的烟草的烟草材料，某些类型的烟草是优选的。特别优选的烟草材料选自烟道烘烤的 烟草、土耳其烟草、白肋烟草、弗吉尼亚烟草、马里兰烟草、香料烟草或它们中的两种或更多 种的任意组合。烟草材料的形状没有限制。它可以呈匀浆化的烟草材料的形式。它可以呈 经研磨的烟草材料的形式。它甚至可以呈精细粉碎的烟草材料的形式。精细粉碎的烟草材 料通常具有约30-600微米的颗粒尺寸。精细粉碎的烟草材料可以得自已知的用于将烟草 产品制造为这些方法的非主要副产物的任何方法，或可以通过其它尺寸减小方法（诸如碾 磨技术，包括撞击碾磨和滚乳碾磨）得到。烟草匀浆物（诸如但不限于干制的烟草匀浆物） 可以使用本领域已知的多种方法从烟草材料制备，例如，烟草可以呈撕碎的、研磨的、造粒 的、细微粒或粉末形式。烟草可以以部分或块的形式使用，所述部分或块的平均颗粒尺寸小 于在所谓的"细切的"烟草产品中使用的撕碎的烟草的部分或块的平均颗粒尺寸。如果将 烟草形成为非常精细粉碎的烟草颗粒或块，那么可以使它们的尺寸形成为穿过约ISTyler 目、约20Tyler目、约50Tyler目、约60Tyler目、约IOOTyler目、或约200Tyler目或更大的 筛子。如果需要的话，可以将不同大小的烟草匀浆物混合到一起。适当地，使用用于碾磨、 研磨等的设备和技术，将烟草匀浆物研磨或粉末化成粉末类型的形式。适当地，在使用设备 (诸如锤式研磨机、刀盘、气控研磨机等）碾磨或研磨的过程中，烟草是相对干燥的形式。例 如，当烟草部分或块的含水量是小于约15重量％至小于约5重量％时，可以将其碾磨或研 磨。可以用烟叶的某些部分（诸如薄片和茎）或用烟草茎、烟叶和烟草尘形成烟草材料。
[0060] 在使用之前，可以任选地将烟草材料用第一水性溶液或溶剂预洗涤或与第一水性 溶液或溶剂接触。在某些实施方案中，所述第一水性溶液是包含水的无毒水性溶液。在某些 实施方案中，所述第一水性溶液排它地是水。在某些实施方案中，所述第一水性溶液是缓冲 液或含有缓冲液的无毒水性溶液。如果使用缓冲液，那么它将通常是在合乎需要的pH-诸 如至少约pH 5.0、pH 6.0或pH 7.0或更高。当与烟草材料组合或混合时，第一水性溶液 或溶剂可以是，例如，5% (w/v)、10% (w/v)、15% (w/v)、20% (w/v)、25% (w/v)、30% (w/ v)、35% (w/v)、40% (w/v)或45% (w/v)或更高的混合物。在某些实施方案中，使用烟草 材料：水性溶液或溶剂比例为1:5或1:10的混合物。在某些实施方案中，所述预洗涤步骤 在约室温下进行至少约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、90、120、150或180分钟或 更久。在某些实施方案中，所述预洗涤步骤在约室温或高于或低于室温的温度（诸如约20 摄氏度、约30摄氏度、约40摄氏度、约50摄氏度、约60摄氏度、约80摄氏度或约90摄氏 度或更高）下进行。在某些实施方案中，所述预洗涤步骤可以在有物理搅拌和/或更严谨 的洗涤条件（诸如更高的温度和/或剧烈物理搅拌）存在下进行。认为更严谨的洗涤条件 会进一步减少总的烟草特有的亚硝胺含量。
[0061] 可以将烟草材料与水性溶液或溶剂组合以形成混合物。所述水性溶液或溶剂可以 与在预洗涤或接触步骤中使用的第一水性溶液或溶剂相同或不同。可以使用烟草材料来形 成烟草浆或干制的烟草浆。通过将烟草材料（包括匀浆化的或研磨的烟草材料）与水性溶 液或溶剂混合，可以制备烟草浆。水性溶液或溶剂的确切类型或性质没有限制，尽管本发 明的一个优点是，所述水性溶液或溶剂不会将任何另外的毒理学上有关的化合物引入烟草 中。因而，所述水性溶液或溶剂在处理方法中所用的浓度下通常对人健康是无毒的。在某些 实施方案中，所述水性溶液是含有水的无毒水性溶液。在某些实施方案中，所述水性溶液是 缓冲液或含有缓冲液的无毒水性溶液。如果使用缓冲液，那么它将是在合乎需要的PH-诸 如至少约pH 6. O或pH 7. O或更高。当与烟草材料组合时，水性溶液或溶剂可以是，例如， 5% (w/v)n10% (w/v)n15% (w/v)n20% (w/v)n25% (w/v)n30% (w/v)n35% (w/v)n40% (w/v)或45% (w/v)或更高的混合物。
[0062] 在所述方法的另一个步骤中，可以将烟草材料加热至少约10秒、20秒、30秒、40 秒、50 秒或 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50、 60分钟或2、3、4、5、6、7或8或更多小时达到大于约100摄氏度的温度，以从不溶性烟草基 质释放NNK的至少一部分进入烟草材料中。通常，所述加热步骤在有液体存在下进行，所 述液体可以在大于约100摄氏度的温度下变成蒸汽，以从所述烟草材料的不溶性烟草基质 释放一种或多种烟草特有的亚硝胺的至少一部分。适当地，被加热的烟草材料在加热之前 是被润湿的或湿的。例如，所述烟草材料可以呈至少5% (w/v)混合物的形式。适当地，所 述烟草材料是呈本文描述的混合物的形式，且将该混合物加热至少约10秒、20秒、30秒、40 秒、50 秒或 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50、 60分钟或2、3、4、5、6、7或8或更多小时或更久达到如本文中所述的大于约100摄氏度的温 度或达到如本文中所述的大于约200摄氏度的温度，以从不溶性烟草基质释放NNK的至少 一部分进入烟草材料中。可以将烟草材料、被润湿的或湿的烟草材料或包含烟草材料的混 合物加热至少约 10 秒、20 秒、30 秒、40 秒、50 秒或 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50、60 分钟或 2、3、4、5、6、7 或 8 或更多小时达到大于约 100摄氏度的温度，以从不溶性烟草基质释放一种或多种烟草特有的亚硝胺（诸如NNK)的 至少一部分进入烟草材料中。在某些实施方案中，将烟草材料、被润湿的或湿的烟草材料或 包含烟草材料的混合物