本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种环二核苷酸（cGAMP）联合Nivolumab在抗肿瘤中以及在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
肿瘤，目前是一类严重危害人类生命健康的重大疾病，其具体表现为细胞过度增殖和分化异常，且难以抑制。据WHO专家预测，到2020年，全球人口的肿瘤发病人数将达到2000万人，死亡人数将达到1200万人，因此，肿瘤将成为本世纪人类第一大杀手，对人类生存构成最严重的威胁。在中国，包括肺癌、结直肠癌、胃癌、肝癌等的发病率和死亡率均居各类恶性肿瘤的前列，据全国肿瘤登记中心发布的(2012中国肿瘤登记年报》统计，每年新发生肿瘤病例约为312万例，平均每天8 550人，全国每分钟有6人被诊断为癌症。从病种来看，肺癌、胃癌、结/直肠癌、肝癌和食管癌，居全国恶性肿瘤发病的前五位。随着恶性肿瘤发病率和死亡率的逐年增加，恶性肿瘤治疗需求越来越大。特别是随着中国人口的老龄化、淡水食品污染、环境污染等，中国恶性肿瘤患者人数将继续增加。
目前，化疗是治疗肿瘤的常用有效方法之一。传统化疗药物的作用机制主要是阻止脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或蛋白质的合成，或直接对这些大分子发生作用，从而抑制肿瘤细胞的分裂增殖，使之死亡。有些药物也可以通过改变体内激素平衡而抑制肿瘤生长。目前抗肿瘤药物已发展到6大类：①抗代谢药；② 烷化剂；③ 细胞毒素类抗生素；④ 植物生物碱和其他天然药；⑤抗肿瘤激素类；⑥ 铂类及其他抗肿瘤药。随着临床治疗模式的转变和一些新的抗肿瘤药物靶点的发现，抗肿瘤药物领域的研发发生了巨大变化：就药物的作用机制而言，从传统的非特异性的细胞毒类药物转向了非细胞毒类的靶向药物开发。2012年FDA批准的抗肿瘤药物中，小分子酪氨酸激酶抑制剂(TKI)成为研发最热门的一类抗肿瘤药物，尤其是作用于多个靶点的TKI(约占3／4)，截至2013年6月美国FDA批准的TKI已达18种。此外，其他热点作用机制药物包括免疫刺激剂、血管生成抑制剂、细胞周期抑制剂、免疫抑制剂和刺激剂、蛋白激酶抑制剂等。近年来，越来越多免疫调节剂用于临床，并用于肿瘤治疗。
在感染的哺乳动物细胞中微生物和病毒DNA能通过刺激干扰素分泌诱导內源强有力的免疫应答。内质网（ER）受体蛋白（STING）对胞质DNA的免疫应答是必需的因素。最近的研究表明，环化cGMP-AMP二核苷酸合成酶（cGAS）在结合DNA后的活化条件下，内源性地催化cGAMP的合成。cGAMP是一种胞质DNA传感器，它作为第二信使通过STING刺激INF-β的感应，介导TBK1和IRF-3的活化，进而启动INF-β基因的转录。最近报道，重组cGAS在DNA结合条件下催化环化cGMP-AMP二核苷酸GAMP。cGAS结合18bp dsDNA的复合物的晶体结构也已被报道，cGAMP在抗病毒免疫方面的研究已被证实。cGAMP结合STING，使转录因子IRF3激活并产生β干扰素。通过STING通路，cGAMP可被作为免疫调节剂，用于激活免疫系统抗肿瘤。
Nivolumab是百时美-施贵宝公司开发的PD1抗体，并在2014年获得FDA批准上市，目前已经应用于治疗黑色素瘤和乳腺癌。PD1是细胞表面的受体，PD1与PDL1结合后，能够抑制T细胞的活化，从而下调人体免疫反应过程，促使肿瘤细胞逃脱免疫T细胞的识别。Nivolumab能够结合PD1，阻断PD1与PDL1结合，并促使效应T细胞活化，从而杀伤肿瘤细胞，通过该免疫途径，治疗恶性肿瘤。目前，Nivolumab抗体被FDA授予突破性治疗药物，该PD1抗体已开始单独或者联合其它抗体（如CTLA4抗体）等，用于临床上治疗多种癌症。
目前，尚没有文献报道将环二核苷酸cGAMP和PD1-PDL1相互作用抑制性抗体联合使用治疗肿瘤的相关报道。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供cGAMP联合Nivolumab在抗肿瘤中的应用。本发明实验研究表明，cGAMP联合Nivolumab可以显著抑制多种肿瘤细胞的生长，具有明显的抗肿瘤作用，可用于制备抗肿瘤药物。本发明中，所述肿瘤包括但不限于腺癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌、黑色素瘤等。
具体实施方式
下面通过实施例具体说明本发明的内容。在本发明中，以下所述的实施例是为了更好地阐述本发明，并不是用来限制本发明的范围。
实施例1：cGAMP 的制备
cGAMP （环化-GMP-AMP）按文献方法在结合DNA后的活化条件下，由环化cGMP-AMP二核苷酸合成酶（cGAS）催化合成。纯度在98％以上。（Pingwei Li，et al., Immunity, 2013, 39(6), 1019-1031.）
实施例2：Nivolumab的制备
Nivolumab 5C4可变区与鼠IgG2b恒定区融合为杂合抗体，该基因由南京金斯瑞生物科技有限公司合成并克隆到pTT3质粒中。质粒大提试剂盒、Protein A色谱柱、分子筛以及内毒素清除柱、内毒素测定试剂盒购自通用医疗或南京金斯瑞生物科技有限公司。
在293F细胞中瞬时转染表达Nivolumab 5C4。通过Protein A柱、分子筛以及内毒素清除柱（购自通用医疗）纯化后，纯度为98%，内毒素低于1 EU/ml。蛋白溶解于磷酸盐缓冲液，冻干后保存。
实施例3：cGAMP与Nivolumab联合用于抗肿瘤的动物实验
采用荷瘤鼠模型检测cGAMP 与Nivolumab联合抗肿瘤药对动物皮下移植瘤生长的抑制作用及对动物的毒性作用。
受试药物
名称：cGAMP，Nivolumab
性状：白色粉末
溶媒：生理盐水。
配制方法：临用前用生理盐水溶液配制成所需浓度的溶液。
受试药物浓度：cGAMP: 5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml; Nivolumab, 10mg/ml。
实验动物
种属、品系、性别、体重、来源、合格证
C57BL/6鼠，雌性，体重20g，8周龄，SPF 级，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司[实验动物质量合格证号：SCXK （沪）2007-0005 ] 。
饲养条件
所有小鼠，均自由觅食和饮水，在室温（23±2）℃，饲养于中国人民解放军某军医大学实验动物中心。饲料及水均经高压灭菌处理，全部实验饲养过程为SPF级。
剂量设置
cGAMP静脉注射小鼠，设置3个剂量组：5 mg/kg，10 mg/kg， 20 mg/kg
试验对照
阴性对照：生理盐水溶液
阳性对照：Nivolumab，剂量10mg/kg
给药方法
给药途径：尾静脉注射给药
Nivolumab给药次数：每4天1次，给药4次。
给药体积：1ml/kg
cGAMP给药次数：每天1次，连续14天
每组动物数：10只
肿瘤细胞株
腺癌细胞株MC38，肺癌细胞株LLC，乳腺癌细胞株EO771，黑色素瘤细胞株B16-F10，结肠癌细胞MC38，均购自中国科学院细胞库或美国ATCC公司。
试验主要步骤
1．荷瘤鼠模型的建立与干预
分别制备6种皮下移植瘤模型：腺癌细胞株MC38，肺癌细胞株LLC，乳腺癌细胞株EO771，黑色素瘤细胞株B16-F10，结肠癌细胞MC38，并观察cGAMP联合Nivolumab的作用。
腺癌细胞株MC38，肺癌细胞株LLC，乳腺癌细胞株EO771，黑色素瘤细胞株B16-F10，结肠癌细胞MC38培养，传代。在细胞对数期收集细胞，做成浓度为5.0×106每毫升的细胞悬液，C57BL/6鼠右前肢腋下注射0.2 ml细胞悬液 (细胞数目为1.0×106个/只)，7-10 天左右肿瘤长至直径约3-6 mm，致瘤成功。
随机均分为5组，每组10只小鼠：
阴性对照组（静脉注射生理盐水组）
Nivolumab给药组(静脉注10mg/kg组)
cGAMP低剂量联合组(静脉注射cGAMP 5 mg/kg加Nivolumab 10 mg/kg)
cGAMP中剂量组(静脉注射cGAMP 10 mg/kg加Nivolumab 10 mg/kg)
cGAMP组高剂量组(静脉注射cGAMP 20 mg/kg加Nivolumab 10 mg/kg)。
cGAMP每天给药1次，连续给药14天。Nivolumab 每 4天给药一次，共4次。14天后，处死小鼠并称瘤体重量，抑瘤率=[1-实验组平均瘤重／阴性对照组平均瘤重)]×100％。
2．统计分析
数据用x±s表示，利用SPSS10.0软件进行处理，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）检验比较各组瘤重差异的显著性，显著性水平a=0.05。
实验结果
小鼠皮下接种肿瘤细胞后制备成功皮下移植瘤模型，cGAMP联合Nivolumab可明显抑制肿瘤生长，给药14天后的瘤重均显著低于Nivolumab对照组（P<0.05 ， P<0.01），表明cGAMP联合Nivolumab优于单独使用Nivolumab，因此cGAMP可联合Nivolumab使用，且具有显著抗肿瘤作用。具体结果见表1-表5。
表1 cGAMP联合Nivolumab对细胞株MC38腺癌的抑制效果
（n=10，mean±SD）
组别平均瘤重（g）平均抑瘤率（%）
阴性对照组 2.120±0.226 （g） -
Nivolumab组 0.892±0.312 （g） 58.0
cGAMP联合Nivoluma低剂量组 0.742±0.261 （g）* 65.0
cGAMP联合Nivoluma中剂量组 0.671±0.166 （g）** 68.3
cGAMP联合Nivoluma高剂量组 0.439±0.101 （g）** 79.3
注：*P<0.05 vs Nivolumab组；**P<0.01 vs Nivolumab组。
表2 cGAMP联合Nivolumab对细胞LLC肺癌的抑制效果
（n=10，mean±SD）
组别平均瘤重（g）平均抑瘤率（%）
阴性对照组 2.802±0.111 （g） -
Nivolumab组 0.919±0.143 （g） 57.2
cGAMP联合Nivoluma低剂量组 0.799±0.392 （g）** 71.5
cGAMP联合Nivoluma中剂量组 0.612±0.126 （g）** 78.2
cGAMP联合Nivoluma高剂量组 0.509±0.213 （g）** 81.9
注：*P<0.05 vs Nivolumab组；**P<0.01 vs Nivolumab组。
表3 cGAMP联合Nivolumab对细胞EO771乳腺癌的抑制效果
（n=10，mean±SD）
组别平均瘤重（g）平均抑瘤率（%）
阴性对照组 2.610±0.328 （g） -
Nivolumab组 0.640±0.134（g） 75.5
cGAMP联合Nivoluma低剂量组 0.656±0.277 （g） 75.0
cGAMP联合Nivoluma中剂量组 0.541±0.134 （g）** 79.3
cGAMP联合Nivoluma高剂量组 0.485±0.139 （g）** 81.4
注：*P<0.05 vs Nivolumab组；**P<0.01 vs Nivolumab组。
表4 cGAMP联合Nivolumab对细胞B16-F10黑色素瘤的抑制效果
（n=10，mean±SD）
组别平均瘤重（g）平均抑瘤率（%）
阴性对照组 2.72±0.116 （g） -
Nivolumab组 0.901±0.198 （g） 66.9
cGAMP联合Nivoluma低剂量组 0.721±0.161 （g）** 73.5
cGAMP联合Nivoluma中剂量组 0.634±0.172 （g）** 76.7
cGAMP联合Nivoluma高剂量组 0.568±0.133 （g）** 79.1
注：*P<0.05 vs Nivolumab组；**P<0.01 vs Nivolumab组。
表5 cGAMP联合Nivolumab对细胞MC38结肠癌的抑制效果
（n=10，mean±SD）
组别平均瘤重（g）平均抑瘤率（%）
阴性对照组 2.001±0.325 （g） -
Nivolumab组 1.261±0.431 （g） 37.0
cGAMP联合Nivoluma低剂量组 0.821±0.267 （g）** 59.0
cGAMP联合Nivoluma中剂量组 0.579±0.240（g）** 71.1
cGAMP联合Nivoluma高剂量组 0.414±0.198 （g）** 79.3
注：*P<0.05 vs Nivolumab组；**P<0.01 vs Nivolumab组。