本发明涉及一种石菖蒲提取物及其制备方法和应用。
背景技术：
石菖蒲是中药中为数不多的几味芳香开窍药之一，其常用于醒脑开窍，改善学习记忆的中药配方中。据文献记载，石菖蒲的主要药效学作用包括：①.对中枢神经系统的影响：镇静催眠、抗惊厥、益智健脑；②.对心血管系统的影响：抑制血小板聚集、增强血小板变形能力、抗心率失常、减慢心率；③.对消化系统的影响：抑制胃肠肌电活动；④.对免疫功能的影响：提高正常小鼠血清IgG含量、胸腺重量、血清补体C3含量以及巨嗜细胞的吞噬功能等。石菖蒲与中枢神经系统有关的药理药效研究报道有：①.水提液主要兴奋中脑和大脑，而挥发油既兴奋脊髓、又有抑制中脑和大脑的作用；②.去油煎剂、总挥发油和α、β-细辛醚都对小鼠的学习记忆有改善作用；③.水煎液有一定的抗抑郁作用；④.可以明显提高胆碱乙酰化转移酶的活性，促进乙酰胆碱的合成，这可能是石菖蒲改善学习记忆作用的环节之一。因此，很有必要对石菖蒲进行深入研究，以期开发为临床有效的中枢神经系统的治疗药物。在专利一种石菖蒲提取物、含其药物组合物及其制备方法和应用(授权公告号：CN101785816B)和一种石菖蒲提取物及其制备方法和应用(授权公告号：CN101721567B)中研究了石菖蒲经过水提醇沉后所得沉淀的药用效果，但是均未提及醇沉后所得上清液的医用价值。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供了一种石菖蒲提取物及其制备方法和应用。本方法制得的石菖蒲提取物具有显著的改善学习和记忆能力的效果。
本发明提供了一种石菖蒲提取物的制备方法，其包含如下步骤：将经水 提醇沉的石菖蒲药材提取物的上清液，用大孔吸附树脂吸附，洗脱树脂，得洗脱液，即可。
其中，所述的石菖蒲药材为本领域常规用来制备石菖蒲提取物的石菖蒲药材。所述水提醇沉的方法和条件可参照本领域常规提取石菖蒲提取物的方法和条件。较佳地，将石菖蒲药材和水混合提取后，收集提取液；向所述提取液中加醇类溶剂，沉降，收集上清液，即为本发明所述的经水提醇沉的石菖蒲药材提取物的上清液。本发明特别优选以下条件：在所述水提的过程中，水的用量较佳地为石菖蒲质量的6～10倍，更佳地为6～8倍，最佳地为8倍；所述的水提的提取温度较佳地为90℃～100℃；所述的水提的提取时间较佳地为30～120分钟，更佳地为60～120分钟；所述的水提的提取次数较佳地为1～4次，更佳地为2～3次，最佳地为3次。
较佳地，在所述的醇沉之前，将提取液按本领域常规的浓缩方法进行浓缩，如减压浓缩；较佳地，将所述的提取液浓缩至1mL/1g石菖蒲药材～2mL/1g石菖蒲药材为止，更佳地浓缩至1mL/1g石菖蒲药材，收集浓缩液。
在所述的醇沉的过程中，所述的醇类溶剂为本领域常规的石菖蒲水提醇沉所用醇类溶剂，较佳地为乙醇；所述的乙醇较佳地为95％乙醇，百分数为体积百分数；所述的醇类溶剂的加入量较佳地为在所述的醇类溶剂与所述的浓缩液的混合溶液中，加入至含有65～80％的醇类溶剂，更佳地为含有65～75％的醇类溶剂，百分数均为体积百分数；所述的沉降的时间较佳地为加入醇类溶剂后沉降8～12小时；所述的上清液的收集方法可参照本领域常规方法，如：离心收集上清液。
在本发明所述的石菖蒲提取物的制备方法中，较佳地，将所述的上清液浓缩至干并和水混合溶解后，再用大孔吸附树脂吸附。所述的浓缩可按本领域常规的浓缩方法进行操作，如减压浓缩；所述的水的用量为0.2mL/1g石菖蒲药材～0.5mL/1g石菖蒲药材。
所述的用大孔吸附树脂吸附可参照本领域常规的树脂吸附方法，本发明特别优选以下条件：所述的大孔吸附树脂较佳地为D101大孔吸附树脂，更 佳地为D101大孔吸附树脂柱；所述的D101大孔吸附树脂柱的径高比较佳地为1:4～1:12，更佳地为1:8～1:12；所述的用大孔吸附树脂吸附的上样流速较佳地为1～2BV/h，更佳地为1～1.5BV/h。所述的大孔吸附树脂的用量较佳地为0.5mL树脂/1g石菖蒲药材～1mL树脂/1g石菖蒲药材，更佳地为0.6mL树脂/1g石菖蒲药材。
所述洗脱树脂的方法和条件可参照本领域常规树脂洗脱的方法和条件，较佳地，用树脂洗脱剂洗脱吸附后的大孔吸附树脂，收集树脂洗脱液，即可。本发明特别优选以下条件：所述的树脂洗脱剂较佳地为水，所述树脂洗脱剂的用量较佳地为4～6倍树脂体积，更佳地为5倍树脂体积。
本发明所述的石菖蒲提取物制备方法较佳地还包括活性炭吸附步骤：将所述树脂洗脱液用活性炭吸附，洗脱活性炭，收集活性炭洗脱液，干燥，即可。
较佳地，在所述的树脂洗脱液用活性炭吸附之前，将所述的树脂洗脱液按本领域常规的浓缩方法进行浓缩，如减压浓缩。较佳地，将树脂洗脱液浓缩至0.2mL/1g石菖蒲药材～0.5mL/1g石菖蒲药材为止。
所述的用活性炭吸附的方法和条件可参照本领域常规活性炭吸附的方法，本发明优选以下条件：所述的活性炭较佳地为活性炭柱，径高比较佳地为1:4～1:12，更佳地为1:8～1:12；所述的活性炭吸附的上样流速较佳地为1～2BV/h，更佳地为1～1.5BV/h。活性炭的用量较佳地为0.5mL活性炭/1g石菖蒲药材～1mL活性炭/1g石菖蒲药材，更佳地为0.6mL活性炭/1g石菖蒲药材。
所述的洗脱活性炭的方法和条件可参照本领域常规洗脱活性炭的方法和条件，较佳地，用不同活性炭洗脱剂依次洗脱吸附后的活性炭，收集活性炭洗脱液，即可。本发明特别优选以下条件：所述的不同活性炭洗脱剂较佳地为水和乙醇水溶液；所述的乙醇水溶液较佳地为体积分数为30％的乙醇水溶液；所述的洗脱活性炭较佳地用所述的水洗脱活性炭后再用所述的乙醇水溶液洗脱活性炭；所述的水的用量较佳地为3～5倍活性炭体积，更佳地为4 倍活性炭体积；所述的乙醇水溶液的用量较佳地为3～5倍活性炭体积，更佳地为4倍活性炭体积；所述的收集活性炭洗脱液较佳地收集30％乙醇水溶液的活性炭洗脱液。
所述的干燥可按本领域常规干燥方法操作，较佳地为减压浓缩后干燥。
在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明提供了采用上述石菖蒲提取物制备方法制得的石菖蒲提取物。
本发明涉及上述石菖蒲提取物在制备用于提高学习和记忆能力的药物、食品或保健品中的应用。
本发明进一步涉及上述石菖蒲提取物在制备用于预防和治疗老年痴呆症药物中的应用。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明从石菖蒲水提醇沉后的上清液中获得了一种石菖蒲提取物，该提取物具有显著的改善学习和记忆能力的效果，为制备提高学习和记忆能力的药物、食品和保健品，以及治疗老年痴呆症药物提供了新途径。
本发明提供的石菖蒲提取物的制备工艺，还可以增加活性炭的吸附作用，提高了石菖蒲提取物的得率，更适合于工业化大生产。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1 石菖蒲提取物的制备
取石菖蒲药材3.0kg，加入6倍量水，100℃下提取1小时，提取3次，过滤合并提取液，60℃减压浓缩至约3L，即浓缩至约1mL/g药材，加入95％乙醇至乙醇浓度为70％，沉降8h，离心取上清液，浓缩至无醇味，离心取 上清液，浓缩至干，并加1000mL水使溶解，溶液上D101大孔吸附树脂，树脂用量为0.6mL树脂/1g石菖蒲药材，即1800mL树脂，柱径高比为1:8，上样流速为1.0BV/h，上样结束后，用5BV去离子水洗脱树脂柱，收集水洗脱液，60℃减压浓缩至约600mL，冷却后上活性炭，活性炭柱用量为0.6mL活性炭/1g石菖蒲药材，即1800mL活性炭柱，柱径高比为1:8，上样流速为1.0BV/h。上样结束后，先用4BV的去离子水洗脱活性炭柱，弃去水洗脱液，再用4BV的30％乙醇洗脱活性炭柱，收集30％乙醇洗脱液，60℃减压浓缩，干燥，即得样品20.62g，得率约0.69％。
实施例2 石菖蒲提取物的制备
取石菖蒲药材5.0kg，加入8倍量水，100℃下提取1小时，提取3次，过滤合并提取液，60℃减压浓缩至约5L，即浓缩至1mL/1g药材，加入95％乙醇至乙醇浓度为70％，沉降12h，离心取上清液，浓缩至无醇味，离心取上清液，浓缩至干，并加1500mL水使溶解，溶液上D101大孔吸附树脂，树脂用量为0.6mL树脂/1g石菖蒲药材，即3000mL树脂柱，柱径高比为1:8，上样流速为1.0BV/h，上样结束后，用5BV去离子水洗脱树脂柱，收集水洗脱液，60℃减压浓缩至约1000mL，冷却后上活性炭，活性炭柱用量为0.6mL活性炭/1g石菖蒲药材，即3000mL，柱径高比为1:8，上样流速为1.0BV/h。上样结束后，先用4BV的去离子水洗脱活性炭柱，弃去水洗脱液，再用4BV的30％乙醇洗脱活性炭柱，收集30％乙醇洗脱液，60℃减压浓缩，干燥，即得样品68.03g，得率约1.36％。
实施例3 石菖蒲提取物的制备
取石菖蒲药材5.0kg，加入10倍量水，95℃下提取0.5小时，提取4次，过滤合并提取液，60℃减压浓缩至约10L，即浓缩至2mL/1g药材，加入95％乙醇至乙醇浓度为65％，沉降12h，离心取上清液，浓缩至无醇味，离心取上清液，浓缩至干，并加2500mL水使溶解，溶液上D101大孔吸附树脂，树脂用量为1mL树脂/1g石菖蒲药材，即5000mL树脂柱，柱径高比为1:4，上样流速为2.0BV/h，上样结束后，用4BV去离子水洗脱树脂柱，收集水洗 脱液，60℃减压浓缩至约2500mL，冷却后上活性炭，活性炭柱用量为1mL活性炭/1g石菖蒲药材，即5000mL，柱径高比为1:4，上样流速为2.0BV/h。上样结束后，先用3BV的去离子水洗脱活性炭柱，弃去水洗脱液，再用3BV的30％乙醇洗脱活性炭柱，收集30％乙醇洗脱液，60℃减压浓缩，干燥，即得样品55.26g，得率约1.11％。
实施例4 石菖蒲提取物的制备
取石菖蒲药材3.0kg，加入10倍量水，90℃下提取2小时，提取1次，过滤合并提取液，60℃减压浓缩至约6L，即浓缩至2mL/1g药材，加入95％乙醇至乙醇浓度为80％，沉降10h，离心取上清液，浓缩至无醇味，离心取上清液，浓缩至干，并加900mL水使溶解，溶液上D101大孔吸附树脂，树脂用量为0.5mL树脂/1g石菖蒲药材，即1500mL树脂柱，柱径高比为1:12，上样流速为1.5BV/h，上样结束后，用6BV去离子水洗脱树脂柱，收集水洗脱液，60℃减压浓缩至约900mL，冷却后上活性炭，活性炭柱用量为0.5mL活性炭/1g石菖蒲药材，即1500mL，柱径高比为1:12，上样流速为1.5BV/h。上样结束后，先用5BV的去离子水洗脱活性炭柱，弃去水洗脱液，再用5BV的30％乙醇洗脱活性炭柱，收集30％乙醇洗脱液，60℃减压浓缩，干燥，即得样品29.18g，得率约0.97％。
实施例5 石菖蒲提取物的制备
取石菖蒲药材3.0kg，加入6倍量水，100℃下提取2小时，提取2次，过滤合并提取液，60℃减压浓缩至约3L，即浓缩至1mL/1g药材，加入95％乙醇至乙醇浓度为75％，沉降12h，离心取上清液，浓缩至无醇味，离心取上清液，浓缩至干，并加600mL水使溶解，溶液上D101大孔吸附树脂，树脂用量为0.7mL树脂/1g石菖蒲药材，即2100mL树脂柱，柱径高比为1:8，上样流速为1BV/h，上样结束后，用5BV去离子水洗脱树脂柱，收集水洗脱液，60℃减压浓缩至约1000mL，冷却后上活性炭，活性炭柱用量为0.7mL活性炭/1g石菖蒲药材，即2100mL，柱径高比为1:8，上样流速为1BV/h。上样结束后，先用5BV的去离子水洗脱活性炭柱，弃去水洗脱液，再用5BV 的30％乙醇洗脱活性炭柱，收集30％乙醇洗脱液，60℃减压浓缩，干燥，即得样品30.09g，得率约1.00％。
效果实施例1石菖蒲提取物对东莨菪碱所致小鼠记忆获得障碍的影响
采用记忆获得障碍模型分别研究实施例1和实施例2制得的石菖蒲提取物对动物记忆障碍的改善作用。实施例1和实施例2制得的石菖蒲提取物分别简称为SCPd-1和SCPd-2。
实验动物采用小鼠。记忆获得障碍药理实验方法：动物经口灌胃给药，阴性对照组和模型组小鼠给予饮用水，多奈哌齐组给予多奈哌齐1.6mg/kg，SCPd-1高剂量组和低剂量组石菖蒲提取物分别给予5g生药/kg和2.5g生药/kg的石菖蒲提取物SCPd-1，SCPd-2高剂量组、中剂量和低剂量组分别给予7g生药/kg、5g生药/kg和2.5g生药/kg的石菖蒲提取物SCPd-2，连续给药两周。除阴性对照组外其他组别的小鼠最后一次给药后1小时，腹腔注射东莨菪碱3mg/kg。30min后，将所有组别小鼠放入跳台仪内适应5min。然后通电，动物受到电击后的正常反应是跳回平台以躲避伤害性刺激，多数动物可能再次或多次跳至铜栅上，受到电击后又迅速跳回平台，如此训练5min。24小时后重测，记录受电击的动物数，第一次跳下平台的潜伏期和5min内的错误总数。
石菖蒲提取物SCPd-1结果如表1所示，SCPd-2的结果如表2所示.由表1和表2数据可见，石菖蒲提取物SCPd-1和SCPd-2都有明显的改善小鼠学习的作用。
表1.SCPd-1对东莨菪碱所致小鼠记忆获得障碍的影响(n＝10，)
*P＜0.05，**P＜0.01与模型组相比
表2.SCPd-2对东莨菪碱所致小鼠记忆获得障碍的影响(n＝10，)
*P＜0.05，**P＜0.01与模型组相比
效果实施例2石菖蒲提取物对乙醇所致小鼠记忆再现障碍的影响
采用记忆再现障碍模型分别研究实施例1和实施例2制得的石菖蒲提取物对动物记忆障碍的改善作用。实施例1和实施例2制得的石菖蒲提取物分别简称为SCPd-1和SCPd-2。
记忆再现障碍药理实验方法：动物经口灌胃给药，阴性对照组和第模型组小鼠给予饮用水，多奈哌齐组给予多奈哌齐1.6mg/kg，SCPd-1高剂量组 和低剂量组石菖蒲提取物分别给予5g生药/kg和2.5g生药/kg的石菖蒲提取物SCPd-1，SCPd-2高剂量组、中剂量和低剂量组分别给予7g生药/kg、5g生药/kg和2.5g生药/kg的石菖蒲提取物SCPd-2，连续给药两周。末次给药后1小时，所有组别的小鼠分别以避暗法训练一次。将小鼠放入避暗箱内，背朝洞口放入明室，同时启动计时器，动物穿过洞口进入暗室受到电击，计时自动停止。取出小鼠，记录每鼠从放入明室至进入暗室遇到电击所需的时间，此即潜伏期。24小时后进行测试，测试前30min，除阴性对照组外其他组别的小鼠口服给予45％的乙醇溶液(0.1mL/10g)。记录动物由明室进入暗室的潜伏期和5min内的电击次数(错误次数)。
石菖蒲提取物SCPd-1结果如表3所示，SCPd-2的结果如表4所示。由表3和表4数据可见，石菖蒲提取物SCPd-1和SCPd-2都有明显的改善小鼠记忆的作用。
表3.SCPd-1对乙醇所致小鼠记忆再现障碍的影响(n＝10，)
*P＜0.05，**P＜0.01与模型组相比
表4.SCPd-2对乙醇所致小鼠记忆再现障碍的影响(n＝10，)
*P＜0.05，**P＜0.01与模型组相比
将本发明制备的石菖蒲提取物与与授权专利一种石菖蒲提取物、含其药物组合物及其制备方法和应用(授权公告号：CN101785816B)中制备的石菖蒲提取物进行比较，结果如对比例1和对比例2所示。
对比例1所述授权专利的石菖蒲提取物对东莨菪碱所致小鼠记忆获得障碍的影响
所述授权专利效果实施例的实验方法和步骤参照本发明的效果实施例，不同之处在于，用石杉碱甲替换本发明使用的多奈哌齐，并且错误次数的统计时间为3min。其实验结果如表5所示。
表5.SCP-3对东莨菪碱所致小鼠记忆获得障碍的影响
##P<0.01，与空白对照组相比
*P<0.05，**P<0.01，与模型组相比
结合表1、表2和表5中的数据可知，用药量超过2.5g生药/kg的SCPd-1、SCPd-2和SCP-3在小鼠记忆获得障碍的实验中均有效。特别地，在5min内的错误总次数方面，与相应的模型组数据相比可知，本发明的提取物均具有明显区别，具有显著的药效。
对比例2所述授权专利的石菖蒲提取物对乙醇所致小鼠记忆再现障碍的影响
所述授权专利效果实施例的实验方法和步骤参照本发明的效果实施例，不同之处在于，用石杉碱甲替换本发明使用的多奈哌齐。其实验结果如表6所示。
表6.SCP-3对乙醇所致小鼠记忆再现障碍的影响
##P<0.01,与空白对照组相比
*P<0.05，**P<0.01，与模型组相比
结合表3、表4和表6中数据可知，用药量超过5g生药/kg的SCPd-1、 SCPd-2和SCP-3在小鼠记忆再现障碍的实验中均有效。特别地，在5min内的错误总次数方面，与相应的模型组数据相比可知，本发明提取物SCPd-2在2.5g生药/kg时的数据有明显区别，具有显著的药效。