本发明涉及从中药独角莲中发现的一种抗肿瘤活性部位及该活性部位的制备方法与应用。
背景技术：
独角莲(Typhonium giganteum Engl.)为天南星科(Araceae)犁头尖属(Typhonium Schott)植物，是中国特有的一种植物。独角莲主要产于河南、四川、陕西等地，现全国各地亦多栽培，东北地区产量极高，且价格较低廉。白附子(习称禹白附)为独角莲的干燥块茎。《民间草药》、《中药大辞典》记载，独角莲球茎供药用，逐寒湿、祛风痰、镇痉、治中风痰壅，口眼歪斜、破伤风、治跌打损伤、淋巴结核。迄今为止，对这种植物的研究仍较少，仅限于民间偏方使用。
独角莲化学成分的研究主要集中于脂溶性部位，分离得到化合物有脑苷类、有机酸、氨基酸、木脂素类等成分。已有文献对独角莲中氨基酸的含量进行了分析，比如孙启良等(孙启良,卫永第.独角莲各部位氨基酸的含量分析[J].白求恩医科大学学报,1995,21(4):364.)采用氨基酸自动分析仪，测得独角莲的块茎、叶柄、叶片、花和果实的17种氨基酸含量，研究表明独角莲各部位的氨基酸种类齐全，且8种必需氨基酸含量均很高。刘磊等(刘磊，陈燕萍.独角莲地上各部位氨基酸含量的分析[J].吉林大学学报(医学版),2003,29(1)54.刘磊，陈燕萍.独角莲种子中脂肪酸和氨基酸含量分析[J].吉林大学学报(医学版),2003,29(2):168.)分别检测到了独角莲的花蕊、花瓣、果肉、种子、叶中的16种氨基酸成分，且含量随生长期的延长呈有规律性地增长，各部位都以谷氨酸含量最高。
目前对独角莲有效活性成分的研究及应用也处于开发阶段。中国专利CN104072627A公开了一种独角莲多糖提取物的制备方法，应用该工艺提取的独角莲多糖节省提取时间，提取率高，提取物具有显著的抗酪氨酸激酶、抗氧化和抗肿瘤等生物活性。中国专利CN102188564A采用超临界流体技术从独角莲中提取出大量的抗癌活性物质，主要成分是β-谷甾醇和菜油甾醇，该工艺方法要求高，可操作性差。
技术实现要素：
本发明的目的之一在于提供一种独角莲抗肿瘤活性部位，本发明另一个目的是提供一 种独角莲抗肿瘤活性部位的制备方法及其应用。
为了实现以上目的，本发明采用的技术方案为：
一种独角莲的抗肿瘤活性部位，其通过以下方法制备得到：
(1)水提：独角莲鲜品切片烘干，粉碎，加水加热至微沸提取。合并收集水提液，加入乙醇调节醇浓度，离心取上清，减压浓缩至无醇味，得独角莲水提液。
(2)阳离子交换树脂分离纯化：将独角莲水提液转入阳离子交换树脂柱，上样吸附，收集上样流出液；用纯化水冲洗树脂柱，再用氨水洗脱，收集洗脱液减压浓缩后烘干，得中间产物1。
(3)阴离子交换树脂分离纯化：取阳离子交换树脂纯化所得中间产物1，用纯化水溶解转入阴离子交换树脂柱，上样吸附，收集上样流出液，浓缩烘干，得独角莲抗肿瘤活性部位。
发明人对步骤(2)中所用阳离子交换树脂进行了筛选，使用多种型号的阳离子交换树脂作比较，包括001×7、001×4、DL10、DL16和D002等型号的阳离子交换树脂，结果表明001×7阳离子交换树脂柱纯化所得独角莲抗肿瘤活性部位其抗肿瘤活性更好。
发明人对步骤(3)中所用阴离子交换树脂进行了筛选，使用多种型号的阴离子交换树脂作比较，包括D201、D301、D318、201×4和HZ202等型号的阴离子交换树脂，结果表明201×4阴离子交换树脂柱纯化所得独角莲抗肿瘤活性部位其抗肿瘤活性更好。
优选地，本发明的制备方法为：
(1)水提：独角莲鲜品切片烘干，粉碎，加入10倍量水加热至微沸提取2～5次，每次提取2h。合并收集水提液，加入乙醇调节醇浓度至30％，离心取上清，减压浓缩至无醇味，得独角莲水提液。
(2)阳离子交换树脂分离纯化：将独角莲水提液转入001×7阳离子交换树脂柱，上样吸附10～16h，收集上样流出液；用纯化水冲洗树脂柱，再用0.5％的氨水洗脱，收集洗脱液减压浓缩后烘干，得中间产物1。
(3)阴离子交换树脂分离纯化：取阳离子交换树脂纯化所得中间产物1，用纯化水溶解转入201×4阴离子交换树脂柱，上样吸附10～16h，收集上样流出液，浓缩烘干，得独角莲抗肿瘤活性部位。
优选地，所述步骤(1)中微沸提取次数为3次。
优选地，所述步骤(1)中所用乙醇为75％乙醇或95％乙醇。
优选地，所述步骤(2)中，上样吸附时间为12h。
优选地，所述步骤(3)中，上样吸附时间为12h。
本发明的优点与效果是：
本发明提供的独角莲抗肿瘤活性部位，实验结果表明本发明制备方法制备得到的抗肿瘤活性部位对肿瘤细胞具有很好的抑制作用，且长期使用无不良反应，抗肿瘤疗效确切，安全无毒，且可以方便和药学上可接受的载体制备成各种剂型的药物，方便服用。本发明提供的独角莲抗肿瘤活性部位的制备方法简单，可操作性强，成本低，适宜工业化生产。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步详述。
实施例1：独角莲鲜品切片烘干，粉碎，取5kg加入50L水加热至微沸提取2次，每次提取2h。合并收集水提液，加入95％乙醇调节醇浓度至30％，离心取上清，减压浓缩至无醇味，得独角莲水提液；将独角莲水提液转入001×7阳离子交换树脂柱，上样吸附10h，收集上样流出液；用纯化水冲洗树脂柱，再用0.5％的氨水洗脱，收集洗脱液减压浓缩后烘干，得中间产物1；取中间产物1，用纯化水溶解转入201×4阴离子交换树脂柱，上样吸附16h，收集上样流出液，浓缩烘干，得独角莲抗肿瘤活性部位。
实施例2：独角莲鲜品切片烘干，粉碎，取5kg加入50L水加热至微沸提取3次，每次提取2h。合并收集水提液，加入75％乙醇调节醇浓度至30％，离心取上清，减压浓缩至无醇味，得独角莲水提液；将独角莲水提液转入001×7阳离子交换树脂柱，上样吸附16h，收集上样流出液；用纯化水冲洗树脂柱，再用0.5％的氨水洗脱，收集洗脱液减压浓缩后烘干，得中间产物1；取中间产物1，用纯化水溶解转入201×4阴离子交换树脂柱，上样吸附12h，收集上样流出液，浓缩烘干，得独角莲抗肿瘤活性部位。
实施例3：独角莲鲜品切片烘干，粉碎，取5kg加入50L水加热至微沸提取5次，每次提取2h。合并收集水提液，加入75％乙醇调节醇浓度至30％，离心取上清，减压浓缩至无醇味，得独角莲水提液；将独角莲水提液转入001×7阳离子交换树脂柱，上样吸附12h，收集上样流出液；用纯化水冲洗树脂柱，再用0.5％的氨水洗脱，收集洗脱液减压浓缩后烘干，得中间产物1；取中间产物1，用纯化水溶解转入201×4阴离子交换树脂柱，上样吸附10h，收集上样流出液，浓缩烘干，得独角莲抗肿瘤活性部位。
实施例4：独角莲鲜品切片烘干，粉碎，取5kg加入50L水加热至微沸提取5次，每次提取2h。合并收集水提液，加入95％乙醇调节醇浓度至30％，离心取上清，减压浓缩至无醇味，得独角莲水提液；将独角莲水提液转入001×7阳离子交换树脂柱，上样吸附12h，收集上样 流出液；用纯化水冲洗树脂柱，再用0.5％的氨水洗脱，收集洗脱液减压浓缩后烘干，得中间产物1；取中间产物1，用纯化水溶解转入201×4阴离子交换树脂柱，上样吸附16h，收集上样流出液，浓缩烘干，得独角莲抗肿瘤活性部位。
实施例5：独角莲鲜品切片烘干，粉碎，取5kg加入50L水加热至微沸提取2次，每次提取2h。合并收集水提液，加入95％乙醇调节醇浓度至30％，离心取上清，减压浓缩至无醇味，得独角莲水提液；将独角莲水提液转入001×7阳离子交换树脂柱，上样吸附10h，收集上样流出液；用纯化水冲洗树脂柱，再用0.5％的氨水洗脱，收集洗脱液减压浓缩后烘干，得中间产物1；取中间产物1，用纯化水溶解转入201×4阴离子交换树脂柱，上样吸附12h，收集上样流出液，浓缩烘干，得独角莲抗肿瘤活性部位。
对比实施例1：制备方法同实施例1，仅阳离子交换树脂型号与实施例1所用树脂型号不同，采用001x4阳离子交换树脂。
对比实施例2：制备方法同实施例1，仅阳离子交换树脂型号与实施例1所用树脂型号不同，采用DL10阳离子交换树脂。
对比实施例3：制备方法同实施例3，仅阴离子交换树脂型号与实施例3所用树脂型号不同，采用D301阴离子交换树脂。
对比实施例4：制备方法同实施例5，仅阴离子交换树脂型号与实施例5所用树脂型号不同，采用HZ202阴离子交换树脂。
实施例6独角莲抗肿瘤活性部位抗肿瘤实验研究
1、材料
1.1独角莲购自河南禹县(人工栽培)；旋转蒸发仪(步琪R3)；Waters e2695高效液相色谱仪；甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯。
1.2S180小鼠腹水瘤细胞，由中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心提供；RPMI-1640培养基购自GIBCO公司；ICR小鼠4-6周，18-22g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司；
1.3受试药物及处理方法：实施例1、实施例3、实施例5、对比实施例1、对比实施例2、对比实施例3、对比实施例4制备得到的独角莲抗肿瘤有效部位，采用生理盐水溶解。
2、方法
2.1S180细胞株传代培养方法
取体质量(20±2)g健康ICR小鼠，将体外培养良好的S180细胞用生理盐水调节至浓度为1×107个/mL，0.2mL/只注射入小鼠腹腔，每天摄取食、水。每日观察，见腹部胀大，备用。
2.2肿瘤接种、给药方法
无菌条件下抽取生长良好传代小鼠的腹水，生理盐水清洗5遍，去除蛋白等杂质，用生理盐水调节细胞浓度为1×107个/mL，0.2mL/只接种于常规皮肤消毒后的小鼠腋下。
将已成功接种的小鼠按体重随机分组，将独角莲各组分按实验设计剂量灌胃给药，模型组给予等剂量生理盐水，1次/d。末次给药24h后，小鼠称重，处死小鼠剥取瘤块，精密称重。
2.3数据处理方法
应用SPSS17.0软件进行统计学分析，实验数据以表示，P<0.05为有统计学差异。
抑瘤率＝(模型组平均瘤重－用药组平均瘤重)/模型组平均瘤重×100％
3、结果
结果见表1。
表1独角莲抗肿瘤活性成分对S180小鼠腋下实体瘤的抑瘤率
与模型组对照比较，*P<0.05，**P<0.01；与对比实施例1组比较，+P<0.05，++P<0.01；
与对比实施例2组比较，ΩP<0.05，ΩΩP<0.01；与对比实施例3组比较，#P<0.05，##P<0.01；
与对比实施例4组比较，P<0.05，P<0.01。
本发明制备方法所得独角莲抗肿瘤活性部位能显著降低S180小鼠腋下实体瘤的瘤重，具有显著的抗肿瘤效果，与对比实施例相比较，其抗肿瘤效果更好。