用于治疗中性粒细胞减少症的组合物和方法与流程

本发明是根据美国国立卫生研究院授予的资助号CA120512和ARRA-CA120512在政府支持下进行的。政府具有本发明的一定权利。

发明领域

本发明涉及用于利用类视色素激动剂和粒细胞集落刺激因子(G-CSF或GCSF)治疗疾患的组合物、方法和试剂盒。本发明还涉及用于利用细胞治疗所用的离体修饰细胞(诸如来源于造血干细胞[HSC]的粒细胞[例如，中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞])治疗疾患的组合物、方法和试剂盒。所述疾患包括但不限于各种形式的中性粒细胞减少症。

背景

本文中引用的所有公布均以引用方式全部并入本文，就如同每个单独的公布或专利申请被明确地并单独地指示为以引用方式并入本文一般。以下描述包括可用于理解本发明的信息。并不承认本文提供的任何信息都是现有技术，或与目前要求保护的本发明有关，或并不承认明确地或隐含地引用的任何公布是现有技术。

中性粒细胞是最常见的粒细胞，它构成多达70％的主要抵御病原体感染的循环白细胞。癌症化疗诱导的中性粒细胞减少症是一种血液病，其标志是血流中的中性粒细胞数量显著降低，引起微生物感染易感性。约15-40％的癌症患者由于化疗诱导的中性粒细胞减少症而需要治疗延缓和/或剂量减少。由于中性粒细胞减少症导致的死亡率在患有实体肿瘤的患者中为约5％并且在一些血液恶性肿瘤中为11％。

中性粒细胞产生需要在造血干细胞(HSC)的粒细胞生成期间的平衡的增殖和分化。GCSF被用于治疗获得性和先天性中性粒细胞减少症已有二十多年了，因为它促进了HSC的粒细胞生成来再生中性粒细胞。然而，大量响应于GCSF施用而再生的中性粒细胞是不成熟的，因此导致了无效的GCSF治疗，这种治疗无法减少癌症化疗诱导的中性粒细胞减少症(CCIN)患者的感染和感染相关的死亡率。证据支持针对CCIN的GCSF的主要预防用途的成本效益为不确定的，以及最近研究示出，在化疗的第一个疗程期间GCSF的主要预防用途与总体医疗保健成本的57％增加相关联。在美国，CCIN的成本在每次门诊患者发作$1,893至每次发热性中性白细胞减少症住院$38,583的范围内。取决于癌症类型、共病率和感染类型，存在CCIN的临床和经济负担的实质性差异。由于CCIN中炎症反应降低，所以感染的症状和体征减弱或甚至是不存在的。因此，对于发热性中性粒细胞减少症(33.5％)和非发热性中性粒细胞减少症(40.6％)患者来说，化疗占成本的大部分。仅2015的发热性中性粒细胞减少症住院(FNH)的估计成本为约$21亿。此成本不包括治疗非发热性中性粒细胞减少症、需要新化疗的复发癌症患者、先天性中性粒细胞减少症、特发性严重慢性中性粒细胞减少症、周期性中性粒细胞减少症和放射诱导的中性粒细胞减少症的成本。因此，尽管预防性地使用了GCSF，但对于癌症患者来说中性粒细胞减少症仍然保持毁灭性问题，具有实质性的发病率、死亡率和医疗保健成本。因此，对于这些中性粒细胞减少症患者来说，迫切地需要替代的治疗模式。

本文中，发明人证明了类视色素激动剂(例如，Am80)和G-CSF的组合对减少感染和感染相关的死亡率的协同效应。对于治疗中性粒细胞减少症和中性粒细胞减少症相关的疾患，本文提供了利用类视色素激动剂(例如，Am80)与G-CSF对成熟中性粒细胞的再生的协同效应对抵抗感染和感染相关的死亡率的组合物、方法和试剂盒。

发明概述

本发明的各种实施方案提供了一种在受试者体内治疗疾患、预防疾患、减轻疾患的严重程度和/或减缓疾患的进展的方法。所述方法包括以下或可由以下组成：提供类视色素激动剂；提供G-CSF或其类似物；和向受试者施用治疗有效量的类视色素激动剂和G-CSF或其类似物，从而在受试者体内治疗疾患、预防疾患、减轻疾患的严重程度和/或减缓疾患的进展。在各种实施方案中，类视色素激动剂和G-CSF或其类似物可为一种组合物的形式或为单独的组合物的形式。在各种实施方案中，所述方法可还包括向受试者提供并且施用化疗剂和/或抗微生物剂。

本发明的各种实施方案提供了一种组合物，其包含类视色素激动剂和G-CSF或其类似物。在各种实施方案中，组合物可还包含化疗剂和/或抗微生物剂。

本发明的各种实施方案提供了一种用于在受试者体内治疗疾患、预防疾患、减轻疾患的严重程度和/或减缓疾患的进展的试剂盒。试剂盒包括：一定量的类视色素激动剂；一定量的G-CSF或其类似物；和用于使用类视色素激动剂和G-CSF或其类似物来在受试者体内治疗疾患、预防疾患、减轻疾患的严重程度和/或减缓疾患的进展的说明书。在各种实施方案中，试剂盒可还包括化疗剂和/或抗微生物剂以及使用化疗剂和/或抗微生物剂来在受试者体内治疗疾患、预防疾患、减轻疾患的严重程度和/或减缓疾患的进展的说明书。

本发明的各种实施方案提供了一种生成成熟粒细胞的方法。所述方法包括提供细胞(例如，HSC、骨髓粒细胞祖细胞和造血CD34+细胞)以及用类视色素激动剂和G-CSF或其类似物刺激细胞，从而生成成熟粒细胞。本发明的各种实施方案进一步提供了一种组合物，其包含再生的成熟粒细胞。在各种实施方案中，组合物还包含类视色素激动剂和G-CSF或其类似物。在某些实施方案中，粒细胞是中性粒细胞。

本发明的各种实施方案提供了一种在受试者体内治疗疾患、预防疾患、减轻疾患的严重程度和/或减缓疾患的进展的方法。所述方法包括提供细胞(例如，HSC、骨髓粒细胞祖细胞和造血CD34+细胞)，用类视色素激动剂和G-CSF或其类似物刺激细胞，从而生成粒细胞，以及向受试者施用生成的粒细胞，从而在受试者体内治疗疾患。在某些实施方案中，粒细胞是中性粒细胞。在各种实施方案中，生成粒细胞是刺激粒细胞的形成。

本发明的各种实施方案提供了一种在受试者体内治疗疾患、预防疾患、减轻疾患的严重程度和/或减缓疾患的进展的方法。所述方法包括提供细胞(例如，HSC、骨髓粒细胞祖细胞和造血CD34+细胞)，用类视色素激动剂和G-CSF或其类似物刺激细胞，以及向受试者施用刺激的磁暴，从而在受试者体内治疗疾患。

类视色素激动剂的实例包括但不限于他米巴罗汀(tamibarotene)(Am80、视黄苯甲酸(retinobenzoic acid)、Amnoid、他米巴罗(Tamibaro))、CH55、ITYA(ITYA-01115)、Am580、BD4或NRX195183(也称为AGN195183)或它们的功能等同物、类似物或衍生物。G-CSF或其类似物的实例包括但不限于野生型G-CSF、重组G-CSF、G-CSF单体或二聚体、重组人G-CSF(rhG-CSF)二聚体、G-CSF突变体、G-CSF融合蛋白、G-CSF片段、修饰的G-CSF多肽、PEG化G-CSF、糖基化G-CSF和在特定赖氨酸(Lys 17)处用Y形支链聚乙二醇(YPEG-G-CSF)修饰的G-CSF。

本发明的各种组合物、方法和试剂盒在治疗各种疾患，包括但不限于各种形式的中性粒细胞减少症和中性粒细胞减少症相关的疾患，中具有实用性。作为非限制性实例，本发明的组合物、方法和试剂盒可结合癌症治疗(例如，化疗和放射治疗)和/或微生物感染的治疗一起使用。

本发明的各种实施方案提供了用于确定有需要的受试者体内的治疗功效的方法。所述方法包括：提供来自受试者的样本，其中受试者已施用了有效量的类视色素激动剂和有效量的G-CSF；测定反应性氧物质(ROS)的产生水平；以及如果ROS产生高于参考样本的ROS产生，那么确定治疗是有效的，或如果ROS产生与参考样本相同或相对于参考样本较低，那么确定治疗是无效的。

附图简述

在参考的附图中说明示例性实施方案。本文公开的实施方案和附图旨在被视为说明性的而非限制性的。

图1示出根据本发明的各种实施方案，细胞周期、RA靶基因表达和一般转录通过有利CAK和含TFIIH的CAK两者的磷酸化调控。

图2示出根据本发明的各种实施方案，MAT1蛋白固有程序性裂解成M30和pM9片段降低RARα的CAK磷酸化，导致是平衡的髓细胞生成性扩增和分化的基础的粒细胞。CMP：普通骨髓祖细胞；GMP：粒细胞/单核细胞组细胞；并且Gra：粒细胞。

图3示出根据本发明的各种实施方案，相比于RA，Am80选择性激活RARα以诱导新型转录应答，从而实现刺激髓细胞的扩增和分化。带状向上箭头指出扩增增加，并且带状向下箭头指示扩增减小。

图4示出根据本发明的各种实施方案，在人(左图)和小鼠(右图)中化疗诱导的中性粒细胞减少症的比较，以确立小鼠模型类似于人中性粒细胞减少症。

图5示出根据本发明的各种实施方案，EC₅₀测试示出，人等效低和中等剂量的Am80和Am80-GCSF组合有效促进在中性粒细胞减少阶段中性粒细胞的恢复。

图6示出根据本发明的各种实施方案，在中性粒细胞减少阶段中性粒细胞减少症小鼠中中等剂量的Am80诱导的中性粒细胞表现出大于G-CSF或Am80-GCSF诱导的中性粒细胞的杀菌活性。

图7示出根据本发明的各种实施方案，在中性粒细胞减少阶段中性粒细胞减少症小鼠中低剂量的Am80诱导的中性粒细胞表现出大于GCSF或Am80-GCSF诱导的中性粒细胞的杀菌活性。

图8示出根据本发明的各种实施方案，在中性粒细胞恢复阶段中性粒细胞减少症小鼠中较低剂量的Am80-GCSF组合诱导的中性粒细胞表现出大于Am80或GCSF诱导的中性粒细胞的杀菌活性。

图9示出根据本发明的实施方案，存活的小鼠模型证明，较低剂量的Am80-GCSF减小中性粒细胞减少症小鼠的感染相关的死亡率。

图10示出根据本发明的各种实施方案，Am80的分子信号传导。

图11示出根据本发明的各种实施方案，Am80和G-CSF的组合相比于单独Am80或G-CSF促进了较大的ROS产生，同时抑制了白血病生长。

图12示出根据本发明的各种实施方案，Am80和GCSF的组合在正常造血CD34⁺前体中相比于单独Am80或G-CSF促进较大的ROS产生。

图13示出根据本发明的各种实施方案，G-CSF治疗相比于用Am80或ATRA治疗促进了非APL(急性早幼粒细胞白血病)AML患者胚细胞的生长。

图14示出根据本发明的各种实施方案，Am80-GCSF显著促进了从健康人供体分离的外周血单核细胞中的ROS产生。

图15示出根据本发明的各种实施方案，Am80-GCSF促进了获自急性骨髓白血病患者的健康骨髓(BM)细胞或外周血(PB)单核细胞中显著较大的ROS产生。

发明详述

本文引用的所有参考文献都如同充分阐述一般以引用方式整体并入。除非另外定义，否则本文使用的技术术语和科学术语具有与本发明所属领域中的普通技术人员通常所理解的相同的含义。Allen等人,Remington:The Science and Practice of Pharmacy第22版,Pharmaceutical Press(2012年9月15日)；Hornyak等人,Introduction to Nanoscience and Nanotechnology,CRC Press(2008)；Singleton和Sainsbury,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology第3版,修订版,J.Wiley&Sons(New York,NY 2006)；Smith,March’s Advanced Organic Chemistry Reactions,Mechanisms and Structure第7版,J.Wiley&Sons(New York,NY 2013)；Singleton,Dictionary of DNA and Genome Technology第3版,Wiley-Blackwell(2012年11月28日)；以及Green和Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual第4t版,Cold Spring Harbor Laboratory Press(Cold Spring Harbor,NY 2012)为本领域技术人员对本申请中使用的许多术语提供总体引导。关于如何制备抗体的参考文献，参见Greenfield,Antibodies A Laboratory Manual第2版,Cold Spring Harbor Press(Cold Spring Harbor NY,2013)；和Milstein,Derivation of specific antibody-producing tissue culture and tumor lines by cell fusion,Eur.J.Immunol.1976年7月,6(7):511-9；Queen和Selick,Humanized immunoglobulins，美国专利号5,585,089(1996年12月)；和Riechmann等人,Reshaping human antibodies for therapy,Nature 1988年3月24日,332(6162):323-7。

本领域技术人员将认识到与本文所述的方法和材料类似或等同的可用于实施本发明的许多方法和材料。本发明的其他特征和优势将根据连同附图一起进行的以下详细描述而变得显而易见，所述附图举例说明本发明的实施方案的各种特征。实际上，本发明决不限于所述的方法和材料。为了方便起见，在此集中了在说明书、实施例和所附权利要求书中采用的某些术语。

除非另行指出或从上下文暗示，否则下列术语和短语包括以下所提供的含义。除非另行明确指出或从上下文显而易见，否则以下术语和短语不排除术语或短语在其所属的领域获取的含义。提供定义是为了有助于描述特定实施方案，并且不旨在限制要求保护的发明，因为本发明的范围仅受权利要求限制。除非另外定义，否则本文中所用的所有技术术语和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。

如本文所用，术语“包含(comprising)”或“包括(comprises)”关于可用于实施方案的组合物、方法和其相应组分来使用，其仍然为包括未指定的要素的开放的术语，无论要素是否有用。本领域技术人员应了解，一般而言，本文使用的术语通常旨在作为“开放”术语(例如，术语“包括”应解释为“包括但不限于”，术语“具有”应解释为“至少具有”，术语“包括”应解释为“包括但不限于”等)。

除非另行指出，否则在描述本申请的特定实施方案的上下文(特别是在权利要求的上下文中)中使用的术语“一个”和“一种”和“所述”和类似的参考可以理解为涵盖单数和复数。本文值的范围的列举仅仅旨在用作单独提及落入范围中的每个独立值的简写方法。除非本文另外指明，否则每个单独的值均并入本说明书中，如同本文单独列举每个单独的值一样。可按任何合适的顺序来执行本文所述的所有方法，除非本文另外指明或明显地与上下文矛盾。使用相对于本文的某些实施方案提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“诸如”)仅仅旨在更好地阐明本申请而不对另外要求保护的本申请造成限制。缩写“e.g.”源于拉丁语例如(exempli gratia)，并且本文用于指示非限制性实例。因此，缩写“e.g.”与术语“例如”同义。不应该将说明书中的语言理解为是指示对实施本申请必需的任何未要求保护的要素。

如本文所用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”或“改善”当关于疾病、病症或医学疾患使用时是指治疗性治疗和预防或预防性措施，其中目的在于预防、逆转、缓解、改善、抑制、减轻、减缓或停止症状或疾患的进展或严重程度。术语“治疗”包括减小或缓解疾患的至少一个不利影响或症状。如果一种或多种症状或临床标志减少，则治疗大体为“有效”。或者，如果疾病、病症或医学疾患的进展得以减轻或停滞，则治疗为“有效”。即，“治疗”不仅包括症状或标志的改善，而且还包括中止或至少减缓不存在治疗时可预期到的症状进展或恶化。另外，“治疗”可意指追求或获得有益的结果，或降低个体出现疾患的几率，即使治疗最后是不成功的。需要治疗的对象包括已经患有疾患的对象，以及易患所述疾患的对象或要预防所述疾患的对象。

“有益的结果”或“期望的结果”可以包括，但决不限于，减轻或缓解所述疾病疾患的严重程度、预防所述疾病疾患恶化、治愈所述疾病疾患、预防所述疾病疾患出现、降低患者出现所述疾病疾患的几率、降低发病率和死亡率以及延长患者寿命或预期寿命。作为非限制性实例，“有益的结果”或“期望的结果”可为一种或多种症状的缓解、缺陷程度的减弱、中性粒细胞减少症的稳定化(即，不恶化)状态、中性粒细胞减少症的延迟或减缓以及与中性粒细胞减少症相关联的症状的改善或缓和。

如本文所用，术语“施用”是指将如本文所公开的药剂，以导致药剂至少部分定位在期望位点的方法或途径放置于受试者中。

如本文所用，“疾患”和“疾病疾患”可以包括，但决不限于，任何形式的中性粒细胞减少症或中性粒细胞减少症相关的疾患、疾病或病症。如本文所用，“中性粒细胞减少症”是指特征在于血液中的中性粒细胞水平低得异常的粒细胞病症。中性粒细胞减少症可能是由于白细胞的产生降低(例如，由于，包括但不限于影响骨髓的治疗剂、影响骨髓的遗传/先天性病症、酒精中毒、脾功能亢进、狼疮、再生障碍性贫血、癌症(尤其是血癌)、放射治疗、维生素B12缺乏症、叶酸缺乏症或铜缺乏症和/或暴露于杀虫剂)。中性粒细胞减少症还可能是由于白细胞的破坏(例如，由于，包括但不限于病毒感染、急性细菌感染、某些自身免疫疾病、化疗治疗和/或治疗剂)。中性粒细胞减少症还可能是由于白细胞的排斥(marginalization)、隔离(sequestration)和/或迁移(例如，由于，包括但不限于血液透析、疟疾和/或细菌感染)。某些药物诸如氟卡尼(flecainide)、苯妥英(phenytoin)、吲哚美辛(indomethacin)、丙基硫氧嘧啶、卡比马唑(carbimazole)、氯丙嗪(chlorpromazine)、甲氧苄啶(trimethoprim)/磺胺甲噁唑(sulfamethoxazole，复方新诺明)、氯氮平(clozapine)、噻氯平(ticlodipine)和某些抗精神病药物也可能导致中性粒细胞减少症。本发明的方法和组合物可以用于治疗、抑制、减轻由任何以上原因引起的中性粒细胞减少症的严重程度和/或促进其预防。本发明的方法和组合物还可以通过治疗、抑制、减轻中性粒细胞减少症的严重程度和/或促进其预防来用于治疗、抑制、减轻由中性粒细胞减少症的任何以上原因引起的中性粒细胞相关的疾患诸如细菌、真菌、病毒、寄生虫感染以及先天免疫的放射损伤的严重程度和/或促进其预防。

如本文所用，术语“样本”或“生物样本”指示取自或分离自生物有机体的样本，例如来自受试者的肿瘤样本。示例性生物样本包括但不限于，生物流体样本；血清；血浆；尿液；唾液；肿瘤样本；肿瘤活检物和/或组织样本等。术语还包括上文所提及的样本的混合物。术语“样品”还包括未处理或预处理(或预加工)的生物样本。在一些实施方案中，样本可包含来自受试者的一种或多种细胞。在一些实施方案中，样本可以是肿瘤细胞样品，例如样本可包括癌性细胞、来自肿瘤的细胞和/或肿瘤活检物。

术语“功能的”当结合“等同物”、“类似物”、“衍生物”或“变体”或“片段”使用时是指这样的实体或分子，它们具有的生物活性与是其等同物、类似物、衍生物、变体或片段的实体或分子的生物活性大致上相似。

如本文所用，“受试者”意指人或动物。通常动物为脊椎动物，诸如灵长类动物、啮齿动物、家畜或野生动物。灵长类动物包括黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴和猕猴例如恒河猴。啮齿动物包括小鼠、大鼠、土拨鼠、白鼬、兔子和仓鼠。家畜和野生动物包括牛、马、猪、鹿、野牛、水牛、猫科例如家养猫、犬科例如狗、狐狸、狼。术语“患者”、“个体”和“受试者”在本文中可互换使用。在一个实施方案中，受试者是哺乳动物。哺乳动物可以是人、非人的灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛，但不限于这些实例。此外，本文所述的方法可用于治疗驯养的动物和/或宠物。

如本文所用，“哺乳动物”是指哺乳纲的任何成员，不加限制地包括人和非人灵长类动物，诸如黑猩猩以及其他猿和猴物种；农畜，诸如牛、绵羊、猪、山羊和马；家养哺乳动物，诸如狗和猫；实验室动物，包括啮齿动物，诸如小鼠、大鼠和豚鼠等。术语不指示特定年龄或性别。因此，成年和新生受试者以及胎儿无论雄性或雌性都旨在被包括在这个术语的范围内。

如本文所用，“中性粒细胞减少症诱导”或“中性粒细胞减少”阶段是指癌症化疗诱导的中性粒细胞减少症，并且符合如图4，左图人类第0-12天和右图小鼠第0-3天中所示的外周血(PB)绝对中性粒细胞计数(ANC)的减少。

如本文所用，“中性粒细胞减少症恢复”或“中性粒细胞恢复”或“中性粒细胞诱导”阶段是指在最低点或凹点之后PB中性粒细胞数目(ANC)的恢复。参见图4，第12-24天(左图)和第3-9天(右图)。

“受试者”可为先前诊断或识别为罹患或患有需要治疗的疾患(例如，中性粒细胞减少症或中性粒细胞减少症相关的病症)，或者与此类疾患相关的一种或多种并发症，并任选已经历过对疾患或与疾患相关的一种或多种并发症的治疗的个体。或者，受试者还可为先前未诊断为患有疾患或与疾患相关的一种或多种并发症的个体。例如，受试者可为表现出疾患或与疾患相关的一种或多种并发症的一种或多种风险因素的个体或未表现出风险因素的受试者。就特定疾患而言，“需要治疗的受试者”可为疑似患有所述疾患、诊断为患有所述疾患、已对所述疾患进行治疗或正在治疗、未对所述疾患进行治疗或具有出现所述疾患的风险的受试者。

术语“统计学显著”或“显著地”是指有差异存在的统计证明。它被定义为当无效假设实际上为真时作出否决这个无效假设的决定的可能性。通常使用p值作出决定。

除非本文另外定义，否则结合本申请使用的科学术语和技术术语将具有由本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的含义。应了解本发明不限于本文所述的特定方法、方案和试剂等，并且因此可变化。本文所用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并且不旨在限制本发明的范围，所述范围仅由权利要求限定。

粒细胞集落刺激因子(G-CSF或GCSF)诱导血流中的中性粒细胞数目的快速增加。遗憾的是，G-CSF诱导的中性粒细胞是不良分化的，连同它们的杀菌功能是受损的，这是由在分化过程早期的粒细胞生成期间中性粒细胞效应子功能发展不足所引起。

视黄酸(RA)通过视黄酸受体γ(RARγ)增强了造血干细胞(HSC)的自我更新，同时通过RARα激活促进了定向骨髓性祖细胞的分化。Am-80是一种全反式视黄酸(ATRA或RA)激动剂，其被设计成选择性地结合RARα但不结合RARγ。Am80的这种选择特性可充分地促进粒细胞分化。

我们最近发现，Am-80(他米巴罗汀)增强适度的髓细胞生成性扩增，同时诱导成熟的中性粒细胞，在对抗细菌感染中优异于G-CSF。这种效应是由于转录因子RARα的Am80诱导的选择性激活通过抑制RARα磷酸化诱导了RA靶基因的新型选择性表达，这是通过调控细胞周期和一般转录的CAK复合物所介导的。

通过使用各种中性粒细胞减少症小鼠模型所进行的全面的体内研究，我们发现，尽管在中性粒细胞减少症小鼠模型中在中性粒细胞减少阶段Am-80相比于G-CSF或Am80-G-CSF组合具有显著较高的杀菌活性，但是其表现出的在中性粒细胞恢复阶段对抗细菌感染的效率低于Am80-G-CSF组合诱导的那些。这指出：a)相比于从造血干细胞(HSC)再生中性粒细胞，Am-80可更有效地促进中性粒细胞分化；b)在小鼠中性粒细胞减少症的较早发展阶段(中性粒细胞减少阶段)Am80诱导的显著较高的中性粒细胞杀菌活性是由于Am80促进的现有PB和BM粒细胞前体向成熟中性粒细胞的分化；c)在低剂量的Am80-GCSF治疗的情况下，Am80可有效地以GCSF再生的方式将大量粒细胞前体分化成对抗微生物感染的成熟中性粒细胞；以及d)在再生成熟中性粒细胞方面，Am80-GCSF组合优异于GCSF，能够减小中性粒细胞小鼠的感染和感染相关的死亡率。响应于G-CSF施用所再生的大量中性粒细胞是不成熟的，因此导致了在中性粒细胞减少和中性粒细胞恢复阶段无效的对抗感染的杀菌活性。通过对Am80增强中性粒细胞成熟化的效应连同G-CSF促进HSC的骨髓性扩增的功能进行协同，我们证明了，在连续细菌感染的情况下，Am80和G-CSF的组合相比于单独Am80或GCSF显著降低了中性粒细胞减少症小鼠的死亡率。

我们展示了，在始终的细菌感染的存在下显著减小中性粒细胞减少症小鼠的死亡率方面，组合的Am80-GCSF治疗显著大于Am80，表明尽管Am80选择性激活RARα可得到有效的中性粒细胞分化，但是Am80介导的适度的骨髓性扩增无法满足在经历始终的细菌感染的中性粒细胞减少症疾患的情况下对于中性粒细胞的较大再生的需要。这些发现指示协同的Am80增强中性粒细胞成熟化的效应连同G-CSF促进HSC的骨髓性扩增的功能的需要，这种协同作用可克服由治疗癌症化疗诱导的中性粒细胞减少症的当前G-CSF治疗引起的无效性。

因此，基于这些发现，我们计划利用类视色素激动剂和G-CSF的组合作为治疗癌症化疗诱导的中性粒细胞减少症和超过，包括但不限于治疗先天性中性粒细胞减少症(例如，柯士文综合征(Kostmann syndrome)、周期性中性粒细胞减少症和Chediak Higashi)的有效治疗。我们还计划使用类视色素激动剂和G-CSF的组合用于离体粒细胞生成，尤其是中性粒细胞，从而实现减少中性粒细胞减少症的持续时间的转输治疗以及AML患者的HSC移植，并且作为对抗急性放射综合征的放射防护治疗。

治疗方法

在建立的人和小鼠中性粒细胞减少症模型(图4)中，GCSF或Am80均无法预防在中性粒细胞减少症的早期发展中由化疗药物诱导的中性粒细胞减少。另一方面，尽管通过GCSF而数目快速增加的中性粒细胞可在中性粒细胞恢复期期间缩短中性粒细胞减少症持续时间，但是这些增加的中性粒细胞在对抗微生物感染中是不成熟的。通过使用涵盖了中性粒细胞减少症的不同阶段的一系列中性粒细胞减少症小鼠模型，发明人解决了是单独Am80还是Am80-GCSF的组合可有效地对抗微生物感染的问题。中性粒细胞减少小鼠模型(图6、7)的结果示出，在HSC的中性粒细胞再生仍受化疗药物抑制的早期小鼠中性粒细胞减少症发展阶段，单独Am80在将现有的粒细胞前体分化成抵抗感染的成熟中性粒细胞中优异于GCSF或Am80-GCSF。但是，在之后的粒细胞逐渐复苏以实现中性粒细胞的再生的中性粒细胞恢复期中，是Am80-GCSF组合，而不是单独Am80或GCSF，Am80-GCSF组合协同地再生并分化大量的成熟中性粒细胞，以便对抗细菌感染(图8)。另外，通过使用在连续的菌血症的状态下的不同中性粒细胞减少症小鼠存活模型，我们展示了Am80-GCSF协同作用足以再生足够量的成熟中性粒细胞以减少中性粒细胞减少症小鼠的感染和感染相关的死亡率(图9)。这些发现表明，Am80的促进中性粒细胞分化比从HSC再生中性粒细胞更有效，并且通过增强中性粒细胞分化的Am80效应连同促进HSC的骨髓性扩增的GCSF功能的协同，Am80-GCSF组合满足了较大量的在中性粒细胞减少症疾患中对抗微生物的成熟中性粒细胞的需求。因此，我们的研究指示，Am80-GSCF组合可协调骨髓性扩增与中性粒细胞分化，从而通过使用Am80-GCSF组合治疗提供开发有效的癌症化疗诱导的中性粒细胞减少症(CCIN)治疗的机会。

在各种实施方案中，本发明提供了一种在受试者体内治疗疾患、预防疾患、减少出现疾患的可能性、减轻疾患的严重程度、促进疾患的预防和/或减缓疾患的进展的方法。所述方法包括以下或可由以下组成：提供类视色素激动剂；提供G-CSF或其类似物；和向受试者施用治疗有效量的类视色素激动剂和G-CSF或其类似物，从而在受试者体内治疗疾患、预防疾患、减少出现疾患的可能性、减轻疾患的严重程度、促进疾患的预防和/或减缓疾患的进展。在各种实施方案中，类视色素激动剂和G-CSF或其类似物是呈一种组合物的形式。在其他实施方案中，类视色素激动剂和G-CSF或其类似物是呈单独的组合物的形式。

根据本发明的各种实施方案，疾患为中性粒细胞减少症或微生物感染。在某些实施方案中，微生物感染为细菌感染、病毒感染、真菌感染或寄生虫感染。在某些实施方案中，中性粒细胞减少症为化疗诱导的中性粒细胞减少症、先天性中性粒细胞减少症、特发性中性粒细胞减少症、周期性中性粒细胞减少症、自身免疫中性粒细胞减少症或放射中性粒细胞减少症。

在各种实施方案中，本发明提供了一种在受试者体内治疗中性粒细胞减少症、预防中性粒细胞减少症、减少出现中性粒细胞减少症的可能性、减轻中性粒细胞减少症的严重程度、促进中性粒细胞减少症的预防和/或减缓中性粒细胞减少症的进展的方法。所述方法包括以下或可由以下组成：提供类视色素激动剂；提供G-CSF或其类似物；和向受试者施用治疗有效量的类视色素激动剂和G-CSF或其类似物，从而在受试者体内治疗疾患、预防疾患、减少出现疾患的可能性、减轻疾患的严重程度、促进疾患的预防和/或减缓疾患的进展。在各种实施方案中，类视色素激动剂和G-CSF或其类似物是呈一种组合物的形式。在其他实施方案中，类视色素激动剂和G-CSF或其类似物是呈单独的组合物的形式。在一个实施方案中，中性粒细胞减少症为癌症化疗诱导的中性粒细胞减少症(CCIN)。

在各种实施方案中，感染性疾病是由感染性细菌所引起。感染性细菌的实例包括：幽门螺旋杆菌(Helicobacterpyloris)、伯氏疏螺旋体(Borelia burgdorferi)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophilia)、分枝杆菌属(Mycobacteria sps)(诸如结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、鸟分枝杆菌(M.avium)、细胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansaii)、戈登分枝杆菌(M.gordonae))、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)、单核细胞增多性李氏菌(Listeria monocytogenes)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(A组链球菌属)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(B组链球菌属)、链球菌属(绿色组)、粪链球菌(Streptococcus faecalis)、牛链球菌(Streptococcus bovis)、链球菌属(厌氧属)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、病原性弯曲杆菌属(pathogenic Campylobacter sp.)、肠球菌属(Enterococcus sp.)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、炭疽杆菌(Bacillus anthracis)、白喉棒杆菌(corynebacterium diphtheriae)、棒杆菌属(corynebacterium sp.)、红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、多杀巴斯德氏杆菌(Pasturella multocida)、拟杆菌属(Bacteroides sp.)、核粒梭形杆菌(Fusobacterium nucleatum)、念珠状链杆菌(Streptobacillus moniliformis)、苍白密螺旋体(Treponema pallidum)、细弱密螺旋体(Treponema pertenue)、钩端螺旋体属(Leptospira)和以色列放线菌(Actinomyces israelli)。本文所述的组合物和方法设想用于治疗利用这些细菌药剂的感染。其他感染性有机体(诸如原生生物)包括：恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)和刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)。本文所述的组合物和方法设想用于治疗利用这些药剂的感染。

在各种实施方案中，感染性疾病可由病毒感染引起。感染性病毒的实例包括：逆转录病毒科(Retroviridae)(例如，HIV)；小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)(例如，脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒；肠道病毒、人柯萨奇病毒、鼻病毒、埃柯病毒)；杯状病毒科(Calciviridae)(诸如引起肠胃炎的株系)；披膜病毒科(Togaviridae)(例如，马脑炎病毒、风疹病毒)；黄病毒科(Flaviviridae)(例如，登革病毒、脑炎病毒、黄热病病毒)；冠状病毒科(Coronaviridae)(例如，冠状病毒(coronaviruse))；弹状病毒科(Rhabdoviridae)(例如，水泡性口膜炎病毒、狂犬病病毒)；线状病毒科(Filoviridae)(例如，埃博拉病毒)；副粘液病毒科(Paramyxoviridae)(例如，副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒)；正粘病毒科(Orthomyxoviridae)(例如，流感病毒)；布尼亚病毒科(Bungaviridae)(例如，汉坦病毒、布尼亚病毒、白蛉热病毒和内罗病毒)；沙粒病毒科(Arena viridae)(出血热病毒)；呼肠孤病毒科(Reoviridae)(例如，呼肠孤病毒、环状病毒和轮状病毒)；双核糖核酸病毒科(Birnaviridae)；肝脱氧核糖核酸病毒科(Hepadnaviridae)(乙型肝炎病毒)；细小病毒科(Parvoviridae)(细小病毒)；乳多空病毒科(Papovaviridae)(乳头瘤病毒、多瘤病毒)；腺病毒科(Adenoviridae)(大多数腺病毒)；疱疹病毒科(Herpesviridae)(单纯疱疹病毒(HSV)1和HSV-2、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒(CMV)、疱疹病毒)；痘病毒科(Poxviridae)(天花病毒、痘苗病毒、痘病毒)；和虹膜病毒科(Iridoviridae)(诸如，非洲猪瘟病毒)；以及未分类的病毒(例如，海绵状脑病的病原、丁型肝炎的病原(被认为是乙型肝炎病毒的有缺陷的卫星病毒)、非甲非乙型肝炎的病原(第1类＝内部传播；第2类＝胃肠外传播(即，丙型肝炎)；诺瓦克病毒和相关病毒，以及星状病毒)。本文所述的组合物和方法设想用于治疗利用这些病毒药剂的感染。

可利用本文所述的组合物和方法治疗的真菌感染的实例包括但不限于：曲霉病(aspergillosis)；鹅口疮(由白色念珠菌引起)；隐球菌病(由隐球菌引起)；和组织胞浆菌病。因此，感染性真菌的实例包括但不限于新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、白色念珠菌和曲霉菌属。本文所述的组合物和方法设想用于治疗利用这些真菌药剂的感染。

在各种实施方案中，受试者为人。在各种实施方案中，受试者为哺乳动物受试者，包括但不限于人、猴、猿、狗、猫、牛、马、山羊、猪、兔子、小鼠和大鼠。在一些实施方案中，受试者患有始终的微生物感染，包括但不限于细菌感染、病毒感染、真菌感染和寄生虫感染。

在各种实施方案中，类视色素激动剂是他米巴罗汀(Am80、视黄苯甲酸、AMNOID、他米巴罗(TAMIBARO))、CH55、ITYA(ITYA-01115)、Am580、BD4或NRX195183(也称为AGN195183)或它们的功能等同物、类似物或衍生物，或其组合。在各种实施方案中，类视色素激动剂是RARα特异性激动剂。在一个实施方案中，类视色素激动剂是Am80，或Am80的功能等同物、类似物、衍生物或盐。

在各种实施方案中，G-CSF或其组合可来自任何来源，例如，大鼠、小鼠、豚鼠、狗、猫、兔子、猪、牛、马、山羊、驴子或人。根据本发明，G-CSF或其类似物的实例包括但不限于野生型G-CSF、重组G-CSF、G-CSF单体或二聚体、重组人G-CSF(rhG-CSF)二聚体、G-CSF突变体、G-CSF融合蛋白、G-CSF片段、修饰的G-CSF多肽、PEG化G-CSF、糖基化G-CSF和在特定赖氨酸(Lys 17)处用Y形支链聚乙二醇(YPEG-G-CSF)修饰的G-CSF。这些各种G-CSF和G-CSF等同物、类似物、衍生物、变体或片段是具有大致上类似于野生型G-CSF或甚至比野生型G-CSF好的生物活性的功能分子。额外的信息可见于例如US 8557546(用于治疗神经疾病的重组人G-CSF二聚体和其用途(Recombinant human G-CSF dimer and use thereof for the treatment of neurological diseases))；US 8530417(Y形聚乙二醇修饰的G-CSF、其制备和用途(Y-shaped polyethylene glycol modified G-CSF,the preparation and use thereof))；US 8507221(用于使用GCSF作为融合配偶体表达关注的多肽的方法(Process for the expression of peptides of interest using GCSF as a fusion partner))；US 8058398(修饰的G-CSF多肽(Modified G-CSF polypeptide))；US 7655766(包含PEG化G-CSF的位置异构体的组合物(Compositions comprising positional isomers of PEGylated G-CSF))；和US 7402304(使用G-CSF类似物组合物的方法(Methods of using G-CSF analog compositions))中，这些专利都如同充分阐述一般以引用方式整体并入。

有效量的类视色素激动剂或G-CSF或其类似物的典型剂量可以在使用已知治疗化合物的制造商推荐范围内，并且还如通过细胞中的体外响应或动物模型中的体内响应向技术人员所指示。此类剂量一般可以在浓度或量上降低至多约一个数量级而不损失相关的生物活性。实际剂量可以取决于医师的判断、患者的疾患和治疗方法的有效性，所述治疗方法是基于例如相关的培养细胞或组织培养组织样本的体外响应性或在适当的动物模型中观察到的响应。在各种实施方案中，类视色素激动剂或G-CSF或其类似物可以每天一次(SID/QD)、每天两次(BID)、每天三次(TID)、每天四次(QID)或每天更多次施用，以便对受试者施用有效量的类视色素激动剂和G-CSF或其类似物，其中有效量是任何一种或多种本文所述的剂量。

在各种实施方案中，类视色素激动剂以约0.001至0.01mg/kg、0.01至0.1mg/kg、0.1至0.5mg/kg、0.5至5mg/kg、5至10mg/kg、10至20mg/kg、20至50mg/kg、50至100mg/kg、100至200mg/kg、200至300mg/kg、300至400mg/kg、400至500mg/kg、500至600mg/kg、600至700mg/kg、700至800mg/kg、800至900mg/kg或900至1000mg/kg施用。在一些实施方案中，类视色素激动剂每天1-3次或每周1-7次施用。仍在一些实施方案中，类视色素激动剂施用约1-10天、10-20天、20-30天、30-40天、40-50天、50-60天、60-70天、70-80天、80-90天、90-100天、1-6个月、6-12个月或1-5年。在一个实施方案中，类视色素激动剂是Am80，或Am80的功能等同物、类似物、衍生物或盐。在此，“mg/kg”是指mg/kg受试者体重。在某些实施方案中，将类视色素激动剂施用给人。

在各种实施方案中，类视色素激动剂的有效量是以下中的任何一个或多个：约0.01至0.05μg/kg/天、0.05-0.1μg/kg/天、0.1至0.5μg/kg/天、0.5至5μg/kg/天、5至10μg/kg/天、10至20μg/kg/天、20至50μg/kg/天、50至100μg/kg/天、100至150μg/kg/天、150至200μg/kg/天、200至250μg/kg/天、250至300μg/kg/天、300至350μg/kg/天、350至400μg/kg/天、400至500μg/kg/天、500至600μg/kg/天、600至700μg/kg/天、700至800μg/kg/天、800至900μg/kg/天、900至1000μg/kg/天、0.01至0.05mg/kg/天、0.05-0.1mg/kg/天、0.1至0.5mg/kg/天、0.5至1mg/kg/天、1至5mg/kg/天、5至10mg/kg/天、10至15mg/kg/天、15至20mg/kg/天、20至50mg/kg/天、50至100mg/kg/天、100至200mg/kg/天、200至300mg/kg/天、300至400mg/kg/天、400至500mg/kg/天、500至600mg/kg/天、600至700mg/kg/天、700至800mg/kg/天、800至900mg/kg/天、900至1000mg/kg/天或其组合。在此，“μg/kg/天”或“mg/kg/天”是指μg/kg受试者体重/天或mg/kg受试者体重/天。

在各种实施方案中，G-CSF或其类似物以约0.01至0.1mcg/kg、0.1至0.5mcg/kg、0.5至5mcg/kg、5至10mcg/kg、10至20mcg/kg、20至50mcg/kg、50至100mcg/kg、100至200mcg/kg、200至300mcg/kg、300至400mcg/kg、400至500mcg/kg、500至600mcg/kg、600至700mcg/kg、700至800mcg/kg、800至900mcg/kg或900至1000mcg/kg施用。在一些实施方案中，G-CSF或其类似物每天1-3次或每周1-7次施用。仍在一些实施方案中，G-CSF或其类似物施用约1-10天、10-20天、20-30天、30-40天、40-50天、50-60天、60-70天、70-80天、80-90天、90-100天、1-6个月、6-12个月或1-5年。在此，“mcg/kg”是指mcg/kg受试者体重。在某些实施方案中，将G-CSF或其类似物施用给人。

在各种实施方案中，方案剂量可在小鼠与人之间进行转换。表1提供了转换的示例性表。作为一个非限制性实例，针对在ATRA诱导的完全缓解(CR)之后复发的APL患者的临床治疗，患者在无间隔的情况下每天接受6至9mg/m²Am80(经口)持续最多56天。作为另外非限制性实例，中性粒细胞减少症(先天性、特发性或周期性)患者通过皮下注射接受0.5-40mcg/kg/天G-CSF，并且化疗诱导的中性粒细胞减少症患者通过皮下注射接受4-69mcg/kg/天(7-20天)G-CSF。

表1：在一些实施方案中，小鼠与人之间的方案剂量的转换

在一些实施方案中，类视色素激动剂和G-CSF或其类似物可在疾患的中性粒细胞减少阶段(即，当受试者未出现疾患，但可能出现疾患或在出现疾患的过程中)施用。在其他实施方案中，类视色素激动剂和G-CSF或其类似物可在疾患的治疗阶段(即，当受试者已经出现疾患时)施用。作为一个非限制性实例，目标疾患是中性粒细胞减少症，并且受试者是已被吩咐化疗或放疗的癌症患者。在此示例性情况下，当患者还未出现中性粒细胞减少症，或在出现中性粒细胞减少症的过程中，或已经出现中性粒细胞减少症时，可利用本文所述的方法治疗患者。

根据本发明，类视色素激动剂和G-CSF或其类似物可使用适当的使用模式来施用，例如，制造商针对类视色素激动剂和G-CSF或其类似物中的每一种所推荐的施用模式。根据本发明，可使用各种途径施用要求保护的方法的类视色素激动剂和G-CSF或其类似物，包括但不限于气雾剂、经鼻、经口、经粘膜、经皮、胃肠外、植入泵、连续输注、局部施用、胶囊和/或注射。在各种实施方案中，类视色素激动剂是通过静脉内、肌内、皮下、腹膜内、经口或经由吸入施用的。在各种实施方案中，G-CSF或其类似物是通过静脉内、肌内、皮下、腹膜内、经口或经由吸入施用的。类视色素激动剂和G-CSF或其类似物可通过相同途径或单独的途径来施用。

在各种实施方案中，类视色素激动剂和G-CSF或其类似物是同时或顺序地施用的。在各种实施方案中，类视色素激动剂是在施用G-CSF或其类似物之前、期间或之后施用的。在另外实施方案中，类视色素激动剂和/或G-CSF或其类似物是与食物或不与食物一起施用的。作为一个非限制性实例，类视色素激动剂(例如，Am80)可例如以前述剂量每天使用，并且G-CSF或其类似物可例如以前述剂量每天、每周、每周两次(biweekly)、每两周(every fortnight)和/或每月施用。作为另一个非限制性实例，类视色素激动剂可例如以前述剂量每天、每周、每周两次、每两周和/或每月施用，并且G-CSF或其类似物可例如以前述剂量每天施用。另外，类视色素激动剂和G-CSF或其类似物中的每一种可每天、每周、每周两次、每两周和/或每月施用，其中类视色素激动剂以前述剂量施用的天与G-CSF或其类似物以前述剂量施用的天不同。

在各种实施方案中，所述方法可还包括向受试者提供并且施用化疗剂。根据本发明，类视色素激动剂、G-CSF或其类似物和化疗剂是同时或顺序地施用的。还根据本发明，类视色素激动剂和/或G-CSF或类似物是在使用化疗剂之前、期间或之后施用的。在一些实施方案中，类视色素激动剂、G-CSF或其类似物和化疗剂是呈一种组合物的形式或呈单独的组合物的形式。

化疗剂的实例包括但不限于放线菌素(Actinomycin)、阿利类视色素(Alitretinoin)、全反式类视色素、阿扎胞苷(Azacitidine)、硫唑嘌呤(Azathioprine)、贝伐珠单抗(Bevacizumab)、贝沙罗汀(Bexatotene)、博莱霉素(Bleomycin)、硼替佐米(Bortezomib)、卡铂(Carboplatin)、卡培他滨(Capecitabine)、西妥昔单抗(Cetuximab)、顺铂、苯丁酸氮芥(Chlorambucil)、环磷酰胺、阿糖胞苷、柔红霉素、多西他赛(Docetaxel)、去氧氟尿苷、多柔比星(Doxorubicin)、表柔比星(Epirubicin)、埃博霉素(Epothilone)、埃罗替尼(Erlotinib)、依托泊苷(Etoposide)、氟尿嘧啶、吉非替尼(Gefitinib)、吉西他滨(Gemcitabine)、羟基脲、伊达比星(Idarubicin)、伊马替尼(Imatinib)、易普利单抗(Ipilimumab)、伊立替康(Irinotecan)、氮芥、美法仑(Melphalan)、巯嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌(Mitoxantrone)、阿仑单抗(Ocrelizumab)、奥法木单抗(Ofatumumab)、奥沙利铂(Oxaliplatin)、紫杉醇、帕尼妥单抗(Panitumab)、培美曲塞(Pemetrexed)、利妥昔单抗(Rituximab)、他氟泊苷(Tafluposide)、替尼泊苷(Teniposide)、硫鸟嘌呤(Tioguanine)、拓扑替康(Topotecan)、类视色素、戊柔比星(Valrubicin)、威罗菲尼(Vemurafenib)、长春碱(Vinblastine)、长春新碱(Vincristine)、长春地辛(Vindesine)、长春瑞滨(Vinorelbine)、伏立诺他(Vorinostat)、罗米地辛(Romidepsin)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、6-巯基嘌呤(6-MP)、克拉屈滨(Cladribine)、氯法拉滨(Clofarabine)、氟尿苷(Floxuridine)、氟达拉滨(Fludarabine)、喷司他丁(Pentostatin)、丝裂霉素、伊沙匹隆(ixabepilone)、雌莫司汀(Estramustine)、泼尼松(prednisone)、甲基泼尼松龙(methylprednisolone)、地塞米松(dexamethasone)或其组合。

在各种实施方案中，所述方法可还包括向受试者提供并且施用抗微生物剂。根据本发明，类视色素激动剂、G-CSF或其类似物和抗微生物剂是同时或顺序地施用的。还根据本发明，类视色素激动剂和/或G-CSF或类似物是在使用抗微生物剂之前、期间或之后施用的。在一些实施方案中，类视色素激动剂、G-CSF或其类似物和抗微生物剂是呈一种组合物的形式或呈单独的组合物的形式。抗微生物剂可以是抗细菌剂、抗病毒剂、抗真菌剂或抗寄生虫剂，或其组合。

药物组合物

在各种实施方案中，本发明提供了组合物，其包含类视色素激动剂和G-CSF或其类似物。在一个实施方案中，类视色素激动剂和G-CSF是呈相同组合物的形式。在另一个实施方案中，类视色素激动剂和G-CSF是呈单独的组合物的形式。根据本发明，组合物可用于在受试者体内治疗疾患、预防疾患、减少出现疾患的可能性、减轻疾患的严重程度和/或减缓疾患的进展。根据本发明，疾患可为中性粒细胞减少症或微生物感染。还根据本发明，组合物可用于刺激细胞(包括但不限于HSC、骨髓粒细胞祖细胞和造血CD34+细胞)生成粒细胞，并且尤其是中性粒细胞。

在各种实施方案中，类视色素激动剂是他米巴罗汀(AM 80、视黄苯甲酸、Amnoid、他米巴罗)、CH55、ITYA(ITYA-01115)、Am580、BD4或NRX195183(也称为AGN195183)或它们的功能等同物、类似物或衍生物，或其组合。在各种实施方案中，类视色素激动剂是RARα特异性激动剂。在一个实施方案中，类视色素激动剂是Am80，或Am80的功能等同物、类似物、衍生物或盐。

在各种实施方案中，组合物中的类视色素激动剂以mg/kg受试者体重计来提供；例如，约0.001至0.01mg/kg、0.01至0.1mg/kg、0.1至0.5mg/kg、0.5至5mg/kg、5至10mg/kg、10至20mg/kg、20至50mg/kg、50至100mg/kg、100至200mg/kg、200至300mg/kg、300至400mg/kg、400至500mg/kg、500至600mg/kg、600至700mg/kg、700至800mg/kg、800至900mg/kg或900至1000mg/kg。在一个实施方案中，类视色素激动剂是Am80，或Am80的功能等同物、类似物、衍生物或盐。在某些实施方案中，将组合物施用给人。

在各种实施方案中，组合物中的G-CSF或其类似物以mcg/kg受试者体重计来提供；例如，约0.01至0.1mcg/kg、0.1至0.5mcg/kg、0.5至5mcg/kg、5至10mcg/kg、10至20mcg/kg、20至50mcg/kg、50至100mcg/kg、100至200mcg/kg、200至300mcg/kg、300至400mcg/kg、400至500mcg/kg、500至600mcg/kg、600至700mcg/kg、700至800mcg/kg、800至900mcg/kg或900至1000mcg/kg。在某些实施方案中，将组合物施用给人。

在一个实施方案中，组合物还包含化疗剂。在另一个实施方案中，组合物还包含抗微生物剂。在各种实施方案中，组合物被配制用于静脉内、肌内、皮下、腹膜内、经口或经由吸入施用。

根据本发明，可用于在哺乳动物体内治疗疾病的类视色素激动剂和/或G-CSF或其类似物常常制备成大致上不含天然存在的免疫球蛋白或其他生物分子。优选的类视色素激动剂和/或G-CSF或其类似物当向哺乳动物施用时也表现出最小毒性。

在各种实施方案中，根据本发明的药物组合物可含有任何药学上可接受的赋形剂。“药学上可接受的赋形剂”意指可用于制备药物组合物的通常安全、无毒并且合乎需要的赋形剂，并且包括可为兽医学用途以及人医药用途所接受的赋形剂。此类赋形剂可为固体、液体、半固体，或在气雾剂组合物的情况下可为气体。赋形剂的实例包括但不限于淀粉、糖、微晶纤维素、稀释剂、成粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂、润湿剂、乳化剂、着色剂、剥离剂、涂层剂、甜味剂、调味剂、芳香剂、防腐剂、抗氧化剂、增塑剂、胶凝剂、增稠剂、硬化剂、定形剂、悬浮剂、表面活性剂、湿润剂、载体、稳定剂和其组合。

在各种实施方案中，根据本发明的药物组合物可被配制来通过任何施用途径进行递送。“施用途径”可指本领域中已知的任何施用途径，包括但不限于气雾剂、经鼻、经口、经粘膜、经皮、胃肠外、肠内、局部(topical)或局部(local)。“胃肠外”是指通常与注射相关联的施用途径，包括眶内、输注、动脉内、囊内、心内、皮内、肌内、腹膜内、肺内、脊椎内、胸骨内、鞘内、子宫内、静脉内、蛛网膜下、囊下、皮下、经粘膜或经气管。通过胃肠外途径，组合物可呈用于输注或用于注射的溶液或混悬液的形式，或呈冻干粉末的形式。通过胃肠外途径，组合物可呈用于输注或用于注射的溶液或混悬液的形式。通过经肠途径，药物组合物可呈片剂、凝胶胶囊、糖包衣片剂、糖浆、混悬液、溶液、粉末、颗粒剂、乳剂、允许控释的微球或纳米球或脂质囊泡或聚合物囊泡的形式。通常，通过注射施用组合物。这些施用的方法是本领域的技术人员已知的。

在各种实施方案中，组合物每天1-3次或每周1-7次施用。在各种实施方案中，组合物施用约1-10天、10-20天、20-30天、30-40天、40-50天、50-60天、60-70天、70-80天、80-90天、90-100天、1-6个月、6-12个月或1-5年。根据本发明，组合物被配制用于静脉内、肌内、皮下、腹膜内、经口或经由吸入施用。在各种实施方案中，组合物可以每天一次(SID/QD)、每天两次(BID)、每天三次(TID)、每天四次(QID)或每天更多次施用，以便对受试者施用有效量的类视色素激动剂和G-CSF或其类似物，其中有效量是任何一种或多种本文所述的剂量。

在各种实施方案中，根据本发明的药物组合物可含有任何药学上可接受的载体。如本文所用，“药学上可接受的载体”是指涉及从身体的一个组织、器官或部分将关注的化合物携带或运送到身体的另一个组织、器官或部分的药学上可接受的物质、组合物或媒介物。例如，载体可为液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封物质或其组合。载体的各个组分必须是“药学上可接受的”，因为它必须与制剂的其他成分相容。它还必须适用于与它可能接触的任何组织或器官接触，这意味着它必须不携带毒性、刺激、过敏反应、免疫原性或过度超过其治疗益处的任何其他并发症的风险。

根据本发明的药物组合物也可被包封、制片或以乳剂或糖浆形式制备以供经口施用。可添加药学上可接受的固体或液体载体以增强或稳定组合物，或有助于制备组合物。液体载体包括糖浆、花生油、橄榄油、甘油、盐水、醇和水。固体载体包括淀粉、乳糖、硫酸钙、二水合物、白土、硬脂酸镁或硬脂酸、滑石粉、果胶、阿拉伯胶、琼脂或明胶。载体还可以包括持续释放物质，诸如单独或与蜡组合的单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。

药物制备物是遵循常规制药技术制备的，所述技术涉及研磨、混合、粒化和必要时压制(针对片剂形式)；或研磨、混合和填充(针对硬质明胶胶囊形式)。当使用液体载体时，制备物将呈糖浆、酏剂、乳剂或水性或非水性混悬液的形式。此类液体制剂可直接经口(p.o.)施用或填充到软质明胶胶囊中。

根据本发明的药物组合物可以以治疗有效量递送。精确的治疗有效量是就在给定受试者中的治疗疗效而言，组合物将产生最有效的结果的那个量。这个量将取决于多种因素而变化，所述因素包括但不限于治疗化合物的特征(包括活性、药物动力学、药效动力学和生物利用率)、受试者的生理条件(包括年龄、性别、疾病类型和阶段、一般身体条件、对给定剂量的反应性和药物类型)、制剂中的一种或多种药学上可接受的载体的性质以及施用途径。临床和药理学领域的技术人员将能够通过常规实验，例如通过监测受试者对施用化合物的反应以及对应地调节剂量来确定治疗有效量。对于其他指导，参见Remington:The Science and Practice of Pharmacy(Gennaro编，第20版,Williams&Wilkins PA,USA)(2000)。

在向受试者施用之前，可将制剂组分(formulant)添加到组合物。液体制剂是优选的。例如，这些制剂组分可包括油、聚合物、维生素、碳水化合物、氨基酸、盐、缓冲液、白蛋白、表面活性剂、增量剂或其组合。

碳水化合物制剂组分包括糖或糖醇诸如单糖、二糖或多糖，或水溶性葡聚糖。糖类或葡聚糖可包括果糖、右旋糖、乳糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麦芽糖、蔗糖、葡聚糖、支链淀粉、糊精、α-环糊精和β-环糊精、可溶性淀粉、羟乙基淀粉和羧甲基纤维素，或其混合物。“糖醇”定义为具有-OH基团的C4-C8烃，并且包括半乳糖醇、肌醇、甘露糖醇、木糖醇、山梨醇、甘油、和阿拉伯糖醇。上文提及的这些糖或糖醇可单独使用或以组合的形式使用。用量没有固定的限制，只要糖或糖醇在液体制备物中可溶。在一个实施方案中，糖或糖醇浓度在1.0重量/体积％与7.0重量/体积％之间，更优选在2.0重量/体积％与6.0重量/体积％之间。

氨基酸制剂组分包括肉毒碱、精氨酸和甜菜碱的左旋(L)形式；然而，可添加其他氨基酸。

在一些实施方案中，作为制剂组分的聚合物包括平均分子量在2,000与3,000之间的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或平均分子量在3,000与5,000之间的聚乙二醇(PEG)。

还优选在组合物中使用缓冲液以将冻干前或重组后溶液的pH变化最小化。可使用大多数任何生理缓冲液，包括但不限于柠檬酸盐、磷酸盐、琥珀酸盐和谷氨酸盐缓冲液或其混合物。在一些实施方案中，浓度为0.01至0.3摩尔。可添加到制剂的表面活性剂示于欧洲专利号270,799和268,110中。

用于增加循环半衰期的另一种药物递送体系是脂质体。制备脂质体递送体系的方法在Gabizon等人，Cancer Research(1982)42:4734；Cafiso,Biochem Biophys Acta(1981)649:129；和Szoka,Ann Rev Biophys Eng(1980)9:467中有所讨论。其他药物递送体系在本领域中是已知的并且在例如Poznansky等人,Drug Delivery Systems(R.L.Juliano编,Oxford,N.Y.1980)，第253-315页；M.L.Poznansky,Pharm Revs(1984)36:277中有所描述。

在液体药物组合物制备后，可冻干以防止降解并保持无菌。用于冻干液体组合物的方法是本领域普通技术人员已知的。组合物仅在使用前可用可包括额外的成分的无菌稀释剂重建(例如，林格溶液、蒸馏水或无菌盐水)。重建后，使用本领域技术人员已知的那些方法将组合物施用给受试者。

本发明的组合物可以通过常规熟知的灭菌技术来灭菌。所得到的溶液可以包装使用或在无菌条件下过滤并且冻干，冻干的制备物在施用之前与无菌溶液组合。当需要接近生理条件时，组合物可以含有药学上可接受的辅助物质，诸如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂等，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙和稳定剂(例如，1-20％麦芽糖等)。

细胞治疗

在各种实施方案中，本发明提供一种生成粒细胞，并且具体地说中性粒细胞的方法。所述方法包括：提供细胞(包括但不限于HSC、骨髓粒细胞祖细胞和造血CD34⁺细胞)；以及用类视色素激动剂和G-CSF或其类似物刺激细胞，从而生成粒细胞，并且具体地说中性粒细胞。根据本发明，所述方法可还包括培养刺激的细胞和/或生成的粒细胞，并且具体地说中性粒细胞。根据本发明的各种实施方案，所述方法还包括分离刺激的细胞和/或生成的粒细胞，并且具体地说中性粒细胞。根据本发明的各种实施方案，所述方法还包括向需要治疗疾患的受试者施用刺激的细胞和/或生成的粒细胞，并且具体地说中性粒细胞。在各种实施方案中，本发明提供一种生成粒细胞，并且具体地说中性粒细胞的试剂盒。试剂盒包括：一定量的类视色素激动剂；一定量的G-CSF或其类似物；和使用类视色素激动剂和G-CSF或其类似物以刺激细胞(包括但不限于HSC、骨髓粒细胞祖细胞和造血CD34⁺细胞)从而生成粒细胞，并且具体地说中性粒细胞的说明书。

在各种实施方案中，本发明提供一种组合物，其根据所述方法和/或使用所述试剂盒包含生成的粒细胞，或具体地说中性粒细胞。在各种实施方案中，本发明提供一种组合物，其根据所述方法和/或使用所述试剂盒包含刺激的细胞。根据本发明的各种实施方案，这些组合物还包含类视色素激动剂和G-CSF或其类似物。根据本发明的各种实施方案，这些组合物还包含药学上可接受的赋形剂和/或载体。根据本发明，这些组合物可配制用于通过各种途径向受试者施用，这些途径包括但不限于转输和移植。在另外实施方案中，本发明提供了一种通过向受试者施用这些所述组合物中的至少一种来在受试者体内治疗疾患、预防疾患、减轻疾患的严重程度和/或减缓疾患的进展的方法。作为一个非限制性实例，受试者可以是患有中性粒细胞减少症的患者，并且可将包含生成的粒细胞，并且具体地说中性粒细胞的组合物转输到患者中。作为另一个非限制性实例，受试者可以是AML患者，并且可将包含刺激的HSC和/或骨髓细胞的组合物移植到患者中。

在各种实施方案中，本发明提供了一种在受试者体内治疗疾患、预防疾患、减少患有疾患的可能性、减轻疾患的严重程度和/或减缓疾患的进展的方法。所述方法包括：提供细胞(包括但不限于HSC、骨髓粒细胞祖细胞和造血CD34⁺细胞)；用类视色素激动剂和G-CSF或其类似物刺激细胞，从而生成粒细胞，或具体地说中性粒细胞；以及向受试者施用生成的粒细胞，或具体地说中性粒细胞，从而在受试者体内治疗疾患。在各种实施方案中，疾患是中性粒细胞减少症或AML。在各种实施方案中，通过转输或移植向受试者施用生成的粒细胞，或具体地说中性粒细胞。

在各种实施方案中，本发明提供了一种在受试者体内治疗疾患、预防疾患、减少患有疾患的可能性、减轻疾患的严重程度和/或减缓疾患的进展的方法。所述方法包括：提供细胞(包括但不限于HSC、骨髓细胞、CD34⁺细胞和干细胞)；用类视色素激动剂和G-CSF或其类似物刺激细胞；以及向受试者施用刺激的磁暴，从而在受试者体内治疗疾患。在各种实施方案中，疾患是中性粒细胞减少症或AML。在各种实施方案中，通过转输或移植向受试者施用刺激的细胞。

本发明的试剂盒

在各种实施方案中，本发明提供了一种用于在受试者体内治疗疾患、预防疾患、减轻疾患的严重程度和/或减缓疾患的进展的试剂盒。试剂盒包括：一定量的类视色素激动剂；一定量的G-CSF或其类似物；和用于使用类视色素激动剂和G-CSF或其类似物来在受试者体内治疗疾患、预防疾患、减轻疾患的严重程度和/或减缓疾患的进展的说明书。

在各种实施方案中，类视色素激动剂是他米巴罗汀(Am80、视黄苯甲酸、Amnoid、他米巴罗)、CH55、ITYA(ITYA-01115)、Am580、BD4或NRX195183(也称为AGN195183)或它们的功能等同物、类似物或衍生物，或其组合。在各种实施方案中，类视色素激动剂是RARα特异性激动剂。在一个实施方案中，类视色素激动剂是Am80，或Am80的功能等同物、类似物、衍生物或盐。

在各种实施方案中，G-CSF或其组合可来自任何来源，例如，大鼠、小鼠、豚鼠、狗、猫、兔子、猪、牛、马、山羊、驴子或人。根据本发明，G-CSF或其类似物的实例包括但不限于野生型G-CSF、重组G-CSF、G-CSF单体或二聚体、重组人G-CSF(rhG-CSF)二聚体、G-CSF突变体、G-CSF融合蛋白、G-CSF片段、修饰的G-CSF多肽、PEG化G-CSF、糖基化G-CSF和在特定赖氨酸(Lys 17)处用Y形支链聚乙二醇(YPEG-G-CSF)修饰的G-CSF。这些各种G-CSF和G-CSF等同物、类似物、衍生物、变体或片段是具有大致上类似于野生型G-CSF或甚至比野生型G-CSF好的生物活性的功能分子。额外的信息可见于例如US 8557546(用于治疗神经疾病的重组人G-CSF二聚体和其用途(Recombinant human G-CSF dimer and use thereof for the treatment of neurological diseases))；US 8530417(Y形聚乙二醇修饰的G-CSF、其制备和用途(Y-shaped polyethylene glycol modified G-CSF,the preparation and use thereof))；US 8507221(用于使用GCSF作为融合配偶体表达关注的多肽的方法(Process for the expression of peptides of interest using GCSF as a fusion partner))；US 8058398(修饰的G-CSF多肽(Modified G-CSF polypeptide))；US 7655766(包含PEG化G-CSF的位置异构体的组合物(Compositions comprising positional isomers of PEGylated G-CSF))；和US 7402304(使用G-CSF类似物组合物的方法(Methods of using G-CSF analog compositions))中，这些专利都如同充分阐述一般以引用方式整体并入。

试剂盒是包括本发明组合物中的至少一种的材料或组分的集合。因此，在一些实施方案中，试剂盒含有包括如上文所述的与治疗剂复合的药物递送分子的组合物。

本发明试剂盒中配置的组分的准确性质取决于试剂盒的预定目的。在一个实施方案中，试剂盒被特定配置来实现治疗哺乳动物受试者的目的。在另一个实施方案中，试剂盒被特定配置来实现治疗人受试者的目的。在其它实施方案中，试剂盒被配置用于治疗诸如但不限于、农畜、家畜和实验室动物的受试者的兽医学应用。

使用说明书可包括在试剂盒中。“使用说明书”通常包括描述在使用试剂盒的组分来实现所需结果时采用的技术的明确表述。任选地，试剂盒也含有其他可用组分，诸如稀释剂、缓冲剂、药学上可接受的载体、注射器、导管、施用器、吸移或测量工具、绑扎材料或如将易于由本领域技术人员认识到的其他可用附件。

可向从业者提供在试剂盒中组装的以保持材料或组分的可操作性和效用的任何便利和适合方式储存的材料或组分。例如，组分可呈溶解、脱水或冻干的形式；它们可提供在室温、冷藏温度或冷冻温度下。组分通常包含于合适的包装材料中。如本文所用，短语“包装材料”是指一种或多种用于容纳试剂盒的内容物(诸如本发明组合物等)的物理结构。包装材料是通过熟知方法构造的，优选提供无菌、无污染物的环境。如本文所用，术语“包装”是指诸如玻璃、塑料、纸、箔等能够容纳个别试剂盒组分的合适的固体基质或材料。因此，例如，包装可为用于含有适量的如本文所述的组合物的的玻璃小瓶。包装材料一般具有指示试剂盒和/或其组分的内容物和/或目的的外部标签。

在一些实施方案中，需要本文所述的方法、组合物和试剂盒的受试者是由(包括但不限于)影响骨髓的药物(诸如癌症药物、抗精神病药物、抗惊厥药物)、影响骨髓的遗传和/或先天性病症、患者进行放射治疗、维生素B12缺乏、叶酸缺乏或其组合所引起的白细胞产生减少的受试者。

在另外实施方案中，需要本文所述的方法、组合物和试剂盒的受试者是由于(包括但不限于)急性细菌感染、自身免疫病症(诸如系统性红斑狼疮)、使用磺胺药物或其组合所引起的白细胞损伤、破坏和/或其量减少的受试者。

在另外实施方案中，需要本文所述的方法、组合物和试剂盒的受试者是由于(包括但不限于)血液透析、疟疾、细菌感染或其组合而经历白细胞(诸如中性粒细胞)的隔离和/或迁移的受试者。

在各种实施方案中，本文所述的方法、组合物和试剂盒可结合其他治疗包括但不限于化疗和/或放射治疗来使用。化疗和/或放射治疗常常减少白细胞的数量，导致中性粒细胞减少症。与化疗和/或放射治疗一起同时或顺序地应用本发明的方法、组合物和试剂盒可以预防中性粒细胞减少症、抑制中性粒细胞减少症和/或减轻中性粒细胞减少症的严重程度。类似地，与抗惊厥药物和/或抗精神病药物一起同时或顺序地应用本发明的方法、组合物和试剂盒可以预防由所述药物的使用引起的中性粒细胞减少症、抑制这种中性粒细胞减少症和/或减轻这种中性粒细胞减少症的严重程度。此外，与用于治疗微生物感染(例如，细菌感染、真菌感染、病毒感染和寄生虫感染)和/或自身免疫疾病或放射诱导的中性粒细胞减少症的治疗剂一起同时或顺序地应用本发明的方法、组合物和试剂盒，可以预防中性粒细胞减少症、抑制中性粒细胞减少症和/或减轻中性粒细胞减少症的严重程度，所述中性粒细胞减少症可由于微生物感染和/或自身免疫疾病和/或由于可用于治疗微生物感染和/或自身免疫疾病的治疗剂而发生。

用于估计治疗功效的方法

如本文所述，与GCSF组合使用低于推荐剂量的Am80，中性粒细胞减少症小鼠的感染相关的死亡率相比于单独Am80或GCSF显著减小。此外，在正常和恶性造血前体中与GCSF组合的Am80治疗增加了反应性氧物质(ROS)产生，反应性氧物质产生是对抗微生物感染的基本中性粒细胞功能。基于针对细菌感染和真菌感染的中性粒细胞杀微生物功能，ROS产生生物测定可用于估计本文所述的组合治疗方法的功效。当前的中性粒细胞减少症治疗的临床终点包括中性粒细胞计数和发热性中性粒细胞减少症的发生率，这两种均不提供中性粒细胞的对抗微生物的能力的信息。ROS产生生物测定允许基于响应于细菌刺激或真菌刺激的中性粒细胞ROS产生的参考值监测中性粒细胞杀微生物活性。中性粒细胞ROS产生的此类确立的基线值传递了迅速的功能临床终点，对于辨别作为GCSF的附加治疗的Am80的最佳给药和安排表。

因此，本文提供用于确定有需要的受试者体内的治疗功效的方法。所述方法包括：提供来自受试者的样本，其中受试者已施用了有效量的类视色素激动剂和有效量的G-CSF；测定反应性氧物质(ROS)的产生水平；以及如果ROS产生高于参考样本的ROS产生，那么确定治疗是有效的，或如果ROS产生与参考样本相同或相对于参考样本较低，那么确定治疗是无效的。在一些实施方案中，如果治疗被认为是无效的，那么可增加Am80或GCSF或两者的剂量。

在一些实施方案中，待评估功效的受试者正经历化疗治疗或已经历了化疗治疗(利用或不利用GCSF。在一些实施方案中，待评估功效的受试者正经历中性粒细胞减少症的治疗或已经历了中性粒细胞减少症的治疗。

在一个实施方案中，样本是血液、外周血、骨髓细胞、血浆、组织或其组合。在各种实施方案中，样本是在中性粒细胞减少症的治疗之前、期间或之后获得的。在示例性实施方案中，ROS产生可如以下中所述进行测定：Babior,Blood 1999,第93卷,第1464页；Dahlgren等人,J Immunol Methods,1999,第232卷,第3页；Weiss,Acta Physiol Scand Suppl,1986,第548卷,第9页；Charles等人,Infect Immun,2008,第76卷,第2439页；Wei等人,J Biomed Opt,2010,第15卷,第027006页。在一些实施方案中，ROS使用模拟细菌感染和真菌感染的刺激物来测量，例如fMLP、PMA、ZAS或其组合。

在本文所述方法的各种实施方案中，参考值是基于反应性氧物质(ROS)的产生的量或水平。在一个实施方案中，参考值是基于健康供体的骨髓细胞中的ROS产生。在另一个实施方案中，参考值是基于健康供体的外周血单核细胞中的ROS产生。在一个额外的实施方案中，参考值是基于患有或过去患有急性骨髓性白血病的受试者的健康骨髓细胞中的ROS产生。在一个另外的实施方案中，参考值是基于患有或过去患有急性骨髓性白血病的受试者的健康外周血细胞中的ROS产生。(其他细胞类型如何？有没有任何更广泛的实施方案？)可用于测定参考值的其他细胞类型对于本领域技术人员而言将是显而易见的。在额外的实施方案中，参考值是根据不同的(例如，较早的)时间点从受试者获得的样本中ROS产生的量/水平，时间点诸如在诊断中性粒细胞减少症期间，在治疗中性粒细胞减少症之前、在治疗中性粒细胞减少症之后或其组合。

在各种实施方案中，相比于参考值，受试者(例如，正在治疗中性粒细胞减少症的受试者)中ROS产生的量/水平增加了至少或约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在各种实施方案中，相比于参考值，受试者(例如，正在治疗中性粒细胞减少症的受试者)中ROS产生的量/水平增加了至少或约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65倍、70倍、75倍、80倍、85倍、90倍、95倍、100倍或其组合。

实施例

仅出于说明目的提供以下实施例，并且不旨在以任何方式限制本发明的范围。

实施例1：Am80的选择性活性所诱导的髓细胞生成性扩增对比于髓细胞生成性分化

Am80-GCSF对于成熟中性粒细胞的再生以减少暴露于细菌的中性粒细胞减少症小鼠的死亡率的协同效应的机制是什么？细胞特异性转录模式可通过调节转录因子来改变，转录因子是细胞命运的主要调节子。全反式视黄酸(ATRA或RA)具有与两类转录因子视黄酸受体(RARα、-β、-γ)和类视色素X受体(RXRα、-β、-γ)结合和其反式激活的高亲和力。先前的研究示出，RA通过RARγ激活增强了HSC自我更新，同时通过RARα激活促进了定向骨髓性祖细胞的分化。RA的此类全作用(pan-action)发挥出对通过在各种正常和肿瘤组织中激活RARα、-β、-γ亚型来抑制增殖同时促进分化的有力的效应。相反，Am80是一种类视色素激动剂，其被设计来选择性地结合RARα而不是RARγ，因此在治疗APL患者中避免了由RA激活的RARγ所诱导的副作用。我们证明了，Am80促进了适度的骨髓性扩增，同时显著地增强了抵抗细菌感染的中性粒细胞的分化，其与大大增强骨髓性扩增然而无法诱导有效的中性粒细胞分化的G-CSF相反。对于在持续的细菌感染的存在下显著减小中性粒细胞减少症小鼠的死亡率来说，组合的Am80-GCSF治疗显著大于Am80，此发现表明，尽管Am80选择性激活RARα可得到有效的中性粒细胞分化，但是Am80介导的适度的骨髓性扩增无法满足在持续的细菌感染与中性粒细胞减少症同时发生的情况下对于足够数目的成熟中性粒细胞的需要。这些发现指示使用组合的Am80-GSCF来充分平衡骨髓性扩增和中性粒细胞分化两者，从而克服由治疗癌症化疗诱导的中性粒细胞减少症的当前G-CSF治疗引起的无效性的需要。

实施例2：调节Am80-G-CSF的协同效应的信号传导途径

RARα是细胞周期蛋白依赖性激酶-激活激酶(CAK)复合物的底物，这种复合物由CDK7、细胞周期蛋白H和MAT1蛋白组成。CAK存在于细胞中，作为通过磷酸化激活不同CDK来调控细胞周期进展的游离CAK，或作为TFIIH复合物的激酶亚基，在TFIIH复合物中CAK通过磷酸化RNA聚合酶II C末端结构域(RNA PII)来介导转录。值得注意的是，游离CAK或含有TFIIH的CAK磷酸化RARα以抑制粒细胞分化(图1)，而通过固有程序化的或RA介导的MAT1蛋白片段化所介导的RARα的CAK磷酸化的降低通过RA靶基因的RARα-依赖性转录诱导了粒细胞分化(图2)。我们最近发现，Am80效应是由其通过抑制RARα的CAK磷酸化来选择性激活RARα转录因子以诱导RA靶基因的选择性表达引起的。Am80诱导的髓细胞生成性扩增是RA靶基因的改变的转录表达模式的基础，如通过细胞周期抑制剂p21^Cip/Kip的水平降低，但是中性粒细胞效应子CD18、次级颗粒LL-37和骨髓特异性转录因子CCAAT/增强子结合蛋白ε(C/EBPε)的表达增加所示。RA靶基因的这种Am80诱导的选择性表达不同于RA刺激，并且与正常或恶性造血前体中的中性粒细胞杀菌功能的有效出现、显著的MAT1片段化、RARα磷酸化降低和反应性氧物质(ROS)的产生显著较高相关联，如相比于G-CSF或RA。这些数据表明，通过控制粒细胞生成的转录响应的类视色素介导的CAK-RARα信号传导途径，Am80与RARα的选择性结合诱导了协调适度的髓细胞生成性扩增和有效的中性粒细胞分化的新型转录响应(图3)。基于这些研究连同我们发现Am80-GCSF组合显著减小中性粒细胞减少症小鼠的死亡率，同时不希望受特定理论的束缚，我们认为，Am80-GCSF组合的协同效应可依赖于介导CAK-RARα作用模式，其交叉调控髓细胞生成前体的最佳扩增和中性粒细胞的有效终末分化两者，从而导致感染和感染诱导的死亡率减小。我们的研究提供克服了使用Am80或GCSF的单一方案治疗癌症化疗诱导的中性粒细胞减少症患者的缺陷的有效治疗。

实施例3：由癌症化疗药物诱导的中性粒细胞减少症和中性粒细胞恢复

如Ding等人(Blood，2013年第121卷第996页)、Trillet-Lenoir等人(Eur J Cancer，1993年第29A(3)卷第319页)、Lalami等人(Ann Oncol，2006年第17(3)卷第507页)和Abdul Rasool Hassan等人(Asian Pac J Cancer Prev，2011年第12(6)卷第1425页)所示，癌症化疗可用于诱导中性粒细胞减少症。由癌症化疗诱导的严重中性粒细胞减少症的中值持续时间在人中为3-6天(ANC<0.5x10⁹/L)并且在小鼠中为2-3天，而GCSF可通过增加中性粒细胞数目来缩短人和小鼠两者中的中性粒细胞减少症持续时间(图4)。我们的研究将2/3的小鼠中性粒细胞减少症期间划分为中性粒细胞减少(没有方案可在人或小鼠中预防中性粒细胞的减少)和中性粒细胞恢复(BM功能仍受抑制)阶段(图4，右图)，在此期间微生物感染的风险显著增加。中性粒细胞减少症的整个周期涵盖了中性粒细胞减少症诱导阶段、中性粒细胞减少症减少阶段、中性粒细胞减少症恢复阶段和中性粒细胞恢复到正常阶段(图4，右图)。测试了在忍受连续的菌血症疾患的小鼠中性粒细胞减少症的整个周期中Am80-GCSF组合对减小中性粒细胞减少症小鼠的死亡率的效应。

实施例4：人等效低剂量和中等剂量的Am80和Am80-GCSF组合在中性粒细胞减少阶段有效促进中性粒细胞的恢复

为了评估体内Am80效应，我们首先测试了不同的人等效高剂量、中等剂量和低剂量的Am80和GCSF(图5a)在中性粒细胞减少症小鼠体内对再生成熟中性粒细胞的半最大有效浓度(EC₅₀)。用单一剂量的环磷酰胺(CPA)注射正常的C57BL6/J小鼠以减少小鼠中性粒细胞。在CPA注射后4小时，用媒介物、Am80、GCSF或Am80-GCSF治疗小鼠连续3天，之后将小鼠处死(图5b)。空白小鼠的外周血(PB)的菲柯尔(Ficoll)分离示出，成熟中性粒细胞被分选到下层(图5c)。相比于所有其他治疗，低剂量和中等剂量的Am80或Am80-GCSF示出较好的维持中性粒细胞水平的EC₅₀效应(图5d，右图)，同时低剂量的Am80和Am80-GCSF对粒细胞形态分化的增强比中等剂量的Am80和Am80-GCSF对粒细胞形态分化的增强好(图5e)。此外，骨髓(BM)细胞的多密度珀可(Percoll)分离指示，空白小鼠的成熟BM中性粒细胞被分选到第3层(图5f)。值得注意的是，尽管中等剂量的GCSF诱导第3层BM细胞的最高恢复(图5g，右图)，但是这些细胞的分化低于低剂量的Am80-GCSF诱导的细胞，如通过粒细胞形态分析所示(图5h，上图对比下图)。总之，这些结果表明，低剂量和中等剂量的Am80和Am80-GCSF可在小鼠中性粒细胞减少症的早期阶段维持适度水平的PB和BM中性粒细胞两者。*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.005。数据代表具有类似结果的2个独立实验。

实施例5：在中性粒细胞减少阶段的中性粒细胞减少症小鼠中中等剂量的Am80诱导的中性粒细胞表现出大于G-CSF或Am80-GCSF诱导的那些中性粒细胞的杀菌活性

图6A实验设计。将C57BL/6J小鼠(n＝19)随机分成5组(对照组3只并且每个实验组4只)。在第0天通过IP注射CPA来诱导小鼠中性粒细胞减少症。在CPA注射4小时之后，向小鼠每天一次给予不同的方案，其中Am80通过口服，或GCSF通过SC，或媒介物通过口服。在第2天经由尾静脉注射用6.3x10⁶CFU的金黄色葡萄球菌(S.aureus)攻击小鼠。在注射3小时之后，从尾巴采集各100μl血液，用于分析中性粒细胞的初始杀菌活性。在注射后16小时处死小鼠，由此获得PB和心脏。(图6B)PB中WBC和中性粒细胞的Vetscan分析。除了空白小鼠之外，在所有其他组中未观察到中性粒细胞诱导(图6C-E)。通过使用活的细胞外细菌的血液琼脂分析来测定在PB中注射后3小时(图6C)和16小时(图6D)以及在心脏中(图E)中性粒细胞的杀菌活性。因为中性粒细胞诱导未通过在GCSF或Am80或Am80-GCSF小鼠中的细菌感染来促成，所以其指示Am80小鼠中显著增加的中性粒细胞杀菌活性是由于在小鼠中性粒细胞减少症的早期发展阶段Am80促进的现有粒细胞前体向成熟中性粒细胞的分化所导致的。*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.005。A+G：Am80-GCSF。

实施例6：在中性粒细胞减少阶段在添加Am80-GCSF组的情况下较低剂量的使用

将小鼠(C57BL6/J)随机分成5组(对照组3只并且每个实验组4只，n＝19只小鼠)。将C57BL/6J小鼠(n＝19)随机分成5组(对照组3只并且每个实验组4只)。诱导小鼠中性粒细胞减少症和治疗的程序与中值剂量测试相同(参见幻灯片6)。在第2天经由尾静脉注射用6.3x10⁶CFU的金黄色葡萄球菌攻击小鼠。在注射3小时之后，从尾巴采集各100μl血液，用于测定中性粒细胞的初始杀菌活性。在第3天处死小鼠，由此获得PB和脾。(图7A)。执行PB中WBC和中性粒细胞的Vetscan分析(图7B)。除了空白小鼠之外，在所有其他组中未观察到中性粒细胞诱导(图7C-E)。使用活的细胞外细菌的血液琼脂分析测定在PB中注射后3小时(图C)和16小时(图D)以及在脾中(图E)中性粒细胞的杀菌活性。因为中性粒细胞诱导未通过在GCSF或Am80或Am80-GCSF小鼠中的细菌感染来促成，所以其指示Am80小鼠中显著增加的中性粒细胞杀菌活性是由于在小鼠中性粒细胞减少症的早期发展阶段Am80促进的现有粒细胞前体向成熟中性粒细胞的分化所导致的。*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.005。在中性粒细胞减少症小鼠中在预防阶段由较低剂量的Am80诱导的中性粒细胞表现出大于G-CSF或Am80+GCSF诱导的那些中性粒细胞的杀菌活性。

实施例7：在中性粒细胞恢复阶段在添加Am80-GCSF组的情况下较低剂量的使用

将小鼠(C57BL6/J)随机分成5组(对照组3只并且每个实验组4只，n＝19只小鼠)。如所示(图8a)，在CPA注射后2天，向小鼠给予方案(200mg/kg)。在连续的3天治疗之后，用金黄色葡萄球菌攻击小鼠至多16小时，之后进行安乐死。我们发现，在细菌感染之后所有组中外周血(PB)中性粒细胞显著增加(图8b)。将注射后3小时和16小时所采集的PB用于分析中性粒细胞杀菌活性。独立杀死(Independent killing)测定示出，Am80-GCSF组合而不是单独Am80诱导的中性粒细胞杀死显著更多的细菌(图8c)。通过估计中性粒细胞产生，我们发现相比于GCSF或Am80-GCSF，Am80在BM和PB中诱导最少数目的中性粒细胞(图8d、8e)。尽管相比于Am80-GCSF，GCSF在BM中诱导的中性粒细胞显著更多而在PB中诱导的中性粒细胞量类似(图8d、8e；下图)，但是GCSF诱导的中性粒细胞相比于Am80-GCSF诱导的那些中性粒细胞表现出显著低的杀菌活性(图8c)。此外，Am80-GCSF组合诱导的中性粒细胞表现出较好的粒细胞形态分化(图8d、8e；左图)。这些结果指示，在当BM功能仍受抑制时的中性粒细胞恢复期间，仅较少数目的粒细胞前体可用于通过Am80分化成成熟中性粒细胞，而大量由GCSF诱导的中性粒细胞在细菌杀死中是有缺陷的。然而，在低剂量的Am80-GCSF治疗的情况下，Am80可有效地将GCSF再生的粒细胞前体分化成对抗微生物感染的成熟中性粒细胞。P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.005。

实施例8：使用较低剂量的Am80-GCSF组合显著减小忍受连续菌血症的中性粒细胞减少症小鼠的感染相关的死亡率

如果Am80可确实将GCSF再生的大量的粒细胞前体分化成对抗感染的成熟中性粒细胞，那么Am80-GCSF组合应在癌症化疗诱导的中性粒细胞减少症中有效地减小感染相关的死亡率。我们通过使用中性粒细胞减少症小鼠测试了这种假设，这些小鼠在整个中性粒细胞减少症期间经历菌血症。如所示(图9A)，在CPA注射后4小时向小鼠给予不同方案持续至多第8天。在第3天执行金黄色葡萄球菌感染，并且在第9天计算存活率。利用3个独立的实验，我们确定，Am80-GCSF比单独GCSF或Am80使存活率增加显著更高(图9B-D)。为了评估存活的小鼠中再生的中性粒细胞的杀菌能力，在第11天用金黄色葡萄球菌对存活的空白小鼠和Am80-GCSF小鼠进行进一步感染持续15分钟，之后进行安乐死。利用吉姆萨染色和革兰氏染色进行的新鲜分离的PB的平行分析测定了感染小鼠中对比于不含菌血症的未感染小鼠中的中性粒细胞吞噬作用(图9E)。因为GCSF通常在化疗药物后≥24小时提供到CCIN，所以我们进一步测试了CPA后24小时低剂量和中等剂量的Am80-GCSF治疗，如所示(图9F、9J)，其中每个剂量进行两次独立实验。低剂量测试的结果示出，GCSF组仅具有12.5％存活率，同时在空白组或Am80-GCSF组中未观察到死亡(图9g-i)。然而，在中等剂量测试中，Am80-GCF(55.6％)组与GCSF(11.1％)组之间的存活率不具有统计学差异(图9K-M)。总而言之，这些存活的小鼠模型证明，低剂量的Am80-GCSF减小中性粒细胞减少症小鼠的感染相关的死亡率。

实施例9：CD34+细胞中Am80和RA的效应

蛋白质印迹示出了CD34+细胞中MAT1片段化(其指示了粒细胞分化)(图10A)和视黄酸受体(RARα)低磷酸化(即RARα的磷酸化降低，其指示促进粒细胞分化)(图10B)由Am80的渐进式诱导。与全反式视黄酸(ATRA或RA)相反，Am80诱导了新型基因转录模式。在Am80施用之后观察到了C/EBPε、CD18和颗粒LL-37的显著上调以及p21Cip/Kip mRNA水平的降低(图10C)。

实施例10：白血病细胞和CD34+细胞中的方案效应

Am80-GCSF抑制NB4细胞增殖(图11A)，同时显著促进粒细胞分化(图11B)和在甲酰基-甲硫氨酰基-亮氨酰基-苯丙氨酸(f-Met-Leu-Phe；fMLP)存在下(图11C)或在PMA存在下(图11D)第6天的ROS产生。*，至少P<0.04。G-CSF无法在fMLP或PMA存在下诱导NB4细胞中的ROS产生。

Am80-GCSF类似于GCSF诱导髓细胞生成扩增，同时促进相比于Am80或GCSF显著更大的中性粒细胞分化(图12A、12B)，以及相比于单独Am80或GCSF，在fMLP存在下(图12C)或在PMA存在下(图12D)显著更高的第5天的ROS产生。*，至少P<0.02。

实施例11：在Am80或GCSF或ATRA治疗之后的AML患者胚细胞

对急性骨髓白血病患者的PB初级胚细胞的增殖进行测定(图13A)并且定量P<0.05(图13B)。对AML PB初级胚细胞的粒细胞形态进行分析(图13C)并且定量；Am80对比于G-CSF，P<4.0E-8；Am80对比于对照，P<6.02E-7(图13D)。

在第8天对急性骨髓白血病患者的BM初级胚细胞的增殖进行测定(图13E)并且定量，Am80对比于G-CSF，P<0.008；G-CSF对比于对照，P<0.032(图13F)。对AML BM初级胚细胞的粒细胞形态进行分析(图13G)并且定量；Am80对比于G-CSF，P<9.9E-4；Am80对比于RA，P<1.0E-4(图13H)。在AML BM初级胚细胞中G-CSF诱导了较高的生长速率(图13I)，并且对细胞增殖进行定量；G-CSF对比于对照，P<0.018(图13J)。这些数据表明，G-CSF治疗相比于用Am80或ATRA治疗促进了非APL(急性早幼粒细胞白血病)AML患者胚细胞的生长。

实施例12：Am80-GCSF促进外周血单核细胞和骨髓(BM)细胞中的ROS产生

将单核细胞的上层从三种正常人供体的PB分离，并且用低剂量的Am80、GCSF或Am80-GCSF培养于粒细胞谱系培养基中至多4天(图14A、B)。在每种供体中，Am80-GCSF诱导的中性粒细胞相比于单独Am80或GCSF表现出在fMLP存在下(图14C)或在PMA存在下(图14D)显著更高的ROS产生水平。Am80-GCSF显著促进从正常人供体分离的外周血单核细胞中的ROS产生。

将从急性骨髓白血病(AML)患者新鲜分离的骨髓(BM)细胞或外周血(PB)单核细胞培养于粒细胞谱系诱导培养基中，并且在第3天进行计数(图15A(i)、15B(i)和15C(i))。测定在fMLP存在下(图15A(ii)、15B(ii)和15C(ii))或在PMA存在下(图15A(iii)、15B(iii)和15C(iii))的ROS产生。Am80-GCSF相比于单独Am80或GCSF促进了显著更大的ROS产生。

上文所述的各种方法和技术提供若干实现本申请的途径。当然，应理解根据本文所述的任何特定实施方案并非必定可以实现所述的所有目标或优势。因此，例如，本领域技术人员将认识到，所述方法可以以实现或最优化如本文中教导的一个优势或一组优势的方式进行，而不一定必定实现如本文中教导或指出的其他目标或优势。本文中提到多种替代方案。应理解，一些优选实施方案专门地包括一个、另一个或几个特征，而其他的实施方案专门地排除一个、另一个或几个特征，而又一些其他的实施方案通过包括一个、另一个或几个有利的特征而弱化特定的特征。

此外，本领域技术人员将认识到来自不同实施方案的各种特征的适用性。类似地，本领域的普通技术人员可以以各种组合使用上文所讨论的各种元素、特征和步骤以及各个这样的元素、特征或步骤的其他已知等同物来执行根据本文所述的原理的方法。在不同的实施方案中，所述各种元素、特征和步骤中的一些将被专门地包括而其他的则被专门地排除。

虽然已经在某些实施方案和实施例的上下文中公开了本申请，但是本领域技术人员将理解，本申请的实施方案将专门公开的实施方案扩展到其他替代实施方案和/或用途以及其修改和等同物。

本文中描述了本申请的优选实施方案，包括发明人已知的实现本申请的最佳方式。通过阅读上述描述，那些优选实施方案的变化对普通技术人员而言将变得显而易见。预计本领域技术人员可以适当地使用这些变化，并且可以用本文中特定描述的其他方式实践本申请。因此，经适用的法律许可，本申请的许多实施方案包括在此附加的权利要求中叙述的标的物的所有修改和等同物。此外，除非另外在文中指出或明显与上下文矛盾，否则本申请涵盖所有可能的变化的上述元素的任何组合。

本文中提及的所有专利、专利申请、专利申请公布和其他材料(诸如论文、书籍、说明书、出版物、记录、事物和/或类似的东西)均在此通过引用的方式全部并入本文以达到所有目的，与上述文件相关的任何起诉文档记录、与本文件不一致或冲突的任何上述文件或对迟早与本文件相关的权利要求书的广泛范围有限定作用的任何上述文件除外。举例来说，如果任何并入材料相关的与本文件相关的描述、定义和/或术语使用之间有任何不一致或冲突，那么本文件中的描述、定义和/或术语使用应该优先。

应理解本文中公开的本申请的实施方案是本申请的实施方案的原理的说明。可以使用的其他修改可以在本申请的范围内。因此，举例来说，但不限制，可以根据本文中的教导使用本申请的实施方案的替代构造。因此，本申请的实施方案不严格限于如图所示和所述的实施方案。

以上在详细描述中描述本发明的各种实施方案。尽管这些描述直接描述以上实施方案，但应了解本领域技术人员可设想本文所示以及所述的特定实施方案的修改和/或变化。属于本描述的范围内的任何此类修改或变化都也意图包括在本描述中。除非明确指示，否则发明人意图说明书和权利要求书中的用词和短语被给予对于适用领域中的普通技术人员而言普通并且惯常的含义。

已递呈在提交本申请时为申请人所知的本发明的各种实施方案的上文描述，并且所述上文描述旨在出于说明和描述的目的。本描述并非旨在穷举，也不是将本发明限制于公开的精确形式，并且根据上文教导，许多修改和变化为可能的。所述实施方案用于解释本发明的原理和本发明的实际应用，并且用于使本领域其他技术人员能够以各种实施方案且在如适于涵盖的特定用途的各种修改下利用本发明。因此，意图本发明不限于所公开的用于实现本发明的特定实施方案。

尽管已示出并且描述本发明的特定实施方案，但本领域技术人员将显而易知的是，基于本文中的教导，可在不脱离本发明和其更广泛方面的情况下进行改变和修改，并且因此随附权利要求将在其范围内涵盖如在本发明的真实精神和范围内的所有所述改变和修改。