本发明涉及包含特定的甲氧基黄酮的NOX抑制剂以及NFκB抑制剂及其利用。
背景技术：
NADPH氧化酶(NOX)是已知存在于嗜中性粒细胞等且生成O2-的酶。因此，认为NOX的抑制对与生物体内氧化有关的各种疾病的预防或治疗有用。
NFκB是调节编码促炎因子(例如，TNFα、IL-1β、IL-6)、化学趋化因子(例如，IL-8、MIP1α)、诱导性效应酶(iNOS及COX-2)等分子的基因转录的转录因子，在炎症反应中发挥重要的功能。显示出NFκB经路的活化有可能发展为各种炎症性疾病。
据报道植物的提取物所包含的几种甲氧基黄酮具有抗氧化作用。这样的甲氧基黄酮中的大多数具有羟基(非专利文献1～3)。
黑姜(Kaemp feria parviflora)是属于姜科的植物的一种，在日本也称作黑郁金。黑姜在泰国是也被称作Kra chai dahm的传统药草的一种。已知黑姜不仅包含具有羟基的甲氧基黄酮，还包含不具有羟基的甲氧基黄酮(非专利文献4)。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1 Biochem Pharmacol.，2012，84(2)，182-191
非专利文献2 Free Radic Biol Med.，1999，27(1-2)，95-99
非专利文献3 Biochem Pharmacol.，1987，36(5)，717-720
非专利文献4 大阪市立大学生活科学研究科东锐明氏博士论文“姜科植物Kaemp feria parviflora所包含的成分的结构与α-葡萄糖苷酶抑制活性及抗诱变性”
技术实现要素：
本发明的课题在于提供具有优异作用的NOX抑制剂及NFκB抑制剂，以及起因于NOX、NFκB的疾病的预防或治疗剂。
本发明者对这样的课题进行了深入研究，结果发现从黑姜所得到的特定的甲氧基黄酮具有优异的NOX抑制作用及/或NFκB抑制作用。
即，本发明涉及以下内容，但不限定于此。
[1]一种NOX抑制剂，其特征在于，包含具有以下式(I)所示结构的至少1种的甲氧基黄酮，
(式中，R1、R4以及R5各自独立地为氢或甲氧基，R2以及R3为甲氧基。)
[2]根据[1]所述的NOX抑制剂，其特征在于，所述至少1种的甲氧基黄酮选自由5，7，3’，4’-四甲氧基黄酮、3，5，7，3’，4’-五甲氧基黄酮、5，7-二甲氧基黄酮以及5，7，4’-三甲氧基黄酮构成的组A。
[3]根据[2]所述的NOX抑制剂，其特征在于，相对于组A的甲氧基黄酮与由3，5，7-三甲氧基黄酮、3，5，7，4’-四甲氧基黄酮、5-羟基-3，7，3’，4’-四甲氧基黄酮、5-羟基-7-甲氧基黄酮、5-羟基-7，4’-二甲氧基黄酮、5-羟基-3，7-二甲氧基黄酮以及5-羟基-3，7，4’-三甲氧基黄酮构成的组B的甲氧基黄酮的总含量，组A的甲氧基黄酮的总含量的比例(A/(A+B))以摩尔基准计超过0.65。
[4]一种起因于NOX的疾病的预防或治疗剂，其特征在于，包含所述[1]或[2]所述的至少1种的甲氧基黄酮。
[5]根据[4]所述的预防或治疗剂，其特征在于，所述疾病选自过敏性疾病、帕金森病、脑梗塞、白内障、癫痫、脊髓损伤、动脉硬化、未成熟儿视网膜症、肾障碍、消化性溃疡、胰腺炎、溃疡性大肠炎、心肌梗塞、成人呼吸窘迫综合症、肺气肿、慢性类风湿性关节炎等的胶原病、血管炎、浮肿、糖尿病并发症、紫外线损伤、低气压病、卟啉血症、烧烫伤、冻伤、接触性皮炎、休克、多脏器功能不全、DIC、癌、老化、疲劳、肌少症(肌力降低)、线粒体功能障碍、认知障碍症以及阿尔茨海默病。
[6]根据[4]或[5]所述的预防或治疗剂，其特征在于，相对于[2]所述的组A的甲氧基黄酮与[3]所述的组B的甲氧基黄酮的总含量，组A的甲氧基黄酮的总含量的比例(A/(A+B))以摩尔基准计超过0.65。
[7]一种NFκB抑制剂，其特征在于，包含具有以下式(I)所示结构的至少1种的甲氧基黄酮，
(式中，R1、R4以及R5各自独立地为氢或甲氧基，R2以及R3为甲氧基。)
[8]根据[7]所述的NFκB抑制剂，其特征在于，所述至少1种的甲氧基黄酮选自由5，7，3’，4’-四甲氧基黄酮、5，7-二甲氧基黄酮以及5，7，4’-三甲氧基黄酮构成的组A’。
[9]根据[8]所述的NFκB抑制剂，其特征在于，相对于组A’的甲氧基黄酮与由3，5，7，3’，4’-五甲氧基黄酮、3，5，7-三甲氧基黄酮、3，5，7，4’-四甲氧基黄酮、5-羟基-3，7，3’，4’-四甲氧基黄酮、5-羟基-7-甲氧基黄酮、5-羟基-7，4’-二甲氧基黄酮、5-羟基-3，7-二甲氧基黄酮以及5-羟基-3，7，4’-三甲氧基黄酮构成的组B’的甲氧基黄酮的总含量，组A’的甲氧基黄酮的总含量的比例(A’/(A’+B’))以摩尔基准计超过0.48。
[10]一种起因于NFκB的疾病的预防或治疗剂，其特征在于，包含所述[7]或[8]所述的至少1种的甲氧基黄酮。
[11]根据[10]所述的预防或治疗剂，其特征在于，所述疾病选自类风湿性关节炎、炎症性大肠炎、变形性关节病、骨溶解症、腱炎、坐骨神经痛、椎间盘突出、狭窄症、脊髄病、腰痛、椎间关节痛、腕管综合症、踝管综合症、腰椎术后疼痛综合症、艾滋病、动脉硬化、哮喘、关节炎、糖尿病、炎症性大肠炎、肝炎、中风、认知障碍症、肌肉消耗、病毒感染、包括光老化的皮肤老化、癌以及老化。
[12]根据[10]或[11]所述的预防或治疗剂，其特征在于，相对于所述[8]所述的组A’的甲氧基黄酮与[9]所述的组B’的甲氧基黄酮的总含量，组A’的甲氧基黄酮的总含量的比例(A’/(A’+B’))以摩尔基准计超过0.48。
[13]一种NOX抑制剂，其特征在于，包含3’，4’-二甲氧基黄酮。
[14]一种起因于NOX的疾病的预防或治疗剂，其特征在于，包含3’，4’-二甲氧基黄酮。
[15]根据[14]所述的预防或治疗剂，其特征在于，所述疾病选自过敏性疾病、帕金森病、脑梗塞、白内障、癫痫、脊髓损伤、动脉硬化、未成熟儿视网膜症、肾障碍、消化性溃疡、胰腺炎、溃疡性大肠炎、心肌梗塞、成人呼吸窘迫综合症、肺气肿、慢性类风湿性关节炎等的胶原病、血管炎、浮肿、糖尿病并发症、紫外线损伤、低气压病、卟啉血症、烧烫伤、冻伤、接触性皮炎、休克、多脏器功能不全、DIC、癌、老化、疲劳、肌少症(肌力降低)、线粒体功能障碍、认知障碍症以及阿尔茨海默病。
本发明可提供具有优异作用的NOX抑制剂以及NFκB抑制剂。另外，还可利用NOX抑制剂以及NFκB抑制剂提供起因于NOX、NFκB的疾病的预防或治疗剂。
本发明中所使用的甲氧基黄酮与现有被发现具有抗氧化作用等的甲氧基黄酮不同，尽管不具有羟基，但显示优异的NOX抑制等的作用。
具体实施方式
(甲氧基黄酮)
本发明中，使用具有以下式(I)
(式中，R1、R4以及R5各自独立地为氢或甲氧基，R2以及R3为甲氧基)所示结构的至少1种、优选至少2种、更优选至少3种、更优选至少4种、更优选至少5种、更优选至少6种、更优选至少7种、更优选至少8种的甲氧基黄酮。
在本发明的NOX抑制或起因于NOX的疾病的治疗或预防中，优选所述至少1种的甲氧基黄酮选自由5，7，3’，4’-四甲氧基黄酮、3，5，7，3’，4’-五甲氧基黄酮、5，7-二甲氧基黄酮以及5，7，4’-三甲氧基黄酮构成的组A。NOX抑制剂或起因于NOX的疾病的治疗或预防剂不仅包含组A的甲氧基黄酮，还可包含其他的化合物，例如包含来自黑姜的选自由3，5，7-三甲氧基黄酮、3，5，7，4’-四甲氧基黄酮、5-羟基-3，7，3’，4’-四甲氧基黄酮、5-羟基-7-甲氧基黄酮、5-羟基-7，4’-二甲氧基黄酮、5-羟基-3，7-二甲氧基黄酮以及5-羟基-3，7，4’-三甲氧基黄酮构成的组B的至少1种的甲氧基黄酮。然而，组A的甲氧基黄酮显示出高于组B的甲氧基黄酮的NOX抑制作用。因此，组A的甲氧基黄酮的含有率高的为佳。例如，相对于组A以及组B的甲氧基黄酮的总含量，组A的甲氧基黄酮的总含量的比例(A/(A+B))以摩尔基准(或重量基准)计优选超过0.65、更优选0.66以上、更优选0.67以上、更优选0.68以上、更优选0.69以上、更优选0.70以上、更优选0.71以上。该比例没有上限值，该比例也可为1.00以下。
在本发明的NFκB抑制或起因于NFκB的疾病的治疗或预防中，优选所述至少1种的甲氧基黄酮选自由5，7，3’，4’-四甲氧基黄酮、5，7-二甲氧基黄酮以及5，7，4’-三甲氧基黄酮构成的组A’。NFκB抑制剂或起因于NFκB的治疗或预防剂不仅包含组A’的甲氧基黄酮，还可包含其他的化合物，例如，还可包含来自黑姜的选自由3，5，7，3’，4’-五甲氧基黄酮、3，5，7-三甲氧基黄酮、3，5，7，4’-四甲氧基黄酮、5-羟基-3，7，3’，4’-四甲氧基黄酮、5-羟基-7-甲氧基黄酮、5-羟基-7，4’-二甲氧基黄酮、5-羟基-3，7-二甲氧基黄酮以及5-羟基-3，7，4’-三甲氧基黄酮构成的组B’中的至少1种的甲氧基黄酮。然而，组A’的甲氧基黄酮显示出高于组B’的甲氧基黄酮的NFκB抑制作用。因此，组A’的甲氧基黄酮的含有率高的为佳。例如，相对于组A’以及组B’的甲氧基黄酮的总含量，组A’的甲氧基黄酮的总含量的比例(A’/(A’+B’))以摩尔基准(或重量基准)计，优选超过0.48、更优选0.49以上、更优选0.50以上、更优选0.51以上、更优选0.52以上、更优选0.53以上、更优选0.54以上、更优选0.55以上、更优选0.60以上。该比例没有上限值，该比例也可为1.00以下。
或者，甲氧基黄酮为3’，4’-二甲氧基黄酮。
上述甲氧基黄酮的大部分例如可根据非专利文献4所述的方法从黑姜(Kaemp feria parviflora)中得到。或者，例如还可根据本说明书的实施例1所详述的方法得到。黑姜是属于姜科的植物的一种，由于以东南亚为中心自生，故而可容易获得。已知3’，4’-二甲氧基黄酮例如可使用溶剂从指甲花(Lawsonia alba)进行提取。例如，可参考Phytochemistry Letters，2011，4，454-458。
所述抑制剂以及治疗或预防剂所包含的甲氧基黄酮的种类以及量可根据需要基于公知的方法进行调整。例如，还可使用公知的纯化方法将特定的甲氧基黄酮除去，还可将特定的经纯化的甲氧基黄酮添加到所述抑制剂，或治疗或预防剂中。
另外，在本发明中，还可从黑姜得到包含式(I)的甲氧基黄酮的油脂提取物来利用。该油脂提取物为从黑姜经油脂提取所得到的提取物。该提取物含有甲氧基黄酮，而且黑姜提取物特有的黑紫色的强度降低。该提取物还可进一步包含油脂，尤其是用于提取的油脂。
认为该油脂提取物与不是从黑姜得到的物质、虽然以黑姜为原料但不是经油脂提取得到的物质相比，在所含有的成分的种类以及比率等方面不同。例如，认为从除黑姜以外的植物所得到的提取物也可包含甲氧基黄酮，但其种类、比率与该油脂提取物不同。另外，虽然黑姜为原料，但从其通过除油脂提取以外的方法，例如通过含水醇提取所得到的提取物中的甲氧基黄酮的种类、比率与该油脂提取物不同。另一方面，油脂提取可直接对黑姜进行，也可间接地例如对从黑姜使用除油脂以外的溶剂，例如水、亲水性溶剂或它们的混合物所得到的提取液进行。
该油脂提取物含有至少1种的式(I)的甲氧基黄酮。该甲氧基黄酮优选选自组A。该提取物还可进一步含有选自组B的甲氧基黄酮。该油脂提取物优选包含选自组A以及B的11种甲氧基黄酮中的至少1种、更优选至少2种、更优选至少3种、更优选至少4种、更优选至少5种、更优选至少6种、更优选至少7种、更优选至少8种、更优选至少9种、更优选至少10种、更优选11种。
可用于该油脂提取物的制造且可包含于该提取物的油脂，只要可溶解甲氧基黄酮就没有特别限定。典型而言，该油脂选自中链甘油三酯、甘油二酯、芝麻色拉油、橄榄油、大豆油、菜籽油、玉米油、大米胚芽油、葵花籽油、紫苏油、白苏油中的至少1种。涉及中链甘油三酯所使用的“中链脂肪酸”意味着碳原子数8～12的脂肪酸。构成该甘油三酯的脂肪酸部分内的至少一个、优选二个、更优选三个是中链脂肪酸。
在该油脂提取物中，黑紫色的强度得到降低。为了对其进行确认，测定该提取物的吸光度有效。
具体而言，从该提取物制备组A以及B的11种甲氧基黄酮的总含量为5.0mg/ml的溶液，并测定该溶液在波长660nm处的吸光度。在该油脂提取物中，这样所测定的吸光度为0.10以下。该吸光度优选0.07以下、更优选0.05以下。只要没有特别声明，本说明书中的吸光度意味着比色池长度(光路长)为10mm时的吸光度。用于测定的装置的比色池长度不为10mm时，将所得到的吸光度的值换算为比色池长度为10mm时的值。另外，为了测定吸光度，使用适当的空白。
以下，说明该油脂提取物的制造方法。
例如，该制造方法包含使油脂接触黑姜的植物体从而提取1种以上的甲氧基黄酮。该方法的典型例如以下的记载。
首先，准备黑姜的植物体。将该植物体或其部位根据需要进行干燥并粉碎。接着，使该植物体或其部位与油脂接触来进行提取。提取条件只要能够提取甲氧基黄酮就没有特别限定。典型的提取温度为50～180℃、70～170℃、70～150℃、100～150℃或120～150℃。典型而言，提取时间为1分钟～1天、10分钟～10小时或15分钟～5小时。另外，典型而言，所使用的油脂的容量为黑姜重量的0.1～30倍或0.5～15倍。所使用的油脂的例子如上所述。
虽然不拘泥于理论，但认为在该提取中甲氧基黄酮转移到油脂中，黑姜的生成黑紫色的成分留在黑姜的植物体中。另外，认为生成黑姜特有的香味的成分也没有转移到油脂而留在该植物体中。
接着，进行提取后，根据需要从通过该提取所得到的含油脂提取物中通过过滤或离心分离除去不溶性固体成分。
或者，油脂提取物的制造包含使水、亲水性溶剂或它们的混合物接触黑姜的植物体，提取1种以上的甲氧基黄酮，其次使油脂接触通过该提取所得到的中间提取物从而提取该甲氧基黄酮。该方法的典型例如以下的记载。
首先，与上述同样地准备黑姜的植物体。接着，使水、亲水性溶剂或它们的混合物接触该植物体或其部位来进行提取。提取条件只要能够提取甲氧基黄酮就没有特别限定。典型的提取温度为室温～回流温度、40℃～回流温度、50℃～回流温度、回流温度，优选50℃～回流温度、或回流温度。典型而言，提取时间为1分钟～1天、10分钟～10小时、或15分钟～5小时。另外，典型而言，所使用的水、亲水性溶剂或它们的混合物的容量为黑姜重量的0.1～30倍、或0.5～15倍。所使用的亲水性溶剂优选为C1-3醇以及/或丙酮、更优选乙醇。例如，使用50～100v/v％乙醇进行提取。将通过该提取工序所得到的中间提取物交付于油脂提取工序。
在油脂提取工序中，使该中间提取物与油脂接触进行提取。提取条件为只要能够提取甲氧基黄酮就没有特别限定。提取温度没有特别限定，例如，在5℃以上、10℃以上、20℃以上、30℃以上、40℃或50℃以上进行。提取温度的上限值没有特别限制，只要在水、亲水性溶剂或它们的混合物的回流温度以下即可。典型而言，提取时间为1分钟～1天、10分钟～10小时或15分钟～5小时。另外，典型而言，所使用的油脂的容量为黑姜重量的0.01～30倍或0.1～15倍。所使用的油脂的例子如上述那样。
进而，根据情况，在使油脂接触该中间提取物前以及/或在它们接触期间，使水、亲水性溶剂或它们的混合物从该中间提取物蒸发。蒸发可在常压下进行，也可在减压下进行。在这样进行积极的蒸发时，提取时间并不太重要。认为若随着蒸发的进行，水、亲水性溶剂或它们的混合物的量降低，则甲氧基黄酮根据情况与该亲水性溶剂等一起转移到油脂中。
虽然不拘泥于理论，但认为在油脂提取中甲氧基黄酮转移到油脂中，黑姜的生成黑紫色的成分不转移到油脂中。
接着，进行提取后，根据需要，从通过该提取所得到的含油脂提取物通过过滤或离心分离除去不溶性固体成分。这与中间提取物也相同。
根据所述的2种方法时，可得到含油脂提取物。其可不进行进一步纯化来使用，也可根据需要进行纯化。例如，也可将该含油脂提取物交付于进一步的提取工序来除去油脂。具体而言，使水、亲水性溶剂或它们的混合物接触该含油脂提取物，提取1种以上的甲氧基黄酮。此时，若有必要还可在该含油脂提取物中添加低极性的溶剂，例如正己烷这样的C1-8的烃。
使用的亲水性溶剂或亲水性溶剂与水的混合物的例子如上所述。提取温度没有特别限定，例如，在5℃以上、10℃以上、20℃以上、30℃以上、40℃或50℃以上进行。提取温度的上限值没有特别限制，但只要在水、亲水性溶剂或它们的混合物的回流温度以下即可。典型而言，提取时间为1分钟～1天、10分钟～10小时、或15分钟～5小时。另外，典型而言，所使用的水、亲水性溶剂或它们的混合物的容量为油脂提取物的重量的0.01～30倍或0.1～15倍。
进而，在甲氧基黄酮的提取中，可得到来自该含油脂提取物的油脂相与来自该水、亲水性溶剂或它们的混合物的相的2相混合物，将该混合物进行液-液分离。作为结果，可将该水、亲水性溶剂或它们的混合物的相(其为包含甲氧基黄酮与溶剂的提取物)从油脂相分离。为了进行液-液分离，例如可仅将该2相混合物静置，也可进行离心分离。接着，得到所分离的提取物。
所分离的提取物包含甲氧基黄酮，而且成为包含溶剂的液体的形态。可直接利用该液体，也可除去溶剂(水、亲水性溶剂或其混合物)，从而得到包含甲氧基黄酮的粉末形态的提取物。除去溶剂的方法没有特别限定，可列举在常压或减压下的蒸馏、冷冻干燥等。
这样除去了油脂的提取物以相对较高的浓度含有黑姜所特有的甲氧基黄酮。该提取物也可根据需要进一步纯化。
在油脂提取物中，与使用乙醇等的亲水性溶剂所得到的提取物相比，上述的A/(A+B)以及A’/(A’+B’)的比例相对较高。油脂提取物中的该比例的优选范围如上述那样。
(NOX抑制剂)
本发明者发现式(I)的甲氧基黄酮作为NADPH氧化酶(NOX)抑制剂有效。因此，从一个侧面来看，本发明为包含式(I)的甲氧基黄酮的至少一种的NOX抑制剂或用于抑制NOX的组合物(在本说明书中，“NOX抑制剂”与“用于抑制NOX的组合物”相互代替地使用，只要没有特别声明，使用其中一个的时候还意味着另一个)。在其他方式中，该发明还可为包含将式(I)的甲氧基黄酮的至少一种给予对象的用于抑制NOX的方法。或者，还可使用3’，4’-二甲氧基黄酮来代替式(I)的甲氧基黄酮或在其基础上追加。
NOX的抑制牵涉到起因于NOX的疾病的预防或治疗。因此，从其他侧面来看，本发明为包含式(I)的甲氧基黄酮的至少1种的起因于NOX的疾病的预防或治疗剂或用于该预防或治疗的组合物(在本说明书中，“起因于NOX的疾病的预防或治疗剂”与“用于起因于NOX的疾病的预防或治疗的组合物”相互代替地使用，只要没有特别声明，使用其中一个的时候还意味着另一个)。在其他方式中，该发明还可为包含将该甲氧基黄酮的至少一种给予对象的用于该疾病的预防或治疗的方法。这样的疾病包括特应性皮炎、过敏性鼻炎(花粉症)、过敏性结膜炎、过敏性肠胃炎、支气管哮喘、儿童哮喘、食物过敏、药物过敏、荨麻疹等的过敏性疾病、帕金森病、脑梗塞、白内障、癫痫、脊髓损伤、动脉硬化、未成熟儿视网膜症、肾障碍、消化性溃疡、胰腺炎、溃疡性大肠炎、心肌梗塞、成人呼吸窘迫综合症、肺气肿、慢性类风湿性关节炎等的胶原病、血管炎、浮肿、糖尿病并发症、紫外线损伤、低气压病、卟啉血症、烧烫伤、冻伤、接触性皮炎、休克、多脏器功能不全、DIC、癌、老化、疲劳、肌少症(Sarcopenia)(肌力降低)、线粒体功能障碍、认知障碍症以及阿尔茨海默病。或者，还可使用3’，4’-二甲氧基黄酮来代替式(I)的甲氧基黄酮或在其基础上追加。
从其他侧面来看，本发明为包含式(I)的甲氧基黄酮的至少一种的抗氧化剂(更具体而言，生物体内氧化的防止、抑制或降低剂)或用于防止、抑制或降低生物体内氧化的组合物(在本说明书中，“抗氧化剂”、“生物体内氧化的防止、抑制或降低剂”、“用于防止、抑制或降低生物体内氧化的组合物”相互代替地使用，只要没有特别声明，记载上述三者之一的时候还意味着剩余两个)。在其他方式中，该发明还可为包含将式(I)的甲氧基黄酮的至少一种给予对象的用于防止、抑制或降低生物体内氧化的方法。在本说明书中，生物体内氧化是指在生物体内因活性氧而产生的各种氧化反应。或者，还可使用3’，4’-二甲氧基黄酮来代替式(I)的甲氧基黄酮或在其基础上追加。
只要可得到所期望的效果，本发明的NOX抑制剂、起因于NOX的疾病的预防或治疗剂、抗氧化剂中的式(I)的甲氧基黄酮的总含量就没有特别限定，优选0.01～50w/w％、更优选0.1～40w/w％、更优选0.5～30w/w％。
为了发挥NOX抑制作用、起因于NOX的疾病的预防或治疗、抗氧化等前述的所期望的效果，成人每1天的式(I)的甲氧基黄酮的总摄取量优选1～500mg、更优选3～200mg、进一步优选5～100mg。
上述的量也可应用于3’，4’-二甲氧基黄酮。
(NFκB抑制剂)
本发明者发现式(I)的甲氧基黄酮作为NFκB抑制剂有效。因此，从其他侧面来看，本发明为包含式(I)的甲氧基黄酮中的至少一种的NFκB抑制剂或用于抑制NFκB的组合物(在本说明书中，“NFκB抑制剂”与“用于抑制NFκB的组合物”相互代替地使用，只要没有特别声明，使用其中一个的时候还意味着另一个)。在其他方式中，该发明还可为包含将式(I)的甲氧基黄酮的至少一种给予对象的用于抑制NFκB的方法。或者，还可使用3’，4’-二甲氧基黄酮来代替式(I)的甲氧基黄酮或在其基础上追加。
NFκB的抑制牵涉到起因于NFκB的疾病的预防或治疗。因此，从其他侧面来看，本发明为包含式(I)的甲氧基黄酮的至少1种的起因于NFκB的疾病的预防或治疗剂或用于该预防或治疗的组合物(在本说明书中，“起因于NFκB的疾病的预防或治疗剂”与“用于起因于NFκB的疾病的预防或治疗的组合物”相互代替地使用，只要没有特别声明，使用其中一个的时候还意味着另一个)。在其他方式中，该发明涉及包含将该甲氧基黄酮的至少一种给予对象的用于该疾病的预防或治疗的方法。这样的疾病包括类风湿性关节炎、炎症性大肠炎、变形性关节病、骨溶解症、腱炎、坐骨神经痛、椎间盘突出、狭窄症、脊髄病、腰痛、椎间关节痛、腕管综合症、踝管综合症、腰椎术后疼痛综合症、艾滋病、动脉硬化、哮喘、关节炎、糖尿病、炎症性大肠炎、肝炎、中风、认知障碍症、肌肉消耗、病毒感染、包含光老化的皮肤老化、癌以及老化。或者，还可使用3’，4’-二甲氧基黄酮来代替式(I)的甲氧基黄酮或在其基础上追加。
只要可得到所期望的效果，本发明的NFκB抑制剂、起因于NFκB的疾病的预防或治疗剂中的式(I)的甲氧基黄酮的总含量就没有特别限定，优选0.01～50w/w％、更优选0.1～40w/w％、更优选0.5～30w/w％。
为了发挥NFκB抑制作用、起因于NFκB的疾病的预防或治疗等前述的所期望的效果，成人每1天的式(I)的甲氧基黄酮的总摄取量优选1～500mg、更优选3～200mg、进一步优选5～100mg。
上述的量还可应用于3’，4’-二甲氧基黄酮。
(其他成分)
只要不有损于其效果，则除式(I)的甲氧基黄酮以外，本发明的NOX或NFκB抑制剂、起因于NOX或NFκB的疾病的预防或治疗剂、抗氧化剂还可配合任意的成分。例如，除维生素E、维生素C等的维生素类、矿物质类、激素、营养成分、香料等的生理活性成分以外，还可适当配合制剂化中所配合的乳化剂、等张剂(等渗剂)、缓冲剂、助溶剂、防腐剂、稳定化剂等。
(应用)
本发明的NOX或NFκB抑制剂、起因于NOX或NFκB的疾病的预防或治疗剂、抗氧化剂还可作为饮食品(功能性食品、健康辅助食品、营养机能食品、特殊用途食品、特定保健用食品、营养辅助食品、食疗用食品、健康食品、营养强化剂等)、医药品或香妆品，或作为其原料使用。饮食品以及医药品还可以是作为宠物的饵料而加工的宠物食品、动物饲料等，以及动物用医药品。
该饮食品的形态没有特别限定，例如，为清凉饮料水(例如，运动饮料、碳酸饮料、果汁饮料)、糕点类(例如，蛋糕、饼干、面包、糖果)、面类(例如，乌冬面、荞麦面、拉面、意大利面)、豆酱、酱油、醋、色拉油、芝麻油、豆浆、牛奶。或者，也可为片剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂(也包含软胶囊)等的形态。
该医药品的形态没有特别限定，例如，为外用剂(例如，洗液、乳液剂、贴剂、软膏剂)、口服剂(片剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂(还包含软胶囊)、溶液剂、混悬液剂)、注射剂、输注剂。
该香妆品的形态没有特别限定，例如，为化妆水、凝胶、洗液、霜、面膜剂、乳液、粉底、口红、粉、洗面奶、生发液。
(数值范围)
为了明确化而进行记载，在本说明书中通过下限值与上限值所表示的数值范围，即“下限值～上限值”包含它们的下限值以及上限值。例如，“1～2”所表示的范围包含1以及2。
实施例
[实施例1]
(甲氧基黄酮的单离纯化)
在黑姜150g中加入50％乙醇水溶液1500ml，进行2小时加热回流提取。将冷却后所得到的提取液过滤，在减压下浓缩并进行冷冻干燥，从而得到黑姜提取物25.7g。将所得到的提取物中的9g交付于使用Diaion HP20(三菱化学株式会社制)的柱色谱，分级分离为4个组分(30％乙醇洗脱部、50％乙醇洗脱部、70％乙醇洗脱部、100％乙醇洗脱部)。其中，将50％乙醇洗脱部交付于高效液相色谱，单离出5,7,3',4'-四甲氧基黄酮(64mg)、3,5,7,3',4'-五甲氧基黄酮(464mg)、5,7-二甲氧基黄酮(145mg)、5,7,4'-三甲氧基黄酮(188mg)、3,5,7-三甲氧基黄酮(35mg)、3,5,7,4'-四甲氧基黄酮(96mg)。接着，对100％乙醇洗脱部也同样地进行通过液相色谱的分离纯化，单离出5-羟基-3,7,3',4'-四甲氧基黄酮(15mg)、5-羟基-7-甲氧基黄酮(84mg)、5-羟基-7,4'-二甲氧基黄酮(56mg)、5-羟基-3,7-二甲氧基黄酮(100mg)、5-羟基-3,7,4'-三甲氧基黄酮(110mg)。在将单离的化合物的图谱数据与文献(大阪市立大学生活科学研究科东锐明氏博士论文“姜科植物Kaemp feria parviflora所包含的成分的结构与α-葡萄糖苷酶抑制活性及抗诱变性”)所记载的各种图谱数据进行对比的基础上进行鉴定。
[实施例2]
(油脂提取物的制造)
在3g以及15g的黑姜中分别加入橄榄油30mL，于120℃进行30分钟提取后，冷却后进行过滤，得到2个淡黄色的黑姜油脂提取物。按照以下的分析条件，对所得到的2个油脂提取物中的实施例1所记载的11种甲氧基黄酮的总含量进行定量时，其值为6.2mg/mL(从3g的黑姜中)、22.4mg/mL(从15g的黑姜中)。且，上述提取物中的任一个都包含实施例1所记载的11种甲氧基黄酮的全部。
(甲氧基黄酮的分析定量)
在黑姜油脂提取物1.0mL中加入正己烷1.0mL稀释后，用2.0mL的80％甲醇水溶液进行3次甲氧基黄酮的提取。使所得到的80％甲醇提取液通过Mega Bond Elute C18(安捷伦科技有限公司制)后，以将吸附于Mega Bond Elute C18的甲氧基黄酮洗脱为目的，使80％甲醇2.0mL过柱。合并所得到的液体后，最终定量为10mL，并作为HPLC用的分析试样。
(HPLC分析条件)
色谱柱：Develosil C30UG5(4.6×150mm、5μm、野村化学株式会社制)
检测：280nm(PDA为200～600nm)
柱温：40℃
流动相A：0.05％三氟乙酸水溶液
流动相B：90％乙腈水溶液中的三氟乙酸0.05％溶液
梯度：流动相B 50％-50％-70％-70％(0分钟-7.5分钟-20分钟-25分钟)
流速：1.0mL/分钟
进样量：10μL
[实施例3]
(NOX抑制活性测定方法)
分化的HL-60细胞的制备：
已知人骨髄性白血病细胞HL-60细胞在未分化状态下重复増殖，通过添加DMSO(dimethyl sulfoxide)、维甲酸等分化为成熟粒细胞，并失去增殖能力，同时成为分化的指标的NOX(NADPH oxidase)在细胞内表达，该NOX可作为用于评价NOX抑制活性的酶源来利用。
为了分化成表达NOX的粒细胞，将用含10％FBS的RPMI 1640培养基培养的未分化HL-60细胞混悬于含有1％DMSO的含10％FBS的RPMI 1640培养基中，使成为5×105细胞/ml，将该混悬液在内径10cm的培养皿中各分注15ml，在CO2孵育箱(37℃)中培养3天后，将10ml含有1％DMSO的含10％FBS的RPMI 1640培养基追加到各培养皿中，进一步培养3天，从而可得到表达了NOX的分化的HL-60细胞。如下所述，使用分化的HL-60细胞的细胞破碎液或直接使用者活细胞来测定NOX活性。
由使用了细胞破碎液的cell-free系统进行的NOX活性测定：
将通过DMSO处理而分化的HL-60细胞通过离心处理进行收集，用PBS(磷酸缓冲生理盐水)进行一次清洗后，使用细胞破碎用的缓冲液(含有131mM NaCl及340mM蔗糖的8mM磷酸缓冲液pH7.0)进行混悬，以便成为1×108细胞/mL。冰浴冷却后，使用超声波破碎机(Bioruptor UCD-250HSA、Cosmo Bio制)，在4℃以下的条件下重复3次“以最大输出功率破碎20秒/间隔冷却30秒”的程序，从而得到细胞破碎液。将破碎液通过1000g、4分钟的离心处理来除去残渣，在所得到的上清中加入9倍容量的反应用的缓冲液(含有1mM EGTA、10μMFAD及170mM蔗糖的65mM磷酸缓冲液pH7.0)，制备NOX测定用的细胞破碎上清液(相当于1×107细胞/ml)。
NOX的反应如下：在96孔板的每孔中注入50μl的上述细胞破碎液，进一步添加25μl作为NOX活化剂的0.5mM SDS溶液、25μl作为基质的0.4mMNADPH溶液，于25℃进行30～90分钟。NOX活性通过将NADPH的消耗率进行荧光测定(Ex：355nm/Em：460nm)来求得。
受试样品的NOX抑制活性如下进行：制备样品的DMSO溶液(试剂的情况通常为10mM)，通过DMSO制备3倍稀释系列的溶液，将其以1μl/孔分别添加到上述的反应液中进行酶反应，所得到的抑制活性用IC50值(μM、提取物的情况为μg/ml)表示。
使用分化的HL-60活细胞的NOX活性测定：
将通过DMSO处理而分化的HL-60细胞进行离心处理来收集，使其混悬于不包含FBS及酚红的D-MEM培养基中，从而成为5×106细胞/ml。NOX的反应如下：在96孔板的每孔中注入25μl的上述细胞混悬液，进一步分别添加25μl使用上述的D-MEM所制备的0.8mg/ml WST-1溶液、制备成规定浓度的受试样品溶解液(制备样品的DMSO溶液(试剂的情况通常为10mM)，从其使用DMSO制备3倍稀释系列的溶液，将其溶解于上述的D-MEM成为1v/v％以下，从而制备该受试样品溶解液)进行搅拌后，添加25μl的4μM PMA(12-豆蔻酸-13-乙酸佛波醇(Phorbol 12-Myristate 13-acetate)、终浓度为1μM)D-MEM溶液来进行NOX的活化，于37℃进行45分钟的反应，测定作为NOX酶生成物的超氧与反应液中的WST-1反应所生成的黄色甲臜在450nm处的吸光度。且，在该NOX活性测定系统中，已确认只要不添加PMA则NOX不活化。
所得到的抑制活性用IC50值(μM、提取物时为μg/ml)表示。
[实施例4]
(甲氧基类黄酮的NOX抑制活性的对比)
根据实施例3，根据通过使用了细胞破碎液的cell-free系统进行的NOX活性测定，将几种甲氧基类黄酮的NOX抑制活性进行对比。结果如表1所示。
如表1所示，发现作为木犀草素的甲氧基体的5，7，3’，4’-四甲氧基黄酮、作为槲皮素的甲氧基体的3，5，7，3’，4’-五甲氧基黄酮等具有强的NOX抑制活性。上述5，7-二甲氧基类黄酮类包含于黑姜等中。另一方面，没有发现已知存在于柑橘类的川陈皮素等的六甲氧基黄酮具有强的NOX抑制活性。且，作为NOX抑制剂的VAS2870在使用该细胞破碎液的cell-free系统中的IC50值为3.3μM。
表1
[实施例5]
(来自黑姜化合物的NOX抑制活性)
根据实施例3，根据通过使用了细胞破碎液的cell-free系统进行的NOX活性测定，将从黑姜提取·分级分离的甲氧基类黄酮的NOX抑制活性进行对比。从黑姜所得到的类黄酮中的任一种均存在具有甲氧基的特征。其中，在A环的5位与7位具有甲氧基的黄酮中发现了强的NOX抑制活性，在5位具有羟基的类黄酮中没有发现NOX抑制活性。3位的甲氧基并不是致命的，但发现了使活性减弱的趋势。因此，认为式(I)所示的甲氧基黄酮具有优异的NOX抑制活性。另外，该系统中的VAS2870(NOX抑制剂)的IC50为6.3μM。
表2
[实施例6]
为了确认因黑姜的批次引起的油脂提取物的组成的不同而准备2批黑姜200g，关于各批黑姜分别加入乙醇1000mL，进行1小时加热回流提取。将所得到的液体冷却后进行抽滤，分为残渣与提取液。再次在残渣中加入乙醇1000mL，进行1小时加热回流提取并过滤，与先前所得到的提取液合并。接着，在提取液中加入中链甘油三酯100mL，通过减压浓缩馏去乙醇后，抽滤析出的不溶物并除去，从而得到2个黑姜油脂提取物。按照实施例2分析上述提取物中的甲氧基黄酮的含量时，甲氧基黄酮的总量为90.4mg/mL(以下，将该提取物称作“提取物A”)、54.9mg/mL(以下，将该提取物称作“提取物B”)。另外，将上述2个提取物中的甲氧基黄酮总量用橄榄油调节为5mg/ml，从而得到2个溶液，测定该溶液在660nm处的吸光度时，分别为0.036(提取物A)、0.030(提取物B)(作为空白，使用甲醇)。且，上述提取物中的任一个都包含实施例1所记载的11种甲氧基黄酮的全部。
[实施例7]
(用于NOX抑制活性测定的样品制备：黑姜乙醇提取物的制造)
在黑姜干燥物200g中加入50％乙醇水溶液1000mL，进行1小时加热回流提取。将所得到的液体冷却后进行抽滤，分为残渣与提取液。再次在残渣中加入50％乙醇水溶液1000mL，进行1小时加热回流提取并过滤，与先前所得到的提取液合并。冷却至室温后，进行减压浓缩后冷冻干燥，得到49g黑姜乙醇提取物-1(收率24.5％)。以确认黑姜的批次间引起的差别为目的，用与上述同样的方法进行操作时，得到23g黑姜乙醇提取物-2(收率15.2％)。接着，该提取物中的11种甲氧基黄酮总含量按照实施例2的方法进行测定时，分别为264mg/g、267mg/g。将黑姜乙醇提取物-1中的甲氧基黄酮总量用甲醇调节为5mg/ml从而得到溶液，测定该溶液在660nm处的吸光度时，为0.95(空白为甲醇)。且，上述提取物中的任一种都包含实施例1所记载的11种甲氧基黄酮的全部。
[实施例8]
(用于NOX抑制活性测定的样品制备：黑姜油脂提取物的制造)
在黑姜10g、20g、30g、40g中分别加入10倍量的乙醇，进行1小时加热回流提取。将所得到的液体冷却后进行抽滤，在该提取液中加入中链甘油三酯15mL，通过减压浓缩馏去乙醇后，以除去不溶物为目的再次进行抽滤，分别得到黑姜油脂提取物。关于所得到的4个黑姜油脂提取物，按照实施例2分析11种甲氧基黄酮的总含量时，其值分别为23.9mg/mL、46.3mg/mL、69.4mg/mL、78.1mg/mL。另外，确认了包含总甲氧基黄酮量为46.3mg/mL以上的油脂提取物，在室温放置时可确认甲氧基黄酮类的析出。且，上述提取物中的任一个都包含实施例1所记载的11种甲氧基黄酮的全部。
[实施例9]
(以NOX抑制活性为指标的黑姜提取法的对比)
根据实施例3，测定总甲氧基黄酮量22.4mg/ml的黑姜油脂提取物-1(实施例2所得到的物质)、总甲氧基黄酮量69.4mg/ml的黑姜油脂提取物-2(实施例8所得到的物质)、乙醇提取物(实施例7所得到的黑姜乙醇提取物-1及2)的NOX抑制活性(使用分化的HL-60活细胞的NOX抑制活性测定)。为了观察黑姜的批次间的活性强度的不同而对2种黑姜进行研究。另外，由于无法直接测定油脂提取物的活性，故而进行脱脂处理。具体而言，在油脂提取物0.5mL中加入相同量的正己烷0.5mL而稀释后，用0.5mL的80％甲醇水溶液进行3次甲氧基黄酮的提取。使所得到的提取液吸附于Sep-Pak PLUS C8Catrtriges(Waters公司制)，使80％甲醇3.0mL过柱从而除去油分。其后，将Sep-Pak PLUS C8Catrtriges用溶剂进行清洗，并将所得到的液体进行减压浓缩、冷冻干燥来制备评价试样。将所测定的IC50值用以下的表3表示。
以下所示的IC50值表示基于总甲氧基黄酮量的NOX抑制活性。将上述值进行对比时，任一个均显示油脂提取物的作用(低的IC50)高于乙醇提取物。由此提示像本发明这样通过油脂进行提取，能够有效地提取对NOX的抑制作用更高的甲氧基黄酮。
表3
[实施例10]
(NFκB抑制作用)
已知将巨噬细胞样的RAW264.7细胞通过LPS(脂多糖)进行刺激时，NFκB被活化，据此iNOS(诱导型NO合成酶)的表达亢进，培养液中起因于iNOS酶活性的亚硝酸积累，通过测定培养液中的亚硝酸量而能够评价NFκB活化。
RAW264.7细胞使用在含10％FBS的RPMI 1640培养液中培养的细胞。使所得到的细胞混悬于上述培养液，从而成为4×105细胞/ml，在96孔板的每孔中各分注100μl，预培养(CO2孵育箱)24hr。通过在其中每孔分别添加25μl的6μg/ml含LPS培养液(LPS来自大肠杆菌、终浓度为1μg/ml)及25μl的规定浓度的受试标品溶液，进一步培养24hr后，分别分取75μl的细胞培养液，并添加等量的Griess试剂(Fluka制)进行呈色反应，基于540nm的吸光度来测定亚硝酸的生成。受试样品的NFκB抑制活性的测定如下进行：使用使样品的DMSO溶液溶解于上述的培养液从而作为DMSO浓度成为1％以下的3倍稀释系列的溶液，测定作为刺激剂的LPS无添加/添加条件下的吸光度。将50％抑制起因于LPS刺激的亚硝酸生成的浓度即IC50值(μM)示于表4。如表4所示，式(I)的甲氧基黄酮显示优异的NFκB抑制作用。
表4
[实施例11]
(提取方法与组成的关系)
鉴于实施例9的结果，将来自黑姜的油脂提取物与亲水性溶剂提取物的组成进行对比。具体而言，按照实施例2、6以及8进行油脂提取(仅通过油脂的提取、或乙醇提取及其后进行的油脂提取)，按照实施例7进行乙醇提取。在油脂提取中，作为油脂，使用橄榄油、或橄榄油与中链脂肪酸甘油酯(在本实施例，使用中链甘油三酯，将其也表示为“MCT”)的混合物。所得到的提取物基于实施例2所述的方法通过HPLC进行分析，所得到的HPLC面积值如下所示。在以下的表中，方便起见将油脂也仅用“油脂”表示。
表5A
表5B
*表中的％表示提取油脂中所包含的MCT的含有率。
如表5A以及5B所示，油脂提取物中的NOX抑制活性、NFκB抑制活性强的甲氧基黄酮的比例，即A/(A+B)以及A’/(A’+B’)高于乙醇提取物。这样的组成的不同会影响NOX抑制活性、NFκB抑制活性。