接头药物与抗体的位点特异性缀合以及所得ADC的制作方法

本发明涉及抗体-药物缀合物(antibody-drug conjugate，ADC)，其中接头药物通过工程化半胱氨酸位点特异性地与抗体缀合；及其在治疗人实体瘤和血液学恶性肿瘤，尤其是乳腺癌、胃癌、结直肠癌、尿路上皮癌、卵巢癌、子宫癌、肺癌、间皮瘤、肝癌、胰腺癌、前列腺癌和白血病的用途。

背景技术：

抗体-药物缀合物(ADC)是新兴的一类靶向治疗剂，其具有比传统化疗更好的治疗指标。除了(单克隆)抗体(monoclonal antibody，mAb)和靶标选择之外，药物和接头一直是ADC开发的焦点。然而，最近意识到缀合物同质性的重要性。用于使药物连接(attachment)到抗体的常规方法会导致产生异质混合物，并且该混合物的一些个别组分可具有不良的体内表现。位点特异性药物连接的较新方法导致产生更同质的缀合物并且允许控制药物连接位点。这些微妙的改善可以对体内功效和/或体内安全性以及由此对治疗指标具有深远的影响。位点特异性地使药物缀合至抗体的方法由C.R.Behrens和B.Liu在mAbs，第6卷，第1期，2014，1-8页进行了全面回顾。

常规ADC通常如下产生，通过表面暴露的赖氨酸的侧链或通过链间二硫键的还原产生的游离半胱氨酸的侧链将接头药物与抗体缀合。因为抗体含有许多赖氨酸残基和半胱氨酸二硫键，所以常规缀合通常产生对分析表征和加工提出挑战的异质混合物。此外，这些混合物的各组分对于其药代动力学、功效和安全特性方面表现出不同的物理化学性质和药理，阻碍了优化该方式的合理方法。

这两种用于抗体化学修饰的常规技术用于构建具有当前FDA销售批准的两种ADC。Brentuximab vedotin(Adcetris^TM，Seattle Genetics)由通过天然半胱氨酸侧链巯基的修饰与高度细胞毒性药物单甲基澳瑞他汀E(monomethyl auristatin E，MMAE)缀合的抗CD30单克隆抗体组成。该加工包括部分还原溶剂暴露的链间二硫键(disulfide)，然后用含有马来酰亚胺的接头药物修饰所得的巯基。对于brentuximab vedotin，用mc-vc-PAB-MMAE修饰巯基，其将马来酰亚胺基团(mc，maleimidocaproyl，马来酰亚胺基己酰)和细胞毒性药物(MMAE)之间的组织蛋白酶B蛋白酶切割位点(vc，缬氨酸-瓜氨酸)和自毁(self-immolative)接头(PAB，para-aminobenzyloxycarbonyl，对氨基苄氧基羰基)合并。半胱氨酸连接策略最多产生每个还原的二硫键两个药物。大多数人IgG分子具有四个溶剂暴露的二硫键，因此每个抗体可能有0至8个药物。每个抗体的药物的确切数目通过二硫键还原的程度和在随后的缀合反应中使用的接头药物的摩尔当量数来确定。所有四个二硫键的完全还原给出具有每个抗体八个药物的均质构建体，而部分还原通常导致产生每个抗体具有零、二、四、六或八个药物的异质混合物。Brentuximab vedotin具有平均每个抗体约4个药物。

目前FDA批准的另一个ADC是ado-曲妥珠单抗emtansine(T-DM1，Kadcyla^TM，Roche/Genentech)，其通过将抗HER2单克隆抗体曲妥珠单抗通过赖氨酸侧链胺的修饰与细胞毒性药物美登素偶联而构建。将该形式的美登素(DM1)修饰成包含可以连接到马来酰亚胺接头的巯基。在一端具有马来酰亚胺并且在另一端具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯的双功能接头(SMCC，4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯)与赖氨酸伯胺侧链反应以形成稳定的酰胺键。然后通过缀合到双功能接头的马来酰亚胺末端将修饰的美登素(DM1)与抗体连接。与brentuximab vedotin中使用的接头相反，该接头不具有(蛋白酶)切割位点，因此需要ADC的抗体部分的溶酶体降解以释放活性DM1-接头-赖氨酸代谢物。该连接方法产生具有每个抗体平均3.5个药物的缀合物的异质混合物。与上述半胱氨酸方法相比，该策略给出更多的异质混合物，因为发现修饰了20至40个赖氨酸残基，而使用天然半胱氨酸修饰方法仅修饰了最多8个不同的半胱氨酸残基。

最近，据报道，可通过应用位点特异性缀合技术来改进ADC的药理学谱，该技术利用工程化并入抗体，然后与接头药物缀合的表面暴露的半胱氨酸残基，产生具有确定的药物抗体比(drug-to-antibody ratio，DAR)的位点特异性缀合的ADC。相对于使用常规赖氨酸和半胱氨酸缀合方法产生的异质混合物，位点特异性缀合的ADC大体上证明了至少相当的体内效力、改善的PK和扩大的治疗窗口。

在Genentech通过使用定点诱变在显示高巯基反应性的位置引入半胱氨酸残基开发了第一种位点特异性缀合方法，如在WO2006/034488中所详述的。蛋白质修饰中的这种常见实践在抗体中更复杂，因为已经存在多种天然半胱氨酸残基。在不合适的位置引入额外的半胱氨酸残基可能导致链间二硫键的不当形成，并因此导致抗体的不正确折叠。在突变的抗体中合适位置的工程化半胱氨酸残基通常被其它巯基如半胱氨酸或谷胱甘肽加帽，形成二硫键。

通过减少天然链间的和突变体二硫键两者来实现突变残基与药物连接，然后使用温和氧化剂如CuSO₄或脱氢抗坏血酸将天然链间半胱氨酸重新氧化，随后使释放的突变体半胱氨酸与接头药物标准缀合。在最佳条件下，每个抗体将连接两个药物(如果一个半胱氨酸被改造到mAb的重链或轻链中)。工程化半胱氨酸的方法证明适合于开发位点特异性ADC SGN-CD33A(Seattle Genetics)，其最近进入了I期剂量递增临床研究，作为急性骨髓性白血病(AML)的治疗；以及与包括阿糖胞苷和柔红霉素的标准护理化疗联合的Ib期临床试验。该ADC包含可切割的二肽接头(即缬氨酸-丙氨酸)和DNA交联剂，吡咯并苯并二氮杂(PBD)二聚体作为药物连接到IgG1 mAb h2H12的Fc部分中的重链位置S239C(DAR 1.9；Sutherland等，Blood 2013；122(8)：1455-1463)。

尽管在WO2006/034488中明确了取代不涉及抗原结合相互作用且远离现有链间二硫键的表面可及的缬氨酸、丙氨酸和丝氨酸残基以获得具有高巯基反应性的工程化半胱氨酸残基，但来自Novartis的WO2014/124316尤其关注于在抗体重链和轻链的恒定区中表面可及位点的鉴定，在该位点取代半胱氨酸残基使得有效负载(payload)能够有效缀合并提供具有高稳定性的缀合物。

除了工程化半胱氨酸的缀合策略之外，已经开发了用于药物的位点特异性连接的其它方法。辉瑞证明了一种使用微生物转谷氨酰胺酶将含胺药物偶联到抗体上的工程化谷氨酰胺进行缀合的新技术。转谷氨酰胺酶是催化谷氨酰胺侧链的酰基与赖氨酸侧链的伯胺之间的酰胺键形成的酶。

除了酶促缀合之外，正交化学缀合也已经用于使用非天然氨基酸位点特异性修饰许多种蛋白质(尤其是来自Ambrx和Sutro Biopharma的技术)。特别地，选择对乙酰基苯基-丙氨酸和对叠氮甲基-L-苯丙氨酸作为非天然氨基酸，因为它们分别含有酮和叠氮化物官能团，其未在20种天然氨基酸侧链的任何一个中发现。这允许酮cq.叠氮基团的特异性修饰而不受其它氨基酸的干扰。该方法提供了构建具有每个抗体(每一种这样的非天然氨基酸)最多两个药物的ADC的另外的途径。

在迄今为止公开的所有现有技术方法中，以改善均质性和药代动力学性质为目的，重点在于在表面/溶剂暴露位置、在显示高巯基反应性的位置和在特异性地在单克隆抗体的恒定区中的位置位点特异性地缀合接头药物。即使上述常规的赖氨酸和半胱氨酸缀合方法已导致了FDA批准的抗体-药物缀合物，并且它们被用于构建目前处于临床前和临床试验中的大量ADC中的大多数，但仍然需要新的缀合策略，目的是(进一步)改善ADC的物理化学、药代动力学、药理学和/或毒理学性质，以获得具有可接受的抗原结合性质、体内功效、治疗指标和/或稳定性的ADC。

发明简述

本发明涉及抗体-药物缀合物(ADC)，其中接头药物通过工程化半胱氨酸位点特异性地在抗体的一个或更多个特异性位置与所述抗体缀合；及其用于治疗人实体瘤和血液学恶性肿瘤，尤其是乳腺癌、胃癌、结直肠癌、尿路上皮癌、卵巢癌、子宫癌、肺癌、间皮瘤、肝癌、胰腺癌、前列腺癌和白血病的用途。

附图简述

图1A.鉴定在抗体的Fab部分中合适的接头药物缀合位置

图1B.将倍癌霉素(duocarmycin)接头药物vc-seco-DUBA在抗体的Fab腔中对接(docking)(多个vc-seco-DUBA对接的叠加)

图1C.鉴定在抗体的Fc部分中合适的接头药物缀合位置

图1D.将倍癌霉素接头药物vc-seco-DUBA在抗体的Fc腔中对接(多个vc-seco-DUBA对接的叠加)

图2A.工程化半胱氨酸抗PSMA(VH S41C)ADC(SYD1091)相对于载剂对照、比较物(comparator)工程化半胱氨酸抗PSMA(CH T120C)ADC(SYD1035)和未工程化抗PSMA(野生型)wt ADC(SYD998)的体内功效，每种2mg/kg。

图2B.工程化半胱氨酸抗PSMA(VH S41C)ADC(SYD1091)相对于载剂对照、比较物工程化半胱氨酸抗PSMA(CH T120C)ADC(SYD1035)和未工程化抗PSMA wt ADC(SYD998)的体内功效，每种10mg/kg。

图3.工程化半胱氨酸抗PSMA(VH S41C)ADC(SYD1091)相对于载剂对照、比较物工程化半胱氨酸抗PSMA(CH T120C)ADC(SYD1035)和未经改造的抗PSMA wt ADC(SYD998)对体重的影响，每种10mg/kg。

图4A.工程化半胱氨酸抗5T4(VH P41C)H8 ADC(H8-41C-vc-seco-DUBA)相对于载剂对照和未经改造的抗5T4 wt H8 ADC(HS-vc-seco-DUBA)的体内功效，每种3mg/kg。

图4B.工程化半胱氨酸抗5T4(VH P41C)H8 ADC(H8-41C-vc-seco-DUBA)相对于载剂对照和未工程化抗5T4 wt H8 ADC(HS-vc-seco-DUBA)的体内功效，每种10mg/kg。

发明详述

抗体-药物缀合物(ADC)作为一类新的抗癌治疗剂出现，其将小分子治疗剂的功效与抗体的靶向能力组合。通过将这两种组分组合成单个新的分子整体，可以将高度细胞毒性的小分子药物递送至癌性靶组织，从而增强功效，同时降低小分子的潜在的全身毒性副作用。

抗体已经与多种细胞毒性药物缀合，包括结合DNA的小分子(例如蒽环类)、烷基化或交联DNA的小分子(例如分别为倍癌霉素或吡咯并苯并二氮杂二聚体)、引起DNA链断裂的小分子(例如卡里奇霉素(calicheamicins))或破坏微管的小分子(例如美登木素生物碱和澳瑞他汀)。

本发明涉及抗体-药物缀合物(ADC)化合物，其中接头药物通过工程化半胱氨酸在抗体的选自以下的一个或更多个位置处位点特异性地与所述抗体缀合：重链40、41、89(Kabat编号)、152、153、155、171、247、297、339、375和376(Eu编号)；以及轻链40、41(Kabat编号)、165和168(Eu编号)。

在一个实施方案中，本发明涉及抗体-药物缀合物(ADC)化合物，其中接头药物通过工程化半胱氨酸在抗体的选自以下的一个或更多个位置处位点特异性地与所述抗体缀合：重链40、41、89、152、153、155、171、247、297、339和375，以及轻链40、41和165。

在一个特别优选的实施方案中，本发明涉及抗体-药物缀合物(ADC)化合物，其中接头药物通过工程化半胱氨酸在抗体的选自以下的一个或更多个位置处位点特异性地与所述抗体缀合：重链40、41和89(根据Kabat编号)以及轻链40和41(根据Kabat编号)。

因为关于位点特异性ADC的早期工作的焦点是找到显示与接头药物具有良好反应性并且同时在抗体之间形成二硫键(导致聚集)或干扰抗体结构(所谓的二硫桥打乱(shuffling))的低风险的缀合位置，所以尚未评估对与缀合位点有关的缀合物疏水性的作用。此外，焦点主要是在抗体的恒定区中找到合适的位点，因为抗体可变区的修饰通常被认为与部分或完全丧失抗原结合的高风险相关。

然而，本发明人已经聚焦于影响位点特异性ADC的疏水性特征。

一种使用YASARA软件包的计算机方法(www.yasara.org，见：Krieger等Proteins 2009；77 Suppl 9：114-122)被用于鉴定接头药物与抗体的强相互作用的位点。合适的位置表现为疏水表面的增加最小。在如此鉴定的相互作用位点附近鉴定了适于转化为半胱氨酸的残基(即具有足够的可及性)。在该方法中，对抗体的恒定区没有限制，如果不在抗原结合位点附近，也考虑可变区氨基酸。Fab部分的可变结构域中的位置证明是优选的。

如在YASARA中实施的，使用常用的VINA算法(Trott O和Olson AJ.J.Comput.Chem.2010；31：455-461)模拟接头药物进入到多种抗体的Fab和Fc模型中的对接。使用的抗体Fab和Fc模型为从X射线结构或通过使用YASARA的同源性建模获得。

倍癌霉素型接头药物，例如vc-seco-DUBA(即，SYD980；其ADC化合物描述于式II中)显示出对存在于所有抗体结构的腔中的结合具有强烈的偏好(分别参见图1B和1D的抗体的Fab和Fc部分)。在这些腔中和紧邻这些腔中鉴定了用于接头药物连接的多个合适的缀合位置，即在这些位置具有工程化半胱氨酸的良好可及性(分别参见图1A和1C的抗体的Fab和Fc部分)。

在本发明的上下文中，Kabat编号用于指示重链(HC)和轻链(LC)可变区中工程化半胱氨酸的氨基酸位置，并且Eu编号用于指示抗体重链恒定区和轻链恒定区中的位置。鉴于抗体可变区的序列可变性，由半胱氨酸取代的确切氨基酸对于不同抗体可以是不同的。对于大多数抗体，特别是IgG抗体，在重链可变区(VH)中，通常在40位具有A或S，在41位具有P且在89位具有V，并且在轻链可变区(VL)中，通常在40位具有P，在41位具有G。在重链恒定区(CH1、CH2和CH3)中，通常在152位具有E，在153位具有P，在155位具有T，在171位具有P，在247位具有P，在297位具有N，在339位具有A，在375位具有S，且在376位具有D，并且在轻链κ恒定区(CL)中，通常在165位具有E且在168位具有S。在五个λ轻链同种型恒定区(CL)中，通常在165位具有S且在168位具有S。

表述“Kabat编号”是指用于汇编抗体的重链可变结构域或轻链可变结构域的编号系统，其描述于Kabat，E.A.等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991)。使用该编号系统，实际的线性氨基酸序列可以包含较少或另外的氨基酸，其对应于可变结构域的框架区(framework region，FR)或互补决定区(complementary determining region，CDR)的缩短或插入。可通过在抗体序列与“标准”Kabat编号序列的同源性区域比对，对于给定抗体确定残基的Kabat编号。

表述“Eu编号”是指如Kabat，E.A.等Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.，NIH公开no.91-3242，662，680，689页(1991)中的Eu索引。“如在Kabat中的Eu索引”是指人IgG1 Eu抗体的残基编号(Edelman，GM.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，63，78-85(1969))。

重链位置40、41和89位于抗体的可变区，位置152、153、155、171、247、297、339、375和376位于抗体的恒定区。轻链位置40和41位于抗体的可变区，位置165和168位于抗体的恒定区。

重链位置40、41、89、152、153、155和171以及轻链位置40、41、165和168位于抗体的Fab部分，并且重链位置247、297、339、375和376位于抗体的Fc部分。

根据本发明，术语“工程化半胱氨酸”是指用半胱氨酸替代抗体重链或轻链中的非半胱氨酸氨基酸。如本领域技术人员已知的，这可以在氨基酸水平或在DNA水平上进行，例如，通过使用定点诱变进行。

本发明人出人意料地发现，与其中接头药物通过抗体的天然链间二硫键缀合的ADC相比，以及此外，与其中接头药物在现有技术公开的位置而非在本专利申请中具体要求保护的位置缀合的工程化半胱氨酸ADC相比，本发明的位点特异性缀合的ADC化合物表现出改善的物理化学、药理学和/或药代动力学性质。根据本发明的ADC化合物具有类似于裸抗体的结合特性、良好的体内功效、提高的治疗指标和/或改善的稳定性。尤其是，相比于在不同位置位点特异性缀合的ADC通常疏水性较小，发现该ADC化合物对组织蛋白酶B切割较不敏感，因此也可能对肿瘤块(肿瘤微环境)中的其它细胞内或细胞外酶/蛋白酶不敏感，但仍显示类似的体外细胞毒性。出乎意料地，与在其它位置位点特异性缀合的ADC相比，根据本发明的ADC在肿瘤异种移植动物模型中显示改善的体内功效。

不希望被任何理论所束缚，本发明人发现，当接头药物在如本文要求保护的抗体的特定位置处缀合时，所述接头药物适合于由抗体的CH1、VH、VL和CL结构域形成的Fab腔或由抗体的两个CH2和两个CH3结构域形成的Fc腔。在IgG1抗体中，Fc腔的顶部由连接于重链位置N297的糖苷/碳水化合物形成。结果，接头药物(其通常比抗体更疏水)与抗体周围的亲水性水性环境隔离，并且此种ADC与其中接头药物通过抗体的天然二硫键缀合的ADC相比疏水性较小，并且与其中接头药物在目前未要求保护的不同位置位点特异性缀合和其中接头药物被迫暴露到抗体外部(即，指向远离抗体的方向)的ADC相比疏水性小得多。

在一个特定实施方案中，本发明涉及抗体-药物缀合物(ADC)化合物，其中接头药物通过工程化半胱氨酸在抗体的选自以下的一个或多个位置处位点特异性地与所述抗体缀合：重链40、41、152、153、247、339和375，以及轻链40、41和165。

在另一个实施方案中，本发明涉及抗体-药物缀合物(ADC)化合物，其中接头药物通过工程化半胱氨酸在抗体的选自以下的一个或多个位置处位点特异性地与所述抗体缀合：重链40、41、89、247、297和376，与轻链40和41。

在一个实施方案中，本发明涉及抗体-药物缀合物(ADC)化合物，其中接头药物通过工程化半胱氨酸在抗体的选自以下的一个或多个位置处位点特异性地与所述抗体缀合：所述抗体Fab部分中的重链40、41、89、152、153、155和171，以及轻链40、41、165和168。

在另一个实施方案中，本发明涉及抗体-药物缀合物(ADC)化合物，其中接头药物通过工程化半胱氨酸在抗体的选自以下的一个或多个位置处位点特异性地与所述抗体缀合：所述抗体Fab部分中的重链40、41、152和153，以及轻链40、41和165。

一般会避免修饰抗体的可变部分，因为其可导致抗原结合性质的部分或完全丧失。然而，与一般的预期相反，发现抗体重链和轻链两者的框架区中的特定残基都适合缀合，并且在接头药物缀合后不会导致(显著)抗原结合的减少。因此，在一个特别优选的实施方案中，本发明涉及抗体-药物缀合物(ADC)化合物，其中所述工程化半胱氨酸在所述抗体选自以下的一个或更多个位置处：所述抗体Fab部分中的重链40、41和89，以及轻链40和41。优选地，所述工程化半胱氨酸在重链位置40或41和/或轻链位置40或41，更优选在重链位置41和/或轻链位置40或41，最优选在重链位置41。从文献中已知肿瘤微环境中的肿瘤相关蛋白酶可以部分切割在铰链区下的Fc恒定结构域，所以Fab部分中的缀合优于Fc部分中的缀合。Fc恒定结构域的切割将导致Fc缀合的接头药物的丧失，这继而可导致体内ADC的活性降低(Fan等，Breast Cancer Res.2012；14：R116和Brezsky等PNAS 2009；106：17864-17869)。此外，与Fab部分中的这些位置缀合还使得能够使用抗原结合片段。

在一个具体的实施方案中，上述优选实施方案的抗体-药物缀合物(ADC)化合物还可以在选自重链152、153、155、171、339和375以及轻链165和168的抗体的一个或更多个位置处包含另外的工程化半胱氨酸。优选地，所述其他工程化半胱氨酸在所述抗体的Fc部分中的重链位置375。

根据本发明，可以通过使用常规分子克隆技术将一个或更多个半胱氨酸残基改造到抗体中；或这种携带半胱氨酸突变的抗体的重链或轻链结构域可以使用已知的(肽或DNA)合成设备和方法来合成。

根据本发明，ADC领域中已知的任何接头药物可用于与抗体位点特异性缀合，条件是其具有可与工程化半胱氨酸巯基反应的化学基团(通常为马来酰亚胺或卤代乙酰基)。合适的接头药物可包含倍癌霉素、卡里奇霉素、吡咯并苯并二氮杂(PBD)二聚体、美登木素生物碱或澳瑞他汀衍生物作为细胞毒性药物。根据本发明可以使用可切割或不可切割的接头。美登木素生物碱药物的合适实例包括DM1和DM4。澳瑞他汀药物的合适实例包括MMAE和MMAF。

这些缩写是技术人员公知的。本领域技术人员已知的合适的接头药物的实例包括mc-vc-PAB-MMAE(也缩写为mc-vc-MMAE和vc-MMAE)、mc-MMAF和mc-vc-MMAF。优选地，所使用的接头是可切割接头，例如缬氨酸-瓜氨酸(vc)或缬氨酸-丙氨酸(va)。

vc-MMAE ADC和mc-MMAF ADC的通用分子结构如下所示。

连接于mAb的vc-MMAE的分子结构

连接于mAb的mc-MMAF的分子结构

在一个实施方案中，本发明涉及ADC化合物，其中所述接头药物包含倍癌霉素衍生物。

倍癌霉素首先从链霉菌属(Streptomyces)物种的培养液中分离，是抗肿瘤抗生素家族的成员，其包括倍癌霉素A、倍癌霉素SA和CC-1065。据称这些极有效的药剂的生物活性来源于其在小沟区中腺嘌呤的N3位置处序列选择性烷基化DNA的能力，这启动结局是凋亡细胞死亡机制的事件级联。

WO2011/133039公开了一系列包含CC-1065的倍癌霉素衍生物的接头药物。根据本发明使用的合适的接头-倍癌霉素衍生物公开于182至197页。许多这些接头药物的化学合成描述于WO2011/133039的实施例1至12中。

在一个实施方案中，本发明涉及式(I)的化合物

其中

n为0至3，优选0至1，

m表示1至6的平均DAR，优选1至4，

R¹选自

y为1至16，且

R²选自

在本说明书所示的结构式中，n代表0至3的整数，而m代表1至6的平均药物-抗体比(drug-to-antibody ratio，DAR)。如本领域所公知的，DAR和药物负载分布可以通过例如使用疏水相互作用色谱(hydrophobic interaction chromatography，HIC)或反相高效液相色谱(reversed phase high-performance liquid chromatography，RP-HPLC)来测定。HIC特别适合于测定平均DAR。

根据本发明的式(I)化合物可以根据本领域技术人员公知的方法和程序获得。用于位点特异性缀合接头药物的合适方法可以例如在WO2005/084390的实施例7和8中找到，其描述了具有接头药物vc-MMAE之抗体的(部分)负载的完全还原策略；在WO2006/034488的实施例11和12中，其描述了含有美登素(DM1)的接头药物的位点特异性缀合，以及在Doronina等Bioconjugate Chem.17(2006)：114-124中，其描述了与mc-MMAF的缀合。

与本发明的两个或更多个工程化半胱氨酸位点的缀合允许制备包含具有更高DAR，特别是DAR 4的疏水药物类的ADC，而不会获得太多的聚集体。

根据本发明的一个特定实施方案，可以在最佳反应条件下将一个或两个工程化半胱氨酸并入抗体的重链和/或轻链中，分别得到DAR为2或4的ADC化合物。当引入一个工程化半胱氨酸时，其可以位于抗体的Fab部分中或Fc部分中。优选将所述半胱氨酸在以下位置处引入抗体的Fab部分：HC 40、41、89、152或153或者LC 40、41或165，优选HC 40、41或89或者LC 40、41或165，更优选HC 40或41或者LC 40或41，甚至更优选HC 41或者LC 40或41、最优选HC 41。当引入两个工程化半胱氨酸时，这两个半胱氨酸可以都位于抗体的Fab部分中或Fc部分中，或者优选地，一个可以在Fab部分中，优选HC 40、41、152或153或者LC 40、41或165，更优选HC 40或41或者LC 40或41，甚至更优选HC 41或者LC 40或41，最优选HC 41，并且另一个可以在抗体的Fc部分中，优选HC 247、297、339或375，更优选HC 339或375，最优选HC 375。当将两个工程化半胱氨酸引入抗体的Fab部分时，可以将一个半胱氨酸残基引入重链中，而将另一个半胱氨酸引入抗体的轻链中，例如，HC40或41以及LC 40或41。此外，当两个工程化半胱氨酸引入抗体的Fab部分时，可以在本发明中鉴定的特定位置之一引入一个半胱氨酸残基，例如，HC 40或41或者LC 40或41，并且另一个可以位于表面暴露的(即，本文中未要求保护的)工程化半胱氨酸位置，导致更高的DAR和仍然可接受的疏水性。

在一个具体的实施方案中，本发明涉及如上文所公开的式(I)的化合物，其中n为0至1，m表示1至6，优选1至4，更优选1至2，最优选1.5至2的平均DAR，

R¹选自

y为1至16，优选1至4，且

R²选自

在一个具体的实施方案中，本发明涉及如上文所公开的结构式(I)的化合物，其中n为0至1，m表示1.5至2的平均DAR，R¹为

y为1至4，且R²选自

在一个具体的优选实施方案中，本发明涉及式(II)的化合物

根据本发明，任何抗体-特别是已知具有治疗活性的任何抗体或ADC领域中已知的任何抗体-或其任何抗原结合片段可用于接头药物在本文要求保护的特异性抗体位置处的位点特异性缀合。所述抗体可以是IgA、IgD、IgE、IgG或IgM抗体。所述抗体可以具有κ(kappa)轻链或λ(lambda)轻链。所述IgG抗体可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。优选地，抗体结合肿瘤细胞的细胞膜内或细胞膜上(例如，在细胞表面上)表达的(抗原)靶标，更优选地，抗体在与(抗原)靶标结合后被细胞内化，之后毒素在细胞内释放。优选地，抗体是IgG抗体，更优选IgG1抗体，最优选具有κ轻链的IgG1抗体。优选地，IgG抗体携带连接在抗体重链的N297处的天然糖苷/碳水化合物部分。

适合的抗体包括抗膜联蛋白A1抗体、抗CD19抗体、抗CD22抗体、抗CD30抗体、抗CD33抗体、抗CD37抗体、抗CD38抗体、抗CD44抗体、抗CD47抗体、抗CD56抗体、抗CD70抗体、抗CD74抗体、抗CD79抗体、抗CD115抗体、抗CD123抗体、抗CD138抗体、抗CD203c抗体、抗CD303抗体、抗CEACAM抗体、抗CLL-1抗体、抗c-MET(或抗HGFR)抗体、抗Cripto抗体、抗DLL3抗体、抗EGFR抗体、抗EPCAM抗体、抗EphA2抗体、抗EDhB3抗体、抗ETBR抗体、抗FcRL5抗体、抗FOLR1抗体、抗GCC抗体、抗GPNMB抗体、抗Her2抗体、抗HMW-MAA抗体、抗整合素抗体、抗Lewis A类碳水化合物抗体、抗Lewis Y抗体、抗LIV1抗体、抗间皮素抗体、抗MN抗体、抗MUC1抗体、抗MUC16抗体、抗NaPi2b抗体、抗柄蛋白-4抗体、抗PSMA抗体、抗SIRPα抗体、抗SLC44A4抗体、抗STEAP-1抗体、抗5T4(或抗TPBG、滋养层糖蛋白)抗体、抗Tag72抗体、抗TF(或抗组织因子)抗体、抗TROP2抗体和抗VLA抗体。

优选地，所述抗体为抗膜联蛋白A1抗体、抗CD115抗体、抗CD123抗体、抗CLL-1抗体、抗c-MET抗体、抗MUC1抗体、抗PSMA抗体、抗5T4抗体或抗TF抗体。更优选地，所述抗体为抗PSMA抗体或抗5T4抗体。

根据本发明使用的抗体优选是单克隆抗体(mAb)，并且可以是嵌合、人源化或人mAb。更优选地，根据本发明，使用人源化或人mAb，甚至更优选人源化或人IgG抗体，最优选人源化或人IgG1 mAb。优选地，所述抗体具有κ(kappa)轻链，即人源化或人IgG1-κ抗体。

在人源化抗体中，可变区中的抗原结合CDR来源于来自非人物种(通常为小鼠，大鼠或兔)的抗体。这些非人CDR置于人的可变区框架(FR1，FR2，FR3和FR4)内，并与人恒定区组合。与人抗体一样，这些人源化抗体可根据Kabat编号系统编号。本发明特别涉及这样的ADC化合物，其中所述工程化半胱氨酸在选自人源化抗体人框架中的VH 40、VH 41、VH 89、VL 40或VL 41的位置处(即VH 40、VH 41、VL 40和VL 41在FR2的中间，VH98在FR3中)，更特别地在VH 40、VH 41、VL 40或VL 41处，甚至更特别地在VH 41、VL 40或VL 41处，尤其在VH 41处。

根据本发明，框架区中的这些特定残基都适合于接头药物的缀合，并且在接头药物缀合后不会导致抗体的抗原结合特性的显着降低。此外，这些位点不仅适用于抗体，而且适用于其任何抗原结合片段。

在一个特别的实施方案中，本发明涉及如上文所述的ADC化合物，其中所述抗体为抗膜联蛋白A1抗体、抗CD115抗体、抗CD123抗体、抗CLL-1抗体、抗c-MET抗体、抗MUC1抗体、抗PSMA抗体、抗5T4抗体或抗TF抗体，且所述接头药物包含倍癌霉素衍生物，优选为根据式(I)或(II)的ADC化合物。

在另一个具体的实施方案中，本发明涉及如上文所述的ADC化合物，其中所述抗体为抗PSMA(单克隆)抗体或抗5T4(单克隆)抗体，且所述接头药物包含倍癌霉素衍生物，优选为根据式(I)或(II)的ADC化合物。

在一个优选的实施方案中，本发明涉及如上文所述的ADC化合物，其中所述接头药物包含倍癌霉素衍生物且缀合至抗PSMA(单克隆)抗体或抗5T4(单克隆)抗体的重链可变区的41位处，最优选为根据式(II)的ADC化合物。合适的抗PSMA抗体描述于WO98/03873(例如实施例12)、WO02/098897(例如图1至2)、WO2007/002222(例如表1)和WO2011/069019(例如图2)。合适的抗5T4抗体包括WO2008/031653中描述的H8和WO2007/106744中描述的A1和A3抗体，以及与这些已知抗体结合相同表位的任何抗体。

在一个更优选的实施方案中，抗PSMA抗体的重链包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列，并且抗PSMA抗体的轻链包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列。更优选地，抗PSMA抗体的重链包含SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的氨基酸序列，并且抗PSMA抗体的轻链包含SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的氨基酸序列。

在一个特别优选的实施方案中，本发明涉及式(II)的ADC化合物，其中所述抗体是抗PSMA抗体，所述抗PSMA抗体的重链包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列，并且所述抗PSMA抗体的轻链包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列。更优选地，所述抗PSMA抗体的重链包含SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的氨基酸序列，并且所述抗PSMA抗体的轻链包含SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的氨基酸序列。

在另一个更优选的实施方案中，抗5T4抗体的重链包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列，并且抗5T4抗体的轻链包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列。更优选地，抗5T4抗体的重链包含SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9的氨基酸序列，并且抗5T4抗体的轻链包含SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：6的氨基酸序列。

在一个特别优选的实施方案中，本发明涉及式(II)的ADC化合物，其中抗体是抗5T4抗体，所述抗5T4抗体的重链包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列，并且所述抗5T4抗体的轻链包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列。更优选地，所述抗5T4抗体的重链包含SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9的氨基酸序列，并且所述抗5T4抗体的轻链包含SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：6的氨基酸序列。

本发明还涉及如上所述的ADC化合物，其用作药物。

在一个实施方案中，本发明涉及如上所述的ADC化合物，其用于治疗人实体瘤和血液学恶性肿瘤。

在另一个实施方案中，本发明涉及如上文所述的ADC化合物，其用于治疗选自以下的人实体瘤：乳腺癌、胃癌、结直肠癌、尿路上皮癌(例如膀胱癌)、卵巢癌、子宫癌、肺癌(特别是非小细胞肺癌和小细胞肺癌)、间皮瘤(特别是恶性胸膜间皮瘤)、肝癌、胰腺癌和前列腺癌。

在一个优选的实施方案中，本发明涉及如上所述的ADC化合物，特别是包含抗PSMA(单克隆)抗体和倍癌霉素衍生物接头药物的化合物，其用于治疗前列腺癌。

在另一个优选的实施方案中，本发明涉及如上所述的ADC化合物，特别是包含抗5T4(单克隆)抗体和倍癌霉素衍生物接头药物的化合物，其用于治疗选自乳腺癌、胃癌、结直肠癌、卵巢癌、肺癌(特别是非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC))和恶性胸膜间皮瘤的人实体瘤。

在另一个实施方案中，本发明涉及如上所述的ADC化合物，其用于治疗人血液学恶性肿瘤，特别是白血病，其选自急性成淋巴细胞白血病和急性骨髓性白血病(分别为ALL和AML)。

本发明还涉及包含如上所述的ADC化合物和一种或更多种可药用赋形剂的药物组合物。治疗性蛋白质的典型药物制剂如单克隆抗体和(单克隆)抗体-药物缀合物采用需要在静脉内输注之前(水性)溶解(即重构)的冻干饼(冻干粉)的形式，或在使用前需要解冻的冷冻(水性)溶液形式。

通常，药物组合物以冻干饼的形式提供。根据本发明(冷冻干燥前)包含在药物组合物中的合适的可药用赋形剂包括缓冲溶液(例如在水中的柠檬酸盐、组氨酸或含琥珀酸盐)、冻干保护剂(例如蔗糖、海藻糖)、张力调节剂(例如氯化钠)、表面活性剂(例如聚山梨酯)和填充剂(例如甘露醇、甘氨酸)。针对其在冷冻干燥过程中以及储存期间防止蛋白质变性的能力选择用于冷冻干燥的蛋白质制剂的赋形剂。作为实例，在以用于注射的抑菌或无菌水(BWFI或SWFI)重构后Kadcyla^TM(Roche)的无菌冻干粉末一次性制剂含有20mg/mL ado-曲妥珠单抗emtansine、0.02％w/v聚山梨酯20、10mM琥珀酸钠和6％w/v蔗糖，其pH为5.0。

本发明还涉及如上所述的化合物或药物组合物用于治疗如上所述的人实体瘤和血液学恶性肿瘤的用途。

本发明还涉及如上所述的化合物或药物组合物以及治疗性抗体和/或化疗剂顺序或同时施用的组合用于治疗如上所述的人实体瘤和血液学恶性肿瘤的用途。

在本发明的一个实施方案中，治疗性抗体是阿德木单抗(adecatumumab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、amatuximab、贝伐单抗(bevacizumab)、西妥昔单抗(cetuximab)、地舒单抗(denosumab)、埃达珠单抗(etaracizumab)、farletuzumab、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、labetuzumab、mapatumumab、明瑞莫单抗(minretumomab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、nivolumab、oregovomab、帕尼单抗(panitumumab)、pemtumomab、帕妥珠单抗(pertuzumab)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、西罗珠单抗(sibrotuzumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)或volociximab，且化疗剂是i)烷基化剂，特别是氮芥类，例如氮芥、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺和美法仑，亚硝基脲类，例如链脲霉素、卡莫司汀和洛莫司汀，烷基磺酸盐类，如白消安、三嗪类，如达卡巴嗪和替莫唑胺，乙烯亚胺类如噻替派和六甲蜜胺，或铂药物如顺铂、卡铂和奥沙利铂，ii)抗代谢物，特别是5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、卡培他滨、阿糖胞苷、氟尿苷、氟达拉滨、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤或培美曲塞(pemetrexed)，iii)抗肿瘤抗生素，特别是柔红霉素、多柔比星、表柔比星、伊达比星、放线菌素D、博莱霉素、丝裂霉素C或米托蒽醌，iv)拓扑异构酶抑制剂，特别是拓扑异构酶I抑制剂，例如拓扑替康和伊立替康，或拓扑异构酶II抑制剂，如依托泊苷、替尼泊苷和米托蒽醌，v)有丝分裂抑制剂，特别是紫杉烷类如紫杉醇、卡巴他赛(cabazitaxel)和多西他赛(docetaxel)，埃坡霉素类(epothilones)如伊沙匹隆(ixabepilone)，长春花生物碱类如长春碱、长春新碱和长春瑞滨、或雌莫司汀，vi)信号传导级联抑制剂，特别是mTOR(雷帕霉素的哺乳动物靶标)抑制剂如坦罗莫司和依维莫司，或酪氨酸激酶抑制剂如吉非替尼、厄洛替尼、伊马替尼、帕唑帕尼、色瑞替尼(ceritinib)、克唑替尼(crizotinib)、拉帕替尼(lapatinib)和阿法替尼(afatinib)，vii)皮质类固醇，特别是泼尼松龙、甲基泼尼松龙或地塞米松，viii)激素治疗剂，特别是雄激素受体调节剂如比卡鲁胺(bicalutamide)、恩杂鲁胺(enzalutamide)和醋酸阿比特龙，抗雌激素如他莫昔芬，或芳香酶抑制剂或类固醇修饰剂如阿那曲唑、来曲唑、氟维司群(fulvestrant)和依西美坦(exemestane)，ix)PARP抑制剂，特别是奥拉帕尼(olaparib)，或x)另一种化疗药物，特别是L-天冬酰胺酶或硼替佐米。本领域技术人员在选择用于治疗如上所述的人实体瘤和血液学恶性肿瘤的合适的联合疗法中没有困难。

在本发明的另一个实施方案中，特别是在包含倍癌霉素衍生物接头药物的抗PSMA ADC化合物的情况下，治疗性抗体是贝伐单抗、地舒单抗、帕妥珠单抗或曲妥珠单抗，并且化疗剂是拓扑异构酶II抑制剂，特别是米托蒽醌；有丝分裂抑制剂，特别是紫杉烷，更特别是卡巴他赛或多西他赛；皮质类固醇，特别是强的松龙；或激素治疗剂，特别是雄激素受体调节剂，更特别是恩杂鲁胺或醋酸阿比特龙。

在本发明的另一个实施方案中，特别是在包含倍癌霉素衍生物接头药物的抗5T4 ADC化合物的情况下，治疗性抗体是贝伐单抗、西妥昔单抗、尼伐单抗或雷莫芦单抗，并且化疗剂是烷基化剂，特别是铂药物，更特别是顺铂或卡铂；抗代谢物，特别是吉西他滨或培美曲塞；拓扑异构酶II抑制剂，特别是依托泊苷；有丝分裂抑制剂，特别是紫杉烷或长春花生物碱，更特别是紫杉醇或多西他赛或长春碱或长春瑞滨；或信号传导级联抑制剂，特别是酪氨酸激酶抑制剂，更特别是厄洛替尼、色瑞替尼、克唑替尼或阿法替尼。

在本发明的另一个实施方案中，特别是在包含倍癌霉素衍生物接头药物的抗5T4 ADC化合物的情况下，治疗性抗体是贝伐单抗，并且化疗剂是烷基化剂，特别是氮芥、铂药物或三嗪，更特别是环磷酰胺、异环磷酰胺、顺铂或替莫唑胺；抗肿瘤抗生素，特别是多柔比星；抗代谢药，特别是吉西他滨；拓扑异构酶I或II抑制剂，特别是托泊替康、伊立替康或依托泊苷；或有丝分裂抑制剂，特别是紫杉烷或长春花生物碱，更特别是紫杉醇或多西他赛，或长春新碱或长春瑞滨。

在本发明的另一个实施方案中，特别是在包含倍癌霉素衍生物接头药物的抗5T4 ADC化合物的情况下，治疗性抗体是amatuximab，并且化疗剂是烷基化剂，特别是铂药物，更特别是顺铂或卡铂；抗代谢物，特别是吉西他滨或培美曲塞；或有丝分裂抑制剂，特别是长春花生物碱，更特别是长春瑞滨。

根据本发明的化合物的治疗有效量在约0.01至约15mg/kg体重的范围内，特别是在约0.1至约10mg/kg体重的范围内，更特别地在约0.3至约10mg/kg体重的范围内。后一范围大致对应于在20至800mg ADC化合物范围内的固定剂量(flat dose)。本发明的化合物可以每周、每两周、每三周或每月施用，例如在前12周每周施用，然后每三周施用，直到疾病进展。可以根据疾病的严重程度、患者的年龄、所施用的化合物和治疗医师考虑的其它因素使用替代的治疗方案。

实施例

工程化半胱氨酸(突变体)抗体的瞬时表达

1a)cDNA的制备

通过将组合的氨基酸序列反向翻译成为在人(Homo sapiens)细胞中表达而优化的cDNA序列(SEQ ID NO：4)，从前导序列(SEQ ID NO：1)、抗PSMA抗体的重链可变区(SEQ ID NO：2，Kabat编号，在位置41具有半胱氨酸残基)和人IgG1重链恒定区(SEQ ID NO：3，连续编号，起始于丙氨酸118的Eu编号)的氨基酸序列获得重链的cDNA序列。

类似地，通过将组合的氨基酸序列反向翻译成为在人细胞中表达而优化的cDNA序列(SEQ ID NO：7)，从分泌信号(SEQ ID NO：1)、抗PSMA抗体的轻链可变区(SEQ ID NO：5，Kabat编号)和人κIg轻链恒定区(SEQ ID NO：6，连续编号)的氨基酸序列获得轻链的cDNA序列。

类似地，从前导序列(SEQ ID NO：1)、H8抗体的重链可变区(SEQ ID NO：8，连续编号，在位置41具有半胱氨酸残基)和人IgG1重链恒定区(SEQ ID NO：9，连续编号，起始于丙氨酸118的Eu编号)的氨基酸序列获得抗5T4抗体H8-HC41的重链的cDNA序列(SEQ ID NO：10)。

从前导序列(SEQ ID NO：1)、H8抗体的轻链可变区(SEQ ID NO：11，Kabat编号)和人κIg轻链恒定区(SEQ ID NO：6，连续编号)的氨基酸序列获得H8抗体轻链的cDNA序列(SEQ ID NO：12)。

从前导序列(SEQ ID NO：13)、那他珠单抗(natalizumab)的重链可变区(SEQ ID NO：14，Kabat编号)和人IgG4重链恒定区(SEQ ID NO：15，连续编号，起始于丙氨酸118的Eu编号；在225位具有脯氨酸残基，在375位具有半胱氨酸残基)的氨基酸序列获得那他珠单抗重链的cDNA序列(SEQ ID NO：16)。

从前导序列(SEQ ID NO：17)、那他珠单抗的轻链可变区(SEQ ID NO：18，Kabat编号)和人κIg轻链恒定区(SEQ ID NO：6，连续编号)的氨基酸序列获得那他珠单抗轻链的cDNA序列(SEQ ID NO：19)。

重链和轻链cDNA构建体由商业来源(Life Technologies)化学合成并从其获得。前导序列的切割对应于使用SignalP程序预测的切割位点(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)。

1b)载体构建和克隆策略

为了表达抗体链，如下构建哺乳动物表达载体0098。从pcDNA3.1(-)(Life Technologies)质粒切下CMV：BGHpA表达盒，并重新插入回相同的原始载体(仍含有完整的CMV：BGHpA表达盒)中，从而复制CMV：BGHpA表达盒，以允许从单个质粒载体表达HC和LC cDNA两者。随后，从载体pOptiVEC-TOPO(Life Technologies)分离IRES-DHFR片段，并将其插入在CMV：BGHpA表达盒之一中的CMV启动子和BGHpA多腺苷酸化序列之间。

使用SfiI限制性位点，将重链(HC)和轻链(LC)的cDNA分别连接到pMA-RQ和pMA-T质粒载体(Life Technologies)中。转移至大肠杆菌(E.coli)K12并扩增后，使用AscI和HpaI限制性位点将LC cDNA转移至哺乳动物表达载体0098。所得载体用BamHI和NheI限制酶消化，并与用相同的限制酶消化的HC cDNA片段连接。将含有HC和LC两者表达盒的最终载体(分别为CMV：HC：BGHpA和CMV：LC-BGHpA)转移至大肠杆菌NEB 5-α细胞(New England Biolabs)并在其中扩增。

使用Maxi-或Megaprep试剂盒(Qiagen)进行用于转染的最终抗体突变体表达载体的大规模生产。

2)在哺乳动物细胞中的瞬时表达

根据制造商的说明书，使用ExpiFectamine转染试剂(Life Technologies)，用根据上述1)制备的抗体突变体表达载体如下转染市售的Expi293F细胞(Life Technologies)：将75×10⁷个细胞接种在300mL Expi293表达培养基中；将300μg抗体突变体表达载体与800μl ExpiFectamine转染剂组合并添加至细胞。转染后一天，向培养物中添加1.5mL增强剂1和15mL增强剂2。转染后6天，通过以4,000g离心15分钟并通过MF 75过滤器(Nalgene)过滤澄清的收获物收获细胞培养物上清液。

3)所表达的蛋白质的纯化

首先使用SDS-PAGE电泳检查澄清的收获物的表达水平。如认为产物足够，则使用商售的蛋白A树脂(MabSelect SuRe，GE Healthcare)，使用色谱设备(GE Healthcare)纯化抗体。使用20cm床高度的柱，其最大负载为25mg/mL的填装树脂。该过程在室温下进行。

平衡(PBS pH 7.4)和加样后，纯化步骤采用两个洗涤步骤(分别是PBS pH 7.4和NaAc pH 5)和一个洗脱步骤(25mM NaAc，pH 3)，随后分别是再生、冲洗和清洗步骤，之后开始新的循环。在洗脱步骤期间，在以0.05-0.1AU(池(cell)长度0.2cm)的吸光度开始和停止的峰中收集靶蛋白质。纯化后，将蛋白质储存在-20℃至-80℃。

4)对ADC缀合缓冲液进行浓缩和缓冲液交换

如果需要，使用Vivaspin离心装置(截留值5或30kDa，Vivaproducts)将蛋白A洗脱液浓缩至20至25mg/mL。在获得所需浓度后，使用PD10柱(GE Healthcare)和4.2mM L-组氨酸+50mM海藻糖pH 6.0缓冲液将浓缩溶液(通常为25mg/mL)透析两次。或者，当蛋白A洗脱液浓度为约10mg/mL时，不使用浓缩步骤并且立即使用蛇皮透析管(截留值10kDa，Thermo Scientific)针对4.2mM L-组氨酸+50mM海藻糖pH 6.0缓冲液对洗脱液进行三次透析。在透析完成后通过过滤除去出现的任何沉淀。通过使用Nanodrop或比色皿UV分光光度计(均为Thermo Scientific)的UV光谱法测量浓度。质量分析显示该蛋白质具有＞95％的纯度，并且含有可忽略量的如通过HPSEC测定的片段或二聚体。工程化半胱氨酸突变体的等电点与野生型相同。

还使用与上述用于制备和纯化工程化半胱氨酸(VH 41C，Kabat编号)抗PSMA抗体、工程化H8-HC41(VH 41C，Kabat编号)和工程化半胱氨酸那他珠单抗(CH 225P，375C，Kabat编号)抗体类似/相同的方法制备和纯化其他实施例的抗体。

一般性的位点特异性缀合方案

向半胱氨酸工程化的抗体溶液(5至10mg/mL，含4.2mM组氨酸、50mM海藻糖，pH 6)加入EDTA(在水中25mM，4％v/v)。使用TRIS(在水中1M，pH 8)将pH调节至约7.4，然后加入TCEP(在水中10mM，20当量)，并将所得混合物在室温下孵育1至3小时。通过PD-10脱盐柱或Vivaspin离心浓缩器(截留值30kDa，PES)，使用4.2mM组氨酸、50mM海藻糖、pH 6除去过量的TCEP。使用TRIS(在水中1M，pH 8)将所得抗体溶液的pH升至约7.4，然后加入脱氢抗坏血酸(在水中10mM，20当量)，并将所得混合物在室温下孵育1至2小时。加入DMA，随后是接头药物的溶液(在DMA中10mM)。DMA的最终浓度为5-10％。将所得混合物在室温下在无光下孵育1至16小时。为了除去过量的接头药物，加入活性炭，并将混合物在室温下孵育1小时。使用0.2μm PES过滤器除去炭，并使用Vivaspin离心浓缩器(截留值30kDa，PES)将得到的ADC配制于4.2mM组氨酸、50mM海藻糖、pH 6中。最后，使用0.22μm PES滤器对ADC溶液进行无菌过滤。

用于通过部分还原的内源性二硫键缀合(wt缀合)的一般缀合方案

向抗体的溶液(5至10mM/ml，于4.2mM组氨酸、50mM海藻糖、pH 6中)加入EDTA(在水中25mM，4％v/v)。使用TRIS(在水中1M，pH 8)将pH调节至约7.4，然后加入TCEP(在水中10mM，1至3当量，取决于抗体和期望的DAR)，并将所得混合物在室温下孵育1至3小时。加入DMA，随后是接头药物(在DMA中10mM)的溶液。DMA的最终浓度为5-10％。将所得混合物在室温下在无光下孵育1至16小时。为了除去过量的接头药物，加入活性炭，并将混合物在室温下孵育1小时。使用0.2μm PES过滤器除去炭，并使用Vivaspin离心浓缩器(截留值30kDa，PES)将得到的ADC配制于4.2mM组氨酸、50mM海藻糖、pH 6中。最后，使用0.22μm PES过滤器对ADC溶液进行无菌过滤。

使用上述一般性程序，基于vc-seco-DUBA(SYD980；即，WO2011/133039的第209页的实施例10中的化合物18b，n＝1)、vc-MMAE和mc-MMAF接头药物合成半胱氨酸工程化的和野生型ADC，并使用分析型疏水相互作用色谱(HIC)、尺寸排阻色谱(SEC)、屏蔽疏水相色谱(Shielded Hydrophobic Phase Chromatography，SHPC)、RP-HPLC和LAL内毒素测试对其进行表征。

对于分析型HIC，将5至10μl样品(1mg/ml)注射到TSKgel Butyl-NPR柱(4.6mm ID×3.5cm L，Tosoh Bioscience，目录号14947)上。洗脱方法由100％缓冲液A(25mM磷酸钠，1.5M硫酸铵，pH 6.95)至100％缓冲液B(25mM磷酸钠，pH 6.95，20％异丙醇)的线性梯度以0.4ml/分钟经20分钟组成。使用配备有PDA-检测器和Empower软件的Waters Acquity H-Class UPLC系统。在214nm下测量吸光度，并测定ADC的保留时间。

如通过分析型HIC明显的，不同半胱氨酸工程化的ADC的DAR2种类与wt缀合物的保留时间(retention time，RT)存在差异(表1、2和3)。最有趣的是，将接头药物在Fab腔或Fc腔内部的特定位点处缀合(如通过分子模型算法所预测的)，与通过部分还原的内源性二硫键缀合的ADC相比，引起保留时间(显著地)减少，这导致本发明人得出结论，基于HIC数据，其中接头药物与Fab或Fc腔中的特异性位点缀合的工程化ADC的疏水性比wt缀合物小。为了进一步量化该效应，引入术语相对疏水性，其定义为：

(RT_DAR2-RT_DAR0)/(RT_{DAR2，wt-ADC}-RT_{DAR0，wt-ADC})。

本质上，相对疏水性是允许基于HIC数据在工程化ADC与wt-缀合的对应物的疏水性之间进行容易的比较的量度。该数据总结在表1、2和3中。

表1.vc-seco-DUBA ADC在先前指定的分析型HIC柱上的相对疏水性：

¹随机-非位点特异性-连接

²HMW是高分子量种类，反映形成的聚集体的量

³定义为(RT_DAR2-RT_DAR0)/(RT_{DAR2，wt-ADC}-RT_{DAR0，wt-ADC})，RT为保留时间

⁴基于MS-数据

⁵RT，wt DAR4种类＝12.2

⁶具有与指向外部的半胱氨酸残基缀合的接头药物的比较物ADC

⁷接头药物与Fab腔中的一个半胱氨酸和指向外部的一个半胱氨酸残基缀合的ADC；方法尚未优化

⁸还有防止IgG4二聚化的225P突变

表2.vc-MMAE ADC在先前指定的分析型HIC柱上的相对疏水性：

¹HMW是高分子量种类，反映形成的聚集体的量

²定义为(RT_DAR2-RT_DAR0)/(RT_{DAR2，wt-ADC}-RT_{DAR0，wt-ADC})，RT为保留时间

³ND未确定；未制备野生型H8-vc-MMAE

表3.mc-MMAF ADC在先前指定的分析型HIC柱上的相对疏水性：

¹HMW是高分子量种类，反映形成的聚集体的量

²定义为(RT_DAR2-RT_DAR0)/(RT_{DAR2，wt-ADC}-RT_{DAR0，wt-ADC})，RT为保留时间

细胞结合

三种抗PSMA ADC SYD998(wt)、SYD1091(HC41)和比较物SYD1035(HC120)对表达PSMA的LNCaP-C4.2细胞具有相等的结合亲和力(EC₅₀在0.1至0.2μg/ml范围内)，和野生型抗体相似，并且所有三个ADC均不能结合PSMA阴性DU-145细胞(EC₅₀＞10μg/ml)。

两种抗5T4 ADC H8-wt和H8-HC40对表达5T4的MDA-MB-468细胞具有相等的结合亲和力(EC₅₀在0.1至1.2μg/ml范围内)，类似于野生型H8抗体，并且两种ADC都不能结合5T4阴性SK-MEL-30细胞(EC₅₀＞10μg/ml)。

因此，ADC的抗原结合性质不受所连接的倍癌霉素衍生物接头药物的影响。

体外细胞毒性

在表达PSMA的LNCaP-C4.2细胞上，位点特异性缀合的抗PSMA ADC的效力与常规连接的野生型ADC(SYD998)相似(基于药物当量，IC₅₀在0.1至0.5nM的范围内，参见下表4)。所有ADC在PSMA阴性DU-145细胞上无活性(IC₅₀＞70nM)，表明通过PSMA选择性杀死肿瘤细胞。

两种非结合对照ADC在每种评价的细胞系上比抗PSMA ADC的效力至少低50倍。

表4.抗PSMA-vc-seco-DUBA ADC在表达PSMA的人肿瘤细胞中的体外细胞毒性

¹95％CI为95％置信区间

²在受测的最高浓度(约100nM)下给出百分比功效，并通过将每种药物或ADC的所测量的发光除以未处理细胞(仅生长培养基)的平均值乘以100来计算。

vc-MMAE与抗PSMA抗体上的HC41、LC40和LC41位置的缀合在PSMA阳性LNCaP-C4.2细胞中导致的细胞毒性效力与在这些半胱氨酸位点上连接的抗PSMA-vc-seco-DUBA相似(表4和5)。抗PSMA-vc-MMAE ADC在PSMA阴性DU-145细胞上缺乏活性(IC₅₀＞70nM)。

表5.抗PSMA-vc-MMAE ADC在表达PSMA的人肿瘤细胞中的体外细胞毒性

¹95％CI为95％置信区间

²在受测的最高浓度(约100nM)下给出百分比功效，并通过将每种药物或ADC的所测量的发光除以未处理细胞(仅生长培养基)的平均值乘以100来计算。

工程化抗-5T4 ADC对表达5T4的MDA-MB-468细胞的功效与常规连接的ADC H8-wt相等(IC₅₀在0.07和0.09nM之间，表6)。抗5T4 ADC在5T4-阴性SK-MEL-30细胞上无活性(IC₅₀＞90nM)。

表6.抗5T4-vc-seco-DUBA ADC在表达5T4的人肿瘤细胞中的体外细胞毒性

¹95％CI为95％置信区间

²在受测的最高浓度(约100nM)下给出百分比功效，并通过将每种药物或ADC的所测量的发光除以未处理细胞(仅生长培养基)的平均值乘以100来计算。

这些数据结合在一起表明用于位点特异性缀合的受测的半胱氨酸位置对包含两种不同接头药物的ADC的肿瘤细胞杀伤效力没有影响。此外，接头药物的位点特异性连接在不同抗体的Fab部分的可变区中是一般性适用的。

通过组织蛋白酶B的酶促切割

存在于具有vc-seco-DUBA(SYD980)和vc-MMAE的ADC的接头中的缬氨酸-瓜氨酸部分可以被半胱氨酸蛋白酶例如组织蛋白酶B切割，其导致(seco-)DUBA或MMAE药物随后在肿瘤溶酶体内的胞内释放或在肿瘤微环境中的胞外释放。为了评估对组织蛋白酶B的敏感性，将ADC用活化的组织蛋白酶B(Calbiochem)处理2分钟和4小时。在PSMA阴性DU-145细胞上测量从抗PSMA ADC释放的药物的细胞毒活性。在5T4阴性SK-MEL-30细胞上测量从抗5T4 ADC释放的药物的细胞毒活性。在37℃的预孵育步骤中，将1mg/ml的每种ADC与在含有4mM DTT的0.1M乙酸钠pH 5中的5μg/ml组织蛋白酶B(0.04单位/孔)混合。作为对照，将1mg/ml的每种ADC直接稀释在培养基(RPMI 1640，10％定量的FBS)中。从这些ADC溶液在培养基中制备系列稀释液。为了分别测量游离毒素DUBA或MMAE的释放，用ADC培养PSMA-阴性DU-145细胞(1,000个细胞/孔)和5T4阴性SK-MEL-30细胞(2,000个细胞/孔)6天，并在6天后使用CellTiter-Glo^TM(CTG)测定试剂盒测量细胞生存力。

释放的药物对PSMA阴性DU-145细胞和5T4阴性SK-MEL-30细胞的效力差异反映了从ADC切割的药物的量，从而反映组织蛋白酶B的缬氨酸-瓜氨酸切割位点的可及性。如表7所示，在暴露于活化的组织蛋白酶B四小时后，蛋白水解切割的敏感性在ADC中不同(见IC₅₀值)，而在暴露于组织蛋白酶B经2分钟的短时间后没有ADC被切割(IC₅₀＞10nM，数据未在表中显示)。

这些数据结合在一起显示缀合位点影响接头药物对于酶促切割的可及性并且在抗PSMA ADC：ADC-HC41、ADC-HC152、ADC-HC339、ADC-HC375、ADC-LC41和ADC-LC165中的vc-seco-DUBA(SYD980)接头药物最大程度地免受所述酶的切割。vc-MMAE与抗PSMA抗体的HC41和LC41位置的缀合导致缬氨酸-瓜氨酸切割位点的类似屏蔽(表7)。对于通过相同的HC41位点与vc-seco-DUBA(SYD980)缀合的抗5T4抗体H8-HC41也观察到类似的趋势。

这些数据结合在一起显示，特别是41C位置是用于接头药物与各种抗体的位点特异性缀合的合适位置。

表7.由组织蛋白酶B切割的游离药物的细胞毒性

＊LNCaP-C4.2用作5T4阴性细胞系

肿瘤异种移植动物模型

在LNCaP C4-2前列腺癌异种移植模型中评价三种抗PSMA ADC的体内功效。LnCaP-C4.2细胞系是源自异种移植物的人前列腺癌上皮细胞系，所述异种移植物在阉割诱导退化的小鼠中经过连续扩增，并且复现亲代的雄性激素依赖性LnCaP-FGC异种移植物细胞系。

通过将含有基质胶的200μl RPMI 1640(50∶50，v∶v)中的1×10⁷个LnCap C4.2细胞注射到雄性CB 17-SCID小鼠的右胁中来皮下诱导肿瘤。在用γ-源(1.44Gy，⁶⁰Co，BioMep，Bretenières，法国)全身辐照后24至72小时，进行LnCaP-C4.2肿瘤细胞植入。当肿瘤达到100至200mm³的平均体积时开始处理。将小鼠根据其各自的肿瘤体积随机分组，并接受在尾静脉中单次静脉内注射的抗PSMA ADC(2或10mg/kg)或载剂。监测肿瘤体积(图2)和体重(图3)的变化。所有三个ADC具有约1.8的平均DAR。

图2A证明在2mg/kg下，相比于天然的未工程化半胱氨酸SYD998，比较物工程化半胱氨酸抗PSMA ADC SYD1035活性较低。然而，根据本发明的工程化半胱氨酸ADC SYD1091的功效明显优于比较物SYD1035，并且优于天然的未工程化SYD998。如图2B所示，比较物SYD1035和SYD1091之间的差异在10mg/kg下甚至更显著。携带LnCap C4.2肿瘤的小鼠发生恶病质，如图3所示。在施用有效治疗后，这种体重减轻通常恢复，并且被认为是敏感的功效生物标志物。用SYD1091处理导致比用比较物SYD1035或天然的未工程化SYD998所见的快得多的体重恢复(图3)。

在PA-1卵巢癌异种移植模型中评估两种抗-5T4 ADC，即天然H8-vc-seco-DUBA(平均DAR 2.0)和工程化半胱氨酸(VH P41C)ADC H8-41C-vc-seco-DUBA(平均DAR 1.7)的体内功效。PA-1细胞系由从患有卵巢癌的女性收集的腹水采集的细胞建立(Zeuthen J.等Iht.J.Cancer 1980；25(1)：19-32)。

通过将含有基质胶的100μl RPMI 1640(50/50，v/v)中的1×10⁷个细胞注射到雌性Balb/c裸鼠的右胁中来皮下诱导PA-1肿瘤。在用γ-源(2Gy，⁶⁰Co，BioMep，Bretenières，法国)全身辐照后24至72小时，进行PA-1肿瘤细胞注射。当肿瘤达到200至300mm³的平均体积时开始处理。将小鼠根据其各自的肿瘤体积随机分组，并接受在尾静脉中单次静脉内注射的抗5T4 ADC(3或10mg/kg)或载剂，并监测肿瘤体积的变化(图4A和4B)。尽管两种变体在较高剂量10mg/kg具有类似的功效(图4B)，但在3mg/kg下，当与天然的、未工程化抗-5T4 ADC，H8-vc-seco-DUBA相比时，工程化半胱氨酸抗-5T4 ADC H8-41C-vc-seco-DUBA显然更有活性(图4A)。

这些发现结合在一起证明，在体内，根据本发明的位点特异性工程化半胱氨酸的ADC对于小鼠肿瘤模型中的功效显示出有利的性质。

SEQ ID NO：1(HAVT20前导序列)

1 MACPGFLWAL VISTCLEFSM A

SEQ ID NO：2(抗PSMA抗体HC S41C)

SEQ ID NO：3(人IgG1抗体HC恒定区)

SEQ ID NO：4(抗PSMA抗体HC S41C cDNA)

SEQ ID NO：5(抗PSMA抗体LC)

SEQ ID NO：6(人IgG抗体LCκ恒定区)

SEQ ID NO：7(抗PSMA抗体LC cDNA)

SEQ ID NO：8(H8 HC P41C)

SEQ ID NO：9(人IgG1抗体HC恒定区)

SEQ ID NO：10(H8 HC P41C cDNA)

SEQ ID NO：11(H8 LC)

SEQ ID NO：12(H8 LC cDNA)

SEQ ID NO：13(种系前导序列)

1 MDWTWRILFL VAAATGAHS

SEQ ID NO：14(那他珠单抗HC)

SEQ ID NO：15(那他珠单抗HC S225P，S375C)

SEQ ID NO：16(那他珠单抗HC S225P，S375C cDNA)

SEQ ID NO：17(种系前导序列)

1 MDMRVPAQLL GLLLLWLRGA RC

SEQ ID NO：18(那他珠单抗LC)

SEQ ID NO：19(那他珠单抗LC cDNA)