治疗或预防神经退行性病症的组合物和方法与流程

本申请要求于2014年4月16日提交的澳大利亚临时申请第2014901398号的优先权的权益，将其全部公开通过引用在此并入本文。

本发明涉及通过施用激活Nix介导的线粒体自噬的试剂来治疗或预防神经退行性病症的方法。

发明背景

神经退行性疾病是神经系统的致残病症的一大组，其特点是神经元亚型的受损和死亡。线粒体功能障碍被认为是各种神经退行性疾病包括帕金森病、阿尔茨海默病、亨延顿病和线粒体疾病的推定致病因素。

线粒体是基本的细胞器，其通过氧化磷酸化作用提供细胞的能量，调节钙稳态和细胞死亡。然而，线粒体还是细胞活性氧(ROS)的主要来源。由于细胞的抗氧化剂，可以耐受ROS的正常水平，然而在线粒体呼吸缺陷的病理情形下，ROS产生的增加超过抗氧化剂保护的能力，其引起对各种细胞元件(包括线粒体)的损害。该损害的累积被认为导致线粒体功能障碍。因此，通过自噬来移除功能障碍的或损伤的线粒体(称作线粒体自噬的过程)，对于维持恰当的细胞功能是关键的。

帕金森病(PD)由中脑多巴胺神经元的特异且进行性的神经元损失引起。多巴胺是负责在黑质和纹状体之间传递信号的化学信使。多巴胺的损失引起纹状体的神经细胞以不受控制的方式发作，其导致运动迟缓、静止性震颤、僵硬和姿势不稳定的主要临床特征；可能严重且极有害的特征。

在家族型PD中鉴定的数个致病基因中，parkin(编码E3泛素连接酶的基因)中的突变是常染色体隐性早发型PD的最常见遗传原因。具有parkin突变的PD患者呈现典型的早发型震颤麻痹、行动缓慢、早期肌张力障碍以及L-多巴响应。而且，广泛的疾病表现度和外显率与Parkin-相关的PD有关。

Parkin还涉及线粒体的质量控制。Parkin与PTEN-诱导的假定激酶1(PINK1)(线粒体激酶)一起介导选择性自噬移除损伤的线粒体。因此，PD-相关的parkin中的突变与受损的线粒体自噬相关。

PD不能治愈。当前的疗法严重地依赖于通过给予患者口服剂量的多巴胺能试剂(像多巴胺前体左旋多巴或多巴胺激动剂)来补充多巴胺。此类疗法可以提供缓解，但是与治疗功效的衰减相关，伴随持续的治疗则需要增加的剂量，这与严重副作用的风险增加相关。对于PD的另外疗法存在迫切的需求。

发明概述

本发明的发明人已确定，通过Nix介导的线粒体自噬的激活可以预防和治疗神经退行性疾病或病症。根据一个方面，本发明提供预防或治疗对象中的神经退行性病症的方法，其包括向所述对象施用治疗有效量的增加细胞中Nix介导的线粒体自噬的试剂。

在一个实施方案中，所述试剂增加细胞中的Nix多肽或其片段，和/或GABARAP-L1多肽或其片段的表达。

在一个实施方案中，所述试剂包含Nix多肽或其片段和/或GABARAP-L1多肽或其片段。

在另一实施方案中，所述试剂包含编码Nix多肽或其片段和/或GABARAP-L1多肽或其片段的表达载体。

在一个实施方案中，所述细胞是神经元。

在一个实施方案中，神经退行性病症包括对象的神经元中有缺陷的线粒体自噬。

在一个实施方案中，神经退行性病症选自：帕金森病、阿尔茨海默病、路易体痴呆症、克罗伊茨费尔特-雅各布病、亨延顿病、线粒体疾病、多发性硬化症或肌萎缩侧索硬化症。

在一个实施方案中，神经退行性病症是帕金森病。在另一实施方案中，帕金森病是早发型帕金森病(EOPD)。

在一个实施方案中，对象具有parkin和/或PINK1中的突变。

根据另一方面，本发明提供鉴定对预防或治疗对象中的神经退行性病症有用的试剂的方法，其包括：(a)使细胞与试剂接触；以及(b)检测与Nix介导的线粒体自噬相关的多肽的生物活性或表达的增加，或(c)检测编码与细胞中Nix介导的线粒体自噬相关的多肽的多核苷酸的表达相对于未与所述试剂接触的对照细胞的增加，其中增加所述活性或所述表达的试剂被鉴定为对治疗神经退行性病症有用。

在一个实施方案中，在鉴定对预防或治疗对象中的神经退行性病症有用的化合物的方法中使用的细胞，显示受损的Parkin-相关的线粒体自噬。

在一个实施方案中，在鉴定对预防或治疗对象中的神经退行性病症有用的化合物的方法中使用的细胞，包含parkin和/或PINK1中的突变。

在一个实施方案中，在鉴定对预防或治疗对象中的神经退行性病症的有用的化合物的方法中使用的细胞，分离自患有神经退行性病症或者处于患神经退行性病症风险的对象。

在一个实施方案中，在鉴定对预防或治疗对象中的神经退行性病症的有用的化合物的方法中使用的细胞，是干细胞、可诱导的多能干细胞(iPS细胞)、祖细胞或由此来源的任意细胞、成纤维细胞、嗅觉神经球或神经元。

根据另一方面，本发明提供用于治疗神经退行性病症的试剂盒，其包含：含有治疗有效量的增加细胞中Nix介导的线粒体自噬的试剂的药物组合物、用于鉴定需要此类治疗的对象的操作指南，以及用于向所述对象施用药物组合物的用法说明。

在一个实施方案中，药物组合物包含增加细胞中Nix多肽或其片段和/或GABARAP-L1多肽或其片段的表达的试剂。

在一个实施方案中，药物组合物包含Nix多肽或其片段和/或GABARAP-L1多肽或其片段。

在一个实施方案中，药物组合物包含编码Nix多肽或其片段和/或GABARAP-L1多肽或其片段的表达载体。

根据另一方面，本发明提供增加细胞中Nix介导的线粒体自噬的试剂在制备用于预防或治疗神经退行性病症的药物中的用途。

根据另一方面，本发明提供这样的试剂：其增加细胞中Nix介导的线粒体自噬以用于预防或治疗神经退行性疾病。

因此，本发明至少涉及下述一系列有编号的实施方案：

实施方案1：预防或治疗对象中的神经退行性病症的方法，其包括向对象施用治疗有效量的增加细胞中Nix介导的线粒体自噬的试剂。

实施方案2：根据实施方案1所述的方法，其中所述试剂增加细胞中的Nix多肽或者其片段或变体或类似物，和/或GABARAP-L1多肽或者其片段或变体或类似物的生物活性或表达。

实施方案3：根据实施方案1或2所述的方法，其中所述试剂包含Nix多肽或者其片段或变体，和/或GABARAP-L1多肽或者其片段或变体。

实施方案4：根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述试剂包含编码Nix多肽或者其片段或变体和/或GABARAP-L1多肽或者其片段或变体的表达载体。

实施方案5：根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述试剂包含编码Nix多肽或者其片段或变体的表达载体。

实施方案6：根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞是神经元或神经元的前体。

实施方案7：根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中神经退行性病症与线粒体功能障碍相关。

实施方案8：根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中神经退行性病症包括受损的线粒体自噬。

实施方案9：根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中神经退行性病症选自：帕金森病、阿尔茨海默病、路易体痴呆症、克罗伊茨费尔特-雅各布病、亨延顿病、多发性硬化症或肌萎缩侧索硬化症。

实施方案10：根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中神经退行性病症是帕金森病。

实施方案11：根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述对象具有parkin和/或PINK1中的突变。

实施方案12：鉴定对预防或治疗对象中的神经退行性病症有用的试剂的方法，其包括：(a)使细胞与试剂接触；以及(b)检测与细胞中Nix介导的线粒体自噬相关的一种或多种多肽的生物活性或表达相对于未与所述试剂接触的对照细胞的增加，或(c)检测与编码细胞中Nix介导的线粒体自噬相关的多肽的一种或多种多核苷酸的表达相对于未与所述试剂接触的对照细胞的增加，其中增加所述活性或所述表达的试剂被鉴定为对治疗神经退行性病症有用。

实施方案13：根据实施方案12所述的方法，其中与Nix介导的线粒体自噬相关的所述一种或多种多核苷酸或所述一种或多种多肽包括Nix和/或GABARAP-L1。

实施方案14：根据实施方案12或13所述的方法，其中所述细胞显示受损的Parkin-相关的线粒体自噬。

实施方案15：根据实施方案12-14中任一项所述的方法，其中所述细胞包含parkin和/或PINK1中的突变。

实施方案16：根据实施方案12-15中任一项所述的方法，其中所述细胞分离自患有神经退行性病症或处于患神经退行性病症的风险的对象。

实施方案17：根据实施方案12-16中任一项所述的方法，其中所述细胞是成纤维细胞、嗅觉神经球或神经元。

实施方案18：用于治疗神经退行性病症的试剂盒，其包含：含有治疗有效量的增加细胞中Nix介导的线粒体自噬的试剂的药物组合物、用于鉴定需要此类治疗的对象的操作指南，以及用于向所述对象施用药物组合物的用法说明。

实施方案19：根据实施方案18所述的试剂盒，其中所述药物组合物包含增加细胞中Nix多肽或其片段和/或GABARAP-L1多肽或其片段的表达的试剂。

实施方案20：根据实施方案18或19所述的试剂盒，其中所述药物组合物包含Nix多肽或其片段和/或GABARAP-L1多肽或其片段。

实施方案21：根据实施方案18-20中任一项所述的试剂盒，其中所述药物组合物包含编码Nix多肽或其片段和/或GABARAP-L1多肽或其片段的表达载体。

实施方案22：增加细胞中Nix介导的线粒体自噬的试剂在制备用于预防或治疗神经退行性病症的药物中的用途。

实施方案23：增加细胞中Nix介导的线粒体自噬的试剂，其用于预防或治疗神经退行性疾病。

实施方案24：根据实施方案22所述的用途或根据实施方案23所述的试剂，其中所述试剂增加细胞中Nix多肽或者其片段或变体或类似物和/或GABARAP-L1多肽或者其片段或变体或类似物的生物活性或表达。

实施方案25：根据实施方案22所述的用途或根据实施方案23所述的试剂，其中所述试剂包含Nix多肽或者其片段或变体，和/或GABARAP-L1多肽或者其片段或变体。

实施方案26：根据实施方案22所述的用途或根据实施方案23所述的试剂，其中所述试剂包含编码Nix多肽或者其片段或变体的表达载体。

实施方案27：根据实施方案22或实施方案24-26中任一项所述的用途，或根据实施方案23-26中任一项所述的试剂，其中所述神经退行性病症与线粒体功能障碍相关。

实施方案28：根据实施方案22或实施方案24-27中任一项所述的用途，或根据实施方案23-27中任一项所述的试剂，其中所述神经退行性病症包含受损的线粒体自噬。

实施方案29：根据实施方案22或实施方案24-28中任一项所述的用途，或根据实施方案23-28中任一项所述的试剂，其中所述神经退行性病症选自：帕金森病、阿尔茨海默病、路易体痴呆症、克罗伊茨费尔特-雅各布病、亨延顿病、多发性硬化症或肌萎缩侧索硬化症。

实施方案30：根据实施方案29所述的用途或根据实施方案29所述的试剂，其中所述神经退行性病症是帕金森病。

实施方案31：根据实施方案22或实施方案24-30中任一项所述的用途，或根据实施方案23-30中任一项所述的试剂，其中所述神经退行性病症与parkin和/或PINK1中的突变相关。

附图说明

图1显示，在分离自携带parkin中的纯合突变但不患有PD的个体的细胞中，线粒体的功能得以保持(1A)。还示例了，分离自携带parkin中的杂合突变的PD个体的细胞更易受线粒体毒素如鱼藤酮的攻击(1B和C)。

图2显示，在分离自携带parkin中的纯合突变但不患有PD的个体(“携带者”)的细胞中，线粒体自噬是正常的。

图3显示，在分离自携带parkin中的纯合突变但不患有PD的个体的细胞中，线粒体自噬和自噬的异常诱导中缺乏Parkin功能的补偿。

图4显示，在分离自携带parkin中的纯合突变但不患有PD的个体的细胞中，Nix和GABARAP-L1的表达升高。

图5显示，在分离自携带parkin中的纯合突变但不患有PD的个体的细胞中，Nix的敲除废除了CCCP诱导的线粒体自噬。

图6显示，在分离自携带parkin中的复合杂合突变的PD个体的细胞中，Nix表达的特异性诱导。

图7显示，在分离自携带parkin中的复合杂合突变的PD个体的细胞中，Nix的特异性诱导恢复了线粒体自噬。图7(B)还描述了在分离自携带PINK1中的纯合突变的PD个体的细胞中，线粒体自噬的恢复。

图8显示，在分离自携带parkin中的复合杂合突变的PD个体的细胞和分离自携带PINK1中的纯合突变的PD个体的细胞中，Nix的敲除废除了由诱导Nix表达的试剂恢复的CCCP诱导的线粒体自噬。

图9显示，在分离自携带parkin中的复合杂合突变的PD个体的细胞中，增加Nix的表达恢复了CCCP诱导的线粒体自噬。

图10显示，在分离自携带parkin中的复合杂合突变的PD个体的细胞以及分离自携带PINK1中的纯合突变的PD个体的细胞中，Nix的过表达恢复了线粒体功能。

本文提及的序列

SEQ ID NO:1：编码Nix多肽的氨基酸序列：

SEQ ID NO:2：编码Nix多肽的核酸序列：

SEQ ID NO:3：编码GABA(A)受体相关蛋白样1(GABARAP-L1)多肽的氨基酸序列：

SEQ ID NO:4：编码GABA(A)受体相关蛋白样1(GABARAP-L1)多肽的核酸序列：

SEQ ID NO:5：aggacaagagaaataaggcc(线粒体DNA正向引物)

SEQ ID NO:6：taagaagaggaattgaacctctgactgtaa(线粒体DNA反向引物)

SEQ ID NO:7：tttttgtgtgctctcccaggtct(核DNA正向引物)

SEQ ID NO:8：tggtcactggttggttggc(核DNA反向引物)

SEQ ID NO:9：ttcacaaagcgccttcccccgtaaatga(线粒体DNA探针)

SEQ ID NO:10：ccctgaactgcagatcaccaatgtggtag(核DNA探针)

SEQ ID NO:11：ttggatgcacaacatgaatcagg(Nix正向引物)

SEQ ID NO:12：tcttctgactgagagctatggtc(Nix反向引物)

SEQ ID NO:13：gacgccttattcttctttgtc(GABARAP-L1正向引物)

SEQ ID NO:14：catgattgtcctcatacagttc(GABARAP-L1反向引物)

SEQ ID NO:15：gtttgtggataagacagtcc(GABARAP-L2DNA正向引物)

SEQ ID NO:16：gaagccaaaagtgttctctc(GABARAP-L2反向引物)

SEQ ID NO:17：ttccccttggccatcaaga(PINK1正向引物)

SEQ ID NO:18：accagctcctggctcattgt(PINK1反向引物)

SEQ ID NO:19：gtcctctcccaagtccacac(β-肌动蛋白正向引物)

SEQ ID NO:20：gggagaccaaaagcttcat(β-肌动蛋白反向引物)

发明详述

定义

本文使用的术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”意指：(1)改善或稳定对象的病况或疾病，或者(2)预防或减轻与对象的病况或疾病相关的症状的发展或恶化。

本文使用的术语“预防(prevent)”、“预防(preventing)”、“预防(prevention)”等指降低在对象中发展病症或病况的可能性，所述对象未患病症或病况，但是处于发展病症或病况的风险或易于发展病症或病况。

本文使用的术语“施用(administration)”或“施用(administering)”意指本文公开的化合物的施用途径。施用的示例性途径包括但不限于：经口施用、静脉内施用、腹膜内施用、动脉内施用以及肌肉内施用。施用的优选途径可以根据各种因素而改变，所述因素例如，包含如本文公开的试剂的药物组合物的组分，可能的或实际的疾病的位点以及疾病的严重性。

本文使用的术语“有效的量(amount effective)”或“有效量(effective amount)”意指当施用至对象用于治疗疾病时足以实现疾病的此类治疗的本文公开的试剂的量。患者中的任何改善被认为足以实现治疗。有效量的本文公开的用于治疗神经退行性疾病的试剂，可以根据施用方式、患者的年龄、体重和总体健康状况而改变。最后，开处方者或研究人员将决定合适的量和剂量方案。

本文使用的术语“神经退行性病症”和“神经退行性疾病”在本文档中可互换使用，并且意指以异常的细胞死亡为特点的神经系统(例如，中枢神经系统或外周神经系统)疾病。神经退行性病况的实例包括：阿尔茨海默病、唐氏综合征、额颞痴呆症、进行性核上性麻痹、匹克氏病、尼曼-匹克氏病、帕金森病、亨延顿病、齿状核红核苍白球路易体萎缩、肯尼迪病(也被称为脊髓延髓肌肉萎缩)、以及脊髓小脑共济失调(例如，1型、2型、3型(也被称为马查多-约瑟夫病)、6型、7型和17型))、脆性X(Rett's)综合征、脆性XE精神发育迟滞、弗里德赖希共济失调(Friedreich's ataxia)、肌强直营养不良、脊髓小脑共济失调8型以及脊髓小脑共济失调12型、亚历山大病(Alexander's disease)、阿尔帕氏病(Alper's disease)、肌萎缩侧索硬化症(或运动神经元病)、遗传性痉挛性截瘫、线粒体疾病、共济失调性毛细血管扩张、巴腾病(也被称为Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten病)、卡纳万病(Canavan disease)、科凯恩氏综合征(Cockayne syndrome)、皮质基底节变性、克罗伊茨费尔特-雅各布病(Creutzfeldt-Jakob disease)、缺血性中风、克拉伯病(Krabbe disease)、路易体痴呆症、多发性硬化症、多系统萎缩症、佩-梅病(Pelizaeus-Merzbacher disease)、匹克氏病(Pick's disease)、原发性侧索硬化症、雷弗素姆病(Refsum's disease)、山霍夫氏病(Sandhoff disease)、希尔德氏病(Schilder's disease)、脊髓损伤、脊髓性肌萎缩症、Steele-Richardson-Olszewski病、以及脊髓痨。

本文使用的术语“与线粒体功能障碍相关的神经退行性病症”，意指以线粒体功能障碍为特点或涉及线粒体功能障碍的神经退行性病况。示例性的与线粒体功能障碍相关的神经退行性病况包括但不限于：弗里德赖希共济失调、肌萎缩侧索硬化症、线粒体肌病、脑病、高乳酸血症(lactacidosis)、中风(MELAS)、肌抽跃癫痫合并红色褴褛肌纤维症(MERRF)、卡恩斯-塞尔综合征(Kearn-Sayre Syndrome)、慢性进行性眼肌麻痹(chronic progressive ophthalmoplegia)、阿尔帕氏病、利氏病(Leigh’s disease)、癫痫、帕金森病、阿尔茨海默病、亨延顿病和线粒体疾病。

本文使用的术语“对象”和“患者”在本文可互换使用。它们指受疾病或病症的折磨或者易患疾病或病症但是可能患有或未患有所述疾病或病症的人或另外的哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、猪、羊、马或灵长类)。在某些实施方案中，所述对象是人类。

本文使用的术语“试剂”意指任意小分子化合物、抗体、核酸分子或多肽或者它们的片段。

本文使用的术语“线粒体自噬”指从细胞移除功能障碍的或受损的线粒体的过程。例如，线粒体自噬可以通过以下自噬过程发生：所述自噬过程的特点是将细胞器包入被称作自噬体的双膜囊泡，自噬体与溶酶体融合以形成自噬溶酶体，并且随后降解该自噬溶酶体。

本文使用的“Nix多肽”意指与SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的氨基酸序列同一性且具有Nix生物活性的蛋白或其片段。

本文使用的“Nix多核苷酸”意指编码Nix多肽的核酸分子(例如SEQ ID NO:2)。

本文使用的“Nix介导的线粒体自噬”，意指涉及Nix的线粒体的自噬清除，并且包括Nix与其它蛋白的相互作用，所述其它蛋白包括自噬体膜上的蛋白(如LC3和GABARAP-L1)。Nix介导的线粒体自噬可能涉及Nix与Parkin的相互作用，并且还可能独立于Parkin而发生。

本文使用的“GABARAP-L1多肽”，意指与SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的氨基酸序列同一性且具有GABARAP-L1生物活性的蛋白或其片段。

本文使用的“GABARAP-L1多核苷酸”，意指编码GABARAP-L1多肽的核酸分子(例如SEQ ID NO:4)。

本文使用的术语“片段”意指多肽或核酸分子的一部分。该部分优选地含有参考核酸分子或多肽的全长的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。片段可以含有10、20、30、40、50、60、70、80、90、或100、200、300、400、500、600、700、800、900、或1000、1500、2000、2500或3000个核苷酸或氨基酸。

本文使用的术语“变体”，当提及多肽时意指含有原始多肽的氨基酸序列的变异的多肽，其保留原始多肽的至少某些生物学活性，或者相比于原始多肽可以具有增加的活性。

本文使用的术语“类似物”，指不相同但具有类似的功能和/或功能特征的分子。

当术语“包含(comprise/comprises)”、“包含(comprised)”或“包含(comprising)”在本申请文件(包括权利要求书)中使用时，它们应被解释为指定陈述的特征、整数、步骤或组分的存在，但是不排除一种或多种其它特征、整数、步骤或组分、或者它们的组的存在。

本文引用的专利文献或者以现有技术给出的其它材料不应当被认为承认所述文献或材料是已知的，或者其包含的信息是在任何权利要求的优先权日的公知常识一部分。

线粒体自噬和神经退行性病症

如本文所讨论的，线粒体是调控细胞能量代谢和细胞死亡的必需细胞器。因此，将功能障碍的线粒体以及它们经线粒体自噬的移除中的缺陷与许多病理生理学的病症和疾病联系起来。例如，在阿尔茨海默病中，已证明β-淀粉样片段靶向线粒体并引起线粒体功能障碍，以及由造成亨延顿病的单基因突变引起对线粒体功能和生理机能的破坏。因此，受损的线粒体自噬涉及各种神经退行性疾病，如帕金森病和阿尔茨海默病。

相反，线粒体自噬的维持或恢复与神经保护作用相关。的确，最近已证明，在亨延顿病的背景下，PINK1的过表达与parkin介导的线粒体自噬和神经保护作用的恢复相关(Cell Death and Disease(2015)6,e1617)。

本发明提供通过增加细胞中Nix介导的线粒体自噬来预防或治疗对象中的神经退行性病症的方法。

线粒体自噬和帕金森病

在与单基因的帕金森病(PD)相关的基因中，parkin和PINK1中的突变已被鉴定为常染色体隐性早发型PD(EOPD)的最常见遗传原因。Parkin编码E3泛素连接酶，以及PINK1编码线粒体丝氨酸/苏氨酸激酶，二者均涉及健康的线粒体功能和形态的维持。来自证明暴露于线粒体毒素(如1-甲基-4-苯基-1,2,5,6-四氢吡啶(MPTP)和鱼藤酮)引起了帕金森症的数据，已经了解线粒体功能障碍在PD中的作用。最近的研究证明，当通过羰基氰酯-3-氯苯腙(CCCP)消耗线粒体膜电位时，以PINK1依赖的方式将Parkin募集至线粒体，从而通过泛素-蛋白酶体系统促进线粒体外膜蛋白(如线粒体融合蛋白Mitofusin(Mfn)1和2)的泛素化和降解。该过程防止功能障碍的线粒体与健康线粒体集合的融合，并且通过自噬-溶酶体系统(在本文被称作线粒体自噬的过程)促进功能障碍线粒体的清除。一致地，已证明parkin或PINK1中的突变会损伤PD细胞模型(使用患者来源的细胞或已引入parkin或PINK1中的突变的细胞)中的线粒体自噬，其导致功能障碍的线粒体的累积。由于其对线粒体质量控制的有害影响，受损的线粒体自噬涉及PD中的神经变性和疾病进展。

通过对包含parkin中的各种突变的家族中观察到的帕金森症的表型可变性的分析(Koentjoro,et al.,2012,Mov Disord 27(10),1299-303)，发明人发现，替代性线粒体自噬的激活能够补偿受损的Parkin介导的线粒体自噬。

在源自纯合子parkin突变携带者(其不具有确切的PD的临床表现)的细胞模型(“携带者细胞”)中，观察到正常的线粒体功能和清除。相反，携带者或“先证者(proband)”的女儿(其为复合杂合子且还缺乏功能性Parkin)呈现早发型PD。在源自复合杂合子的细胞模型(“患者细胞”)中，观察到对线粒体自噬的损伤。

发明人意外地确定，Nip3样蛋白X(Nix)(也被称为BNIP3L)的表达，以及其与结合伴侣γ-氨基丁酸A型受体相关的蛋白样1(GABARAP-L1)的结合，是升高的并且与线粒体自噬的维持相关。

Nix是线粒体外膜蛋白，已证明其在线粒体的自噬清除中发挥重要作用。与其提出的作为线粒体自噬受体的功能一致，显示Nix与自噬体膜上的蛋白(如LC3和GABARAP-L1)相互作用，并且参与Parkin的线粒体转运和自噬的诱导。

发明人证明，涉及Nix的替代性线粒体自噬的激活，能够维持线粒体自噬的功能，并且与预防对象中的神经退行性病症相关。

因此，本发明提供预防或治疗对象中的神经退行性病症的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的增加细胞中Nix介导的线粒体自噬的试剂。在一个实施方案中，所述试剂增加细胞中的Nix多肽或其片段和/或GABARAP-L1多肽或其片段的细胞生物活性或表达水平。

在另一实施方案中，所述试剂是编码Nix多肽或其片段和/或GABARAP-L1多肽或其片段的表达载体。

Nix和GABARAP-L1多肽、变体和类似物

本发明提供Nix和/或GABARAP-L1多肽或片段或变体或类似物以及编码Nix和/或GABARAP-L1多肽或片段或变体或类似物的表达载体的用途。在一个实施方案中，本发明提供通过在序列中产生变化来优化Nix和/或GABARAP-L1氨基酸序列或核酸序列的方法。此类变化可以包括某些突变、缺失、插入或翻译后修饰。在其它实施方案中，本发明还包括任何天然存在的Nix和/或GABARAP-L1多肽的变体或类似物。变体与本发明的天然多肽的不同可以在于：氨基酸序列的差异、翻译后修饰或者这二者。Nix和/或GABARAP–L1多肽的变体与本文所描述的天然氨基酸序列的全部或部分通常呈现至少85％，更优选90％，以及最优选95％或甚至99％的同一性。序列比较的长度为至少5、10、15或20个氨基酸残基，优选至少25、50、或75个氨基酸残基，以及更优选多于100个氨基酸残基。

通过原始序列的改变，变体或类似物可以不同于本文所描述的天然多肽。这些包括天然的或诱导的遗传变体(例如，由辐射或暴露于乙烷甲基硫酸盐(ethanemethylsulfate)导致的随机突变，或者如Sambrook,Fritsch and Maniatis,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2d ed.),CSH Press,1989，或最新分子生物学实验指南(Current Protocols in Molecular Biology)(Ausubel,1987)中所描述的定点诱变得到的)。还包括环化肽、分子和类似物，其含有除L-氨基酸之外的残基(例如，D-氨基酸)，或者非天然的氨基酸或合成的氨基酸(例如，β或γ氨基酸)。

氨基酸包括天然的和合成的氨基酸，以及以与天然的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然的氨基酸是由遗传密码子编码的氨基酸，以及后来修饰的那些氨基酸，例如，羟脯氨酸、γ-羟基谷氨酸、以及O-磷酸丝氨酸、O-磷酸苏氨酸。氨基酸类似物是与天然氨基酸具有相同的基本化学结构的化合物，即，与氢、羧基、氨基和R基结合的碳(例如，高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸甲基锍)，但是所述化合物含有天然氨基酸中不存在的一些改变(例如，修饰的侧链)；术语“氨基酸模拟物”指这样的化合物：其具有与氨基酸的通常化学结构不同的结构，但是以与天然氨基酸类似的方式起作用。氨基酸类似物可以具有修饰的R基(例如，正亮氨酸)或者修饰的肽骨架，但是保留与天然氨基酸相同的基本化学结构。在一个实施方案中，氨基酸类似物是D-氨基酸、β-氨基酸或N-甲基氨基酸。

氨基酸和类似物是本领域熟知的。氨基酸在本文可以由其通常已知的三字母符号或者由IUPAC-IUB生化命名委员会推荐的一字母符号来提及。同样地，核苷酸可以由其通常接受的单字母密码来提及。除全长的多肽以外，本发明还包括本发明的多肽中任一种的片段。根据本发明的方法，可以施用具有被设计来模拟Nix和/或GABARAP-L1功能活性的化学结构的非蛋白的Nix和/或GABARAP-L1类似物。Nix和/或GABARAP-L1的变体和类似物，可以优于原始多肽的生理活性。设计类似物的方法是本领域熟知的，以及根据此类方法通过修饰化学结构可以进行类似物的合成，使得到的类似物呈现参考Nix和/或GABARAP-L1多肽的活性。这些化学修饰包括但不限于，在参考多肽的特定碳原子处代入替代性R基以及改变饱和度。优选地，多肽类似物对体内的降解相对具有抗性，当施用时其导致更久的治疗效果。用于测量功能活性的分析包括但不限于下文的实施例中所述描述的那些。

因此，以编码Nix和/或GABARAP-L1蛋白、其变体或片段的多核苷酸为特色的多核苷酸疗法，是用于治疗或预防神经退行性病症的一种治疗方法。期望在包含受损的或功能障碍的线粒体的细胞中表达此类蛋白，以促进那些线粒体的去除。可以将此类核酸分子递送至患有神经退行性病症或疾病或者处于发展所述神经退行性病症或疾病风险的对象的细胞。必须将所述核酸分子以它们可被吸收的形式递送至对象的细胞，以便可以产生治疗有效水平的Nix和/或GABARAP-L1蛋白或其片段。

可以施用编码Nix和/或GABARAP-L1的表达载体，用于整体表达或者可以将其用于转导所选择的组织。可以将转导病毒(例如，逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒和慢病毒)载体用于体细胞基因疗法，特别是因为它们高的感染效率以及稳定的整合和表达(参见，例如，Cayouette et al.,Human Gene Therapy 8:423-430,1997；Kido et al.,Current Eye Research 15:833-844,1996；Bloomer et al.,Journal of Virology 71:6641-6649,1997；Naldini et al.,Science272:263-267,1996；和Miyoshi et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94:10319,1997)。例如，可以将编码Nix和/或GABARAP-L1蛋白、其变体或片段的多核苷酸，克隆进逆转录病毒载体，并且可以从其内源性启动子、从逆转录病毒的长末端重复序列、或者从特异性针对目标靶细胞类型的启动子处驱动表达。可以使用的其它病毒载体，包括例如，疫苗病毒、牛乳头瘤病毒、或疱疹病毒如EB病毒(Epstein-Barr Virus))(还参见，例如以下文献中的载体：Miller,Human Gene Therapy 15-14,1990；Friedman,Science 244:1275-1281,1989；Eglitis et al.,Biotechnology 6:608-614,1988；Tolstoshev et al.,Current Opinion in Biotechnology 1:55-61,1990；Sharp,The Lancet 337:1277-1278,1991；Cornetta et al.,Nucleic Acid Research and Molecular Biology 36:311-322,1987；Anderson,Science 226:401-409,1984；Moen,Blood Cells 17:407-416,1991；Miller et al.,Biotechnology 7:980-990,1989；Le Gal La Salle et al.,Science 259:988-990,1993；以及Johnson,Chest 107:77S-83S,1995)。逆转录病毒载体开发得特别好，并且已被用于临床背景(Rosenberg et al.,N.Engl.J.Med 323:370,1990；Anderson et al.,美国专利第5,399,346号)。优选地，使用病毒载体来全身地施用Nix和/或GABARAP-L1多核苷酸。

还可以采用非病毒的方法用于将治疗引入需要治疗或预防神经退行性疾病的患者的细胞。例如，在脂转染存在下(Feigner et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84:7413,1987；Ono et al.,Neuroscience Letters 17:259,1990；Brigham et al.,Am.J.Med.Sci.298:278,1989；Staubinger et al.,Methods in Enzymology 101:512,1983)，脱唾液酸血清类粘蛋白-聚赖氨酸缀合(Wu et al.,Journal of Biological Chemistry 263:14621,1988；Wu et al.,Journal of Biological Chemistry 264:16985,1989)，或者通过外科条件下进行微注射(Wolff et al.,Science 247:1465,1990)的情况下，通过施用核酸可以将核酸分子引入细胞。优选地，可以将核酸与脂质体和鱼精蛋白联合施用。

还可以使用涉及体外转染的非病毒方法实现基因转移。此类方法包括使用磷酸钙、DEAE葡聚糖、电穿孔和原生质体的融合。脂质体也可能潜在地有益于将DNA递送进细胞。也可以通过以下步骤来实现向患者的受影响组织移植正常的基因：将正常的核酸转移进离体的可培养细胞类型(例如，自体或异体的原代细胞或其后代)，其后将所述细胞(或其子代)注射进靶组织。

从任何合适的表达系统(例如慢病毒表达系统)，使用任何合适的启动子(例如，人巨细胞病毒(CMV)启动子、猿猴病毒40(SV40)启动子或金属硫蛋白启动子)可引导用于多核苷酸疗法方法的cDNA的表达，并且通过任何合适的哺乳类调控元件进行调控。例如，若需要，可以使用已知优选在特定的细胞类型中引导基因表达的增强子，以引导核酸的表达。使用的增强子可以包括但不限于，特点为组织特异性或细胞特异性增强子的那些。可选地，如果将基因组克隆用作治疗构建体，则可以通过同源调控序列或者通过源自异源来源的调控序列(若需要)来介导调控。

本发明中包括的另外治疗方法，涉及将重组治疗剂，如重组的Nix和/或GABARAP-L1蛋白、其变体或片段，直接地施用至可能或实际的受疾病影响组织的部位或者全身地施用(例如，通过任何常见的重组蛋白施用技术)。施用的蛋白的剂量取决于大量因素，包括各患者的大小和健康状况。对于任何具体的对象，具体的剂量方案应当根据个体需要以及施用或监督组合物施用的人的专业判断随着时间进行调整。

对增加Nix介导的线粒体自噬的试剂的筛选

如本文所讨论，通过增加Nix介导的线粒体自噬，可以补偿由于parkin或PINK1中的突变导致的对Parkin-相关的线粒体自噬的损伤。考虑到具有线粒体缺陷的对象具有正常的和有缺陷的线粒体的混合群体，能选择性地降低有缺陷的线粒体数的试剂有益于神经退行性病症的治疗。若需要，测试能增加Nix和/或GABARAP-L1的表达或生物活性的试剂在促进选择性消除细胞(例如，包含mtDNA遗传缺陷的细胞、包含parkin或PINK1中的遗传突变的细胞、黑质细胞或多巴胺能神经元细胞)中的有缺陷线粒体方面的功效。此类方法对个性化医学应用特别有用，例如，鉴定很可能对患有神经退行性病症的对象有益的试剂。在一个实例中，在添加线粒体解偶联剂或诱导线粒体自噬的其它试剂之前、同时或之后，将候选化合物添加至细胞(例如，神经元培养物)的培养基。然后使用技术人员已知的标准方法，包括本文所描述的那些，来测量细胞中线粒体的功能和线粒体自噬的程度。将候选试剂存在下的线粒体功能和/或线粒体自噬的程度，与未接受候选试剂的相应对照培养基中所测量的水平进行比较。

在一个实施方案中，在包含parkin和/或PINK1中的突变的细胞中，分析所述试剂促进选择性消除有缺陷的线粒体的能力。能促进Nix和/或GABARAP-L1的表达或生物活性的增加、或有缺陷线粒体的减少的化合物被鉴定为可用于本发明中；可以将这样的候选化合物例如用作治疗剂以预防、延迟、缓解、稳定或治疗以线粒体功能障碍为特点的神经退行性病症。

在一个实施方案中，本发明提供鉴定对预防或治疗对象中的神经退行性病症有用的试剂的方法，所述方法包括：(a)使细胞与试剂接触；以及(b)检测细胞中与Nix介导的线粒体自噬相关的多肽的生物活性或表达相对于未与所述试剂接触的对照细胞的增加，或者(c)检测细胞中编码与Nix介导的线粒体自噬相关的多肽的多核苷酸相对于未与所述试剂接触的对照细胞的增加，其中能增加所述活性或所述表达的试剂被鉴定为对神经退行性病症的治疗有用。

在另一实施方案中，本发明提供鉴定对预防或治疗对象中的神经退行性病症有用的试剂的方法，所述方法包括：(a)使细胞与试剂接触；以及(b)检测细胞中的Nix多肽和/或GABARAP-L1多肽的生物活性或表达相对于未与所述试剂接触的对照细胞的增加，或者(c)检测细胞中编码Nix多肽和/或GABARAP-L1多肽的多核苷酸的表达相对于未与所述试剂接触的对照细胞的增加，其中能增加所述活性或所述表达的试剂被鉴定为对治疗神经退行性病症有用。

若需要，可以对通过该方法(或任何其它适当的方法)分离得到的试剂进一步纯化(例如，通过高效液相色谱法)。此外，可以测试此类候选试剂用于在神经元细胞中调节线粒体自噬的能力。在其它实施方案中，通过鉴定线粒体功能的增加、细胞死亡的减少、或细胞存活的增加来测量所述试剂的活性。可以将通过该方法分离得到的试剂例如用作治疗剂以治疗对象中与线粒体功能障碍相关的神经退行性病症。

本领域技术人员理解，通常将候选化合物对包含有缺陷的线粒体自噬的细胞的影响，与候选化合物不存在下的相应对照细胞进行比较。

候选试剂包括小分子、肽、肽模拟物、多肽和核酸分子。还可以将本文列出的序列中的每一个用于发现和发展治疗神经退行性病症的治疗化合物。针对表达可将编码的蛋白用作药物筛选的靶标。另外，编码该编码的蛋白的氨基端区域的DNA序列、或各mRNA序列的Shine-Delgarno序列或其它翻译促进序列，可以用来构建促进目标编码序列表达的序列。通过标准技术(同上的Ausubel et al.)可以分离得到此类序列。本发明的小分子的分子量，优选小于2,000道尔顿，更优选地300至1,000道尔顿，以及最优选地400至700道尔顿。优选这些小分子是有机分子。

本发明还包括通过上述筛选分析鉴定的新试剂。任选地，将此类试剂表征在一个或多个合适的动物模型中，以测定化合物对神经退行性病症的治疗功效。期望地，动物模型中的特征还可以用来确定用此类化合物治疗的毒性、副作用或作用机制。而且，在任何上述筛选分析中鉴定的新试剂，可以用于治疗对象中的神经退行性病症。此类试剂可单独使用或者与本领域已知的其它常规疗法联合使用。

用于筛选的细胞

在一个实施方案中，在包含parkin或PINK1中的突变的细胞中进行本文所描述的筛选。

在另一实施方案中，在具有神经元特征的多巴胺能细胞中进行本文所描述的筛选。此类细胞是本领域已知的，并且包括，例如，BE(2)-M17成神经细胞瘤细胞(Martin et al.,J Neurochem.2003Nov；87(3):620-30)、Cath.a-differentiated(CAD)细胞(Arboleda et al.,J Mol Neurosci.2005；27(l):65-78)、CSM14.1(Haas et al.,J Anat.2002Jul；201(l):61-9)、MN9D(Chen et al.,Neurobiol Dis.2005Aug；19(3):419-26)、N27细胞(Kaul et al.,J Biol Chem.2005Aug5；280(31):28721-30)、PC12(Gorman et al.,Biochem Biophys Res Commun.2005Feb 18；327(3):801-10)、SN4741(Nair et al.,Biochem J.2003Jul l；373(Pt l):25-32)、CHP-212、SH-SY5Y和SK-N-BE。在可选的实施方案中，本文所描述的筛选可以在源自干细胞、iPS细胞或祖细胞的多巴胺能细胞中进行。

在另一实施方案中，本文所描述的筛选可以在神经元、成纤维细胞、嗅觉神经球或神经祖细胞、或者源自成纤维细胞或嗅觉神经球或神经祖细胞的神经元中进行。

测试试剂和提取物

通常，根据本领域已知的方法，从天然产物或合成(或半合成)提取物的大文库或者化学文库，或者从多肽或核酸文库鉴定能够调整线粒体自噬的试剂。药物发现和研发领域的技术人员将理解，测试提取物或试剂的明确来源对于本发明的筛选程序不是关键的。用于筛选的试剂可以包括已知的试剂(例如，用于其它疾病或病症的已知治疗剂)。可选地，实际上，使用本文所描述的方法可以筛选任意数量的未知化学提取物或试剂。此类提取物或试剂的实例包括但不限于：基于植物、真菌、原核生物或动物的提取物，发酵液和合成试剂，以及既有试剂的修饰物。

众多方法还可用于产生化学试剂的任意数量的随机或直接的合成物(例如，半合成物或完全合成物)，其包括但不限于：基于糖类、脂类、肽和核酸的试剂。合成的化合物文库可商购自：Brandon Associates(Merrimack,N.H.)和Aldrich Chemical(Milwaukee,Wis.)。可选地，使用本领域技术人员已知的标准合成技术和方法学，可以从容易获得的起始材料合成待用作候选试剂的化学试剂。用于合成通过本文所描述的方法鉴定的试剂的合成化学转化和保护基方法学(保护和去保护)，是本领域已知的并且包括，例如，在R.Larock,Comprehensive Organic Transformations,VCH Publishers(1989)；T.W.Greene and P.G.M.Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis,2nd ed.,John Wiley and Sons(1991)；L.Fieser and M.Fieser,Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis,John Wiley and Sons(1994)；和L.Paquette,ed.,Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis,John Wiley and Sons(1995)，以及其后面的版本中所描述的那些。

可选地，细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然试剂的文库，可商购自包括Biotics(Sussex,UK)、Xenova(Slough,UK)、Harbor Branch Oceanographic Institute(Ft.Pierce,Fla.)和PharmaMar,U.S.A.(Cambridge,质量.)的许多来源。此外，若需要，根据本领域已知的方法，例如，通过标准提取和分级分离方法，产生天然和合成产生的文库。用于合成分子文库的方法的实例可见于本领域，例如见于DeWitt et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:6909,1993；Erb et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91:11422,1994；Zuckermann et al.,J.Med.Chem.37:2678,1994；Cho et al.,Science 261:1303,1993；Carrell et al.,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2059,1994；Carell et al.,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2061,1994；和Gallop et al.,J.Med.Chem.37:1233,1994。而且，若需要，使用标准的化学、物理或生物化学方法，容易修饰任何文库或化合物。

试剂的文库可呈现为以下形式：溶液(例如，Houghten,Biotechniques 13:412-421.1992)、或者磁珠上(Lam,Nature354:82-84,1991)、芯片上(Fodor,Nature 364:555-556,1993)、细菌(Ladner，美国专利第5,223,409号)、孢子(Ladner美国专利第5,223,409号)、质粒(Cull et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:1865-1869,1992)、或者噬菌体上(Scott and Smith,Science249:386-390,1990；Devlin,Science 249:404-406,1990；Cwirla et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:6378-6382,1990；Felici,J.Mol.Biol.222:301-310,1991；同上的Ladner)。

此外，药物发现和研发领域的技术人员容易理解去重复的方法(例如，分类去重复、生物去重复和化学去重复，或者其任意组合)，或者应当尽可能消除重复物或已知其活性的材料的重复。

当鉴定了目标粗提取物时，需要进一步分级分离阳性先导提取物，以分离导致观察到的效果的化学组分。因此，提取、分级分离和纯化过程的目标是，仔细定性和鉴定粗提取物内改变编码与Nix介导的线粒体自噬相关多肽的基因的转录活性的化学实体。分级分离和纯化此类异质提取物的方法是本领域已知的。若需要，根据本领域已知的方法，对显示可用作治疗神经退行性病症的治疗剂的试剂进行化学修饰。

药物疗法

本发明提供用于治疗神经退行性病症的增加Nix和/或GABARAP-L1的表达或活性的试剂，包括上文鉴定的筛选中鉴定的试剂。在一个实施方案中，本发明提供包含编码Nix和/或GABARAP-L1多肽的表达载体的药物组合物。在另一实施方案中，使用本文描述的方法发现具有医学价值的化学实体，可用作药物或用作例如，通过合理的药物设计来对既有试剂进行结构修饰的信息。对于治疗用途，可以全身施用使用本文公开的方法鉴定的组合物或试剂，例如，在药学可接受的载体中配制。优选的施用途径包括，例如，皮下施用、静脉内施用、腹膜内施用、肌肉内施用或皮肤内注射、鼻内(例如鼻喷雾)施用或经皮(例如局部贴剂)施用，所述施用在患者中提供持续、持久的药物水平。将使用在生理可接受载体中的治疗有效量的神经退行性病症治疗剂，进行人患者或其它动物的治疗。合适的载体及其制剂描述于，例如，E.W.Martin的雷明顿药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)。待施用的治疗试剂的量根据施用方式、患者的年龄和体重、以及神经退行性病症的临床症状而改变。通常，量将在用于治疗线粒体疾病的其它试剂的量的范围中，尽管在某些情况下，由于化合物特异性的增加会需要较少的量。将化合物以控制神经退行性病症的临床或生理症状的剂量施用，如通过本领域技术人员已知的诊断方法，或使用测量与神经退行性病症相关、或与Nix介导的线粒体自噬相关的基因(例如，Nix)的转录调控的任何分析所测定的。

药物组合物制剂

用于治疗神经退行性病症的本发明的试剂或其类似物的施用，可以是导致与其它组分组合的治疗剂的浓度在缓解、减轻或稳定神经退行性病症或其症状中有效的任何合适的手段。在一个实施方案中，试剂的施用降低细胞中有功能障碍或有缺陷的线粒体的百分比和/或增加健康线粒体的百分比。

施用此类试剂的方法是本领域已知的。本发明提供通过本领域已知的任何手段来治疗性施用试剂。所述化合物可以以任何合适的量包含在任何合适的载体物质中，并且通常按重量计以所述组合物总重量的1％-95％的量存在。该组合物可以以适合于肠胃外(例如，皮下、静脉内、肌肉内或腹膜内)施用途径的剂型提供。可以根据常规的药物实践来配制该药物组合物(参见，例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy(20th ed.),ed.A.R.Gennaro,Lippincott Williams&Wilkins,2000and Encyclopedia of Pharmaceutical Technology,eds.J.Swarbrick and J.C.Boylan,1988-1999,Marcel Dekker,New York)。合适的制剂包括：经口施用的形式，储库制剂，通过贴剂递送的制剂，待被局部、经鼻或经皮递送的半固体剂型。

可以将根据本发明所述的药物组合物配制成，当施用时基本上立即释放活性化合物，或者在施用后任意预定的时间或时间段释放活性化合物。后者的组合物类型通常被称为缓释制剂，其包括：(i)在延长的时间段内在身体中产生基本上恒定浓度的药物的制剂；(ii)在预定的滞后时间之后，在延长的时间段内在身体中产生基本上恒定浓度的药物的制剂；(iii)通过在身体中维持相对恒定有效的水平，在预定时间段期间维持作用，并伴有与活性物质在血浆水平中的波动(锯齿形动力学模式)相关的不良副作用最小化的制剂；(iv)通过，例如邻近或处在中枢神经系统或脑脊液中的缓释组合物的空间放置来集中作用的制剂；(v)允许方便的给药，以便例如每一周或两周施用一次剂量的制剂；以及(vi)通过使用载体或化学衍生物以将治疗试剂递送至特定细胞类型(例如，处于细胞死亡风险的神经元细胞)来靶向神经退行性病症的制剂，所述特定细胞类型的功能受神经退行性病症干扰。对于一些应用，缓释制剂避免了在一天中频繁给药以将血浆水平维持在治疗水平的需求。可以采用多种策略中的任一种，以便获得其中释放速率超过所讨论化合物的新陈代谢速率的缓释。在一个实例中，通过适当选择各种制剂的参数和成分，包括，例如，各种类型的缓释组成和包衣来获得缓释。因此，将治疗剂与合适的赋形剂一起配制进药物组合物，当施用时，所述药物组合物以受控的方式释放治疗剂。实例包括单个单元或多个单元片剂或胶囊组成、油类溶液、悬液、乳剂、微胶囊、微球体、分子复合物、纳米颗粒、贴剂和脂质体。

肠胃外组合物

通过注射、输注或植入(皮下、静脉内、肌肉内、腹膜内等)以剂型、制剂、或者经合适的递送装置或含有常规的无毒药学可接受的载体和佐剂的植入物的方式，经肠胃外施用药物组合物。此类组合物的配制和制备是药物配制领域的技术人员熟知的。

用于肠胃外使用的组合物，可以以单元剂型(例如，单剂量安瓿瓶)，或含有数个剂量且可以添加合适防腐剂的小瓶的形式提供(参见下文)。组合物可以是溶液、悬液、乳剂、输注装置、或用于植入的递送装置的形式，或者其可以以在使用之前用水或其它合适的媒介物复溶的干粉的形式存在。除活性治疗剂以外，组合物可以包含合适的肠胃外可接受的载体和/或赋形剂。可以将活性治疗剂掺入用于缓释的微球体、微胶囊、纳米颗粒、脂质体等。而且，组合物可以包含悬浮剂、溶解剂、稳定剂、pH调节剂、张力调节剂和/或分散剂。

如上所示，本发明所述的药物组合物可以是适于无菌注射的形式。为了制备此类组合物，将合适的活性治疗剂溶解或悬浮于肠胃外可接受的液体媒介物中。

缓释的肠胃外组合物

缓释的肠胃外组合物可以是悬液、微球体、微胶囊、磁性微球体、油类溶液、油类悬液或乳剂的形式。可选地，可以将活性药物掺入生物相容的载体、脂质体、纳米颗粒、植入物或输注装置中。用于制备微球体和/或微胶囊的材料是，例如，生物可降解的生物蚀解聚合物，如泌乳过多的(polygalactia)聚(氰基丙烯酸异丁酯)、聚(2-羟乙基-L-谷氨酰胺)和聚(乳酸)。当配制缓释的肠胃外制剂时，可以使用的生物相容的载体是碳水化合物(例如，葡聚糖)、蛋白(例如，白蛋白)、脂蛋白或抗体。用于植入物的材料可以是非生物可降解的(例如，聚二甲基硅氧烷)、或生物可降解的(例如，聚(己内酯)、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)或聚(原酸酯)或以上的组合物)。

用于经口使用的固体剂型

用于经口使用的制剂包括在具有无毒的药学可接受的赋形剂的混合物中含有活性成分的片剂。此类制剂是技术人员已知的。赋形剂可以是，例如，惰性稀释剂或填充剂(例如，蔗糖、山梨糖醇、糖、甘露糖醇、微晶纤维素、淀粉包括马铃薯淀粉、碳酸钙、氯化钠、乳糖、磷酸钙、硫酸钙或磷酸钠)；成粒剂和崩解剂(例如，纤维素衍生物(包括微晶纤维素)、淀粉(包括马铃薯淀粉)、交联羧甲基纤维素钠、海藻酸盐或藻酸)；粘合剂(例如，蔗糖、葡萄糖、山梨糖醇、阿拉伯树胶、藻酸、海藻酸钠、明胶、淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、硅酸镁铝、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮或聚乙二醇)；以及润滑剂；助流剂以及抗结合剂(例如，硬脂酸镁、硬脂酸锌、硬脂酸、二氧化硅、氢化植物油或滑石粉)。其它药学可接受的赋形剂可以是着色剂、调味剂、增塑剂、湿润剂、缓冲剂等。

片剂可以是无包被的，或者可以通过已知的技术将它们包被以任选地延迟在胃肠道中的崩解和吸收从而在较长的时期内提供持久的作用。可以使包衣适于以预定模式释放活性药物(例如，为了得到缓释的制剂)，或者使其直到通过胃之后才释放活性药物(肠溶包衣)。包衣可以是糖包衣、薄膜包衣(例如，基于羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、甲基羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、丙烯酸酯共聚物、聚乙二醇和/或聚乙烯吡咯烷酮)、或者肠溶包衣(例如，基于甲基丙烯酸共聚物、邻苯二甲酸醋酸纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素醋酸琥珀酸酯、聚醋酸乙烯邻苯二甲酸酯、虫胶和/或乙基纤维素)。

而且，可以使用时延材料如，例如，单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。

固体片剂组合物可以包含适于保护组合物抵抗有害化学变化(例如，在释放活性的神经退行性病症治疗物质前的化学降解)的包衣。可以将包衣以类似于上文的药剂百科全书(Encyclopedia of Pharmaceutical Technology)中所述描述的方式应用在固体剂型上。

可以将至少两种活性的神经退行性病症治疗剂在片剂中一起混合，或者可以将其分开。在一个实例中，第一活性治疗剂包含在所述片剂的内部，以及第二活性治疗剂在外部，使得大部分的第二活性治疗剂在第一活性治疗剂的释放之前释放。

用于经口使用的制剂还可作为以下形式存在：咀嚼片或硬明胶胶囊，其中活性成分与惰性固体稀释剂(例如，马铃薯淀粉、乳糖、微晶纤维素、碳酸钙、磷酸钙或高岭土)混合，或者软明胶胶囊，其中活性成分与水或油类媒介(例如，花生油、液状石蜡或橄榄油)混合。可以按常规方式使用例如混合器、流化床设备或喷雾干燥装备，利用以上提及的片剂和胶囊的成分制备粉末和颗粒。

缓释经口剂型

可以将用于经口使用的缓释组合物制备成通过控制活性物质的溶解和扩散来释放神经退行性病症活性治疗剂。通过试剂的片剂、胶囊、小球或粒状制剂的合适包衣，或者通过将化合物掺入适当的基质，可以实现溶解或扩散缓释。缓释包衣可以包含以上提及的包衣物质中的一种或多种，和/或例如，虫胶、蜂蜡、糖蜡(glycowax)、蓖麻蜡、巴西棕榈蜡、十八烷醇、单硬脂酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯、棕榈硬脂酸甘油酯、乙基纤维素、丙烯酸树脂、DL-聚乳酸、醋酸丁酸纤维素、聚氯乙烯、聚乙酸乙烯酯、乙烯吡咯烷酮、聚乙烯、聚甲基丙烯酸酯、异丁烯酸甲酯、2-羟基甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯水凝胶、1,3-丁二醇、甲基丙烯酸乙二酯和/或聚乙二醇。在缓释的基质制剂中，基质材料还可以包括，例如，水合甲基纤维素、巴西棕榈蜡和十八烷醇、卡波姆934、硅酮、三硬脂酸甘油酯、丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸甲酯、聚氯乙烯、聚乙烯和/或卤代的碳氟化合物。

含有一种或多种治疗剂的缓释组合物，还可以是漂浮片或胶囊的形式(即，当经口施用时在胃内容物顶部漂浮一定时间的片剂或胶囊)。可以通过使化合物与赋形剂和20-75％w/w水解胶体(如羟乙基纤维素、羟丙基纤维素或羟丙基甲基纤维素)的混合物成粒来制备化合物的漂浮片制剂。然后，可以将获得的颗粒压缩成片剂。在与胃液接触时，片剂在其表面周围形成基本上不透水的凝胶屏障。该凝胶屏障参与维持小于1的密度，从而允许所述片剂在胃液中保持漂浮。

局部施用形式

用于以半固体局部施用本发明试剂的剂型包括软膏、糊剂、乳霜、洗液和凝胶。可以与粘膜粘着剂聚合物一起配制该剂型，以用于在皮肤应用区域处持续释放活性成分。可以将活性化合物在无菌条件下与药学可接受的载体以及可能需要的任何防腐剂、缓冲液或推进剂一起混合。通过将目标化合物与通常用于局部的液体制剂、乳霜制剂和凝胶制剂的常规药物稀释剂和载体组合，可以制备此类局部制备物。

随着添加合适的增稠剂和/或胶凝剂，可以将软膏和乳霜例如与水状基质或油状基质一起配制。此类基质可以包括水和/或油，例如，液状石蜡、植物油(如花生油或蓖麻油)。根据基质的性质，可以使用的增稠剂包括软石蜡、硬脂酸铝、十六十八醇、丙二醇、聚乙二醇、羊毛脂、氢化羊毛脂、蜂蜡等。

可以将洗液与水状基质或油状基质一起配制，并且通常还包含以下的一种或多种：稳定剂、乳化剂、分散剂、悬浮剂、增稠剂、着色剂、香料等。软膏、糊剂、乳霜和凝胶还可以包含赋形剂，所述赋形剂包括但不限于：动物和植物脂肪、油类、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、皂土、硅酸、滑石粉和氧化锌或者以上的混合物。

根据该试剂，合适的赋形剂包括：矿脂、羊毛脂、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、海藻酸钠、卡波姆、甘油、乙二醇、油类、甘油、苯酸盐、对羟苯甲酸酯和表面活性剂。本领域技术人员显而易见的是，具体化合物的溶解性将部分决定如何配制化合物。水凝胶制剂适合于水溶剂。当化合物不以活性所需浓度溶于水中时，乳霜或软膏制备物通常是优选的。在该情况下，可能需要油相、水相/有机相和表面活性剂来制备所述制剂。因此，基于溶解性和赋形剂主动相互作用信息，可以设计剂型并且可以选择赋形剂来配制原型制备物。

局部药物组合物还可以包含一种或多种防腐剂或抑菌剂，例如，羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、氯甲酚、苯扎氯铵等。局部药物组合物还可以含有其它活性成分，其包括但不限于：抗菌剂(特别是抗生素)、麻醉剂、止痛剂和止痒剂。

剂量

通过从用于小鼠的化合物的量进行推算可以最初确定人的剂量，如技术人员认为，相比于动物模型改变用于人的剂量是本领域常规的。在某些实施方案中，预期剂量的变化可以是约1mg化合物/Kg体重至约5000mg化合物/Kg体重；或者约5mg/Kg体重至约4000mg/Kg体重、或约10mg/Kg体重至约3000mg/Kg体重；或者约50mg/Kg体重至约2000mg/Kg体重；或者约100mg/Kg体重至约1000mg/Kg体重；或者约150mg/Kg体重至约500mg/Kg体重。在其它实施方案中，该剂量可以是约1、5、10、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000mg/Kg体重。在其它实施方案中，预期可以使用更高的剂量，此类剂量的范围可以是约5mg化合物/Kg体重至约20mg化合物/Kg体重。在其它实施方案中，该剂量可以是约8、10、12、14、16或18mg/Kg体重。当然，如在此类治疗方案中常规进行的，根据最初临床试验的结果和具体患者的需求，可以上调或下调该剂量的量。

治疗方法

本发明提供通过经Nix介导的线粒体自噬调整有功能障碍或有缺陷的线粒体的消除来治疗神经退行性病症或其症状的方法。所述方法包括将治疗有效量的药物组合物施用至对象(例如，哺乳动物如人)，所述药物组合物包含使用本文描述的方法调整从细胞清除有功能障碍或有缺陷的线粒体的试剂。因此，一个实施方案是治疗患有或易患神经退行性病症的对象的方法。所述方法包括在治疗病症的条件下向对象施用治疗有效量的足以治疗所述病症的本文描述的试剂的步骤。

本文的方法包括向对象(包括被鉴定为需要此类治疗的对象)有效量本文描述的试剂，或者产生此类效果的本文描述的组合物。鉴定需要此类治疗的对象可以是对象或健康护理专业人员的判断，以及可以是主观的(例如意见)或客观的(例如通过测试或诊断方法测量)。

本发明的治疗方法(包括预防性治疗)通常包括向有此需要的对象(例如，动物、人)，包括哺乳动物，特别是人施用治疗有效量的本文的试剂。此类治疗将适于施用至患有、患、易患神经退行性病症或者处于发展神经退行性病症风险的对象，特别是人。

通过诊断测试或者对象或健康护理提供者的意见(例如，遗传测试、酶或蛋白标志物、家族史等)产生的任何客观或主观测定，可以确定“处于风险”的那些对象。

在一个实施方案中，本发明提供监测治疗进程的方法。所述方法包括测定对象中的Nix和/或GABARAP-L1表达水平或其它诊断测量(例如，筛选，分析)水平的步骤，所述对象患有神经退行性病症或者处于发展神经退行性病症的风险，其中所述对象已施用足以治疗病症或其症状的治疗量的本文所描述的试剂。可以将在所述方法中测定的表达水平，与在健康正常对照或在其它受折磨患者中的已知表达水平相比较，以确立对象的疾病状态。在优选的实施方案中，在比第一水平测定晚的时间点测定在对象中表达的第二水平，并且将两个水平进行比较，以监测疾病进程或疗法功效。在某些优选实施方案中，在开始本发明所述的治疗之前，测定对象中表达的预处理水平；然后将标志物的该预处理水平与在治疗开始后对象中的标志物水平进行比较，以确定治疗的功效。提供以下实施例以说明本发明，而不是限制本发明。本领域技术人员将理解，可用与以上描述的发明一致的许多方式改变下文提供的具体构建，同时保留所述试剂或其组合的关键特性。

试剂盒

本发明提供用于治疗或预防神经退行性病症的试剂盒。在一个实施方案中，所述试剂盒包含治疗性或预防性组合物，所述组合物包含有效量的单位剂型的本发明试剂(例如，增加细胞中的Nix介导的线粒体自噬的试剂，包括增加Nix的表达和/或活性的试剂；Nix多肽或者其片段或变体，和/或GABARAP-L1多肽或者其片段或变体，或者编码Nix多肽或者其片段或变体和/或GABARAP-L1多肽或者其片段或变体的表达载体)。在一些实施方案中，所述试剂盒包含容纳有治疗性或预防性化合物的无菌容器；此类容器可以是盒、安瓿瓶、瓶、小瓶、管、袋、小袋、泡罩包装或本领域已知的其它合适容器形式。此类容器可以由塑料、玻璃、多层纸、金属箔或适于保存药物的其它材料制成。

若需要，将本发明的试剂与施用它的说明书一起提供给患神经退行性病症或者处于发展神经退行性病症风险的对象。该说明书通常包含关于使用治疗或预防神经退行性病症的组合物的信息。在其它实施方案中，该说明书包括以下的至少一项：化合物的描述；用于治疗或预防神经退行性病症或其症状的剂量安排和施用；注意事项；警告；适应症；禁忌；过剂量信息；不良反应；动物药理；临床研究；和/或参考。说明书可以直接打印在容器上(当存在时)，或为张贴至容器的标签，或为在容器中或随容器供应的单独纸张、小册子、卡片或目录。

组合疗法

任选地，可以将具有治疗或预防功效的试剂与用于治疗神经退行性病症的任何其它标准疗法联合施用。若需要，本发明的试剂可以单独施用，或者与对治疗神经退行性病症有用的常规治疗联合施用。例如，对治疗帕金森病有用的治疗剂包括但不限于：苄甲炔胺(deprenyl)、金刚烷胺或抗胆碱能的药物、左旋多巴、卡比多巴(carbidopa)、恩他卡朋(entacapone)、普拉克索、雷沙吉兰(rasagiline)、抗组胺、抗抑郁剂、多巴胺激动剂、单胺氧化酶抑制剂(MAOI)以及其它。

除非另有说明，本发明的实践使用常规的分子生物学技术(包括重组技术)、微生物学技术、细胞生物学技术、生物化学技术和免疫学技术，这些都在本领域技术人员的能力范围内。此类技术在文献中有充分地解释，如《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)，第二版(Sambrook，1989)；《寡核苷酸的合成》(Oligonucleotide sythesis)(Gait,1984)；《动物细胞培养》(Animal Cell culture)(Freshney,1987)；《酶学方法》(Methods in Enzymology)《实验免疫学手册》(Handbook of Experimental Immunology)(Weir,1996)；《哺乳动物细胞的基因转移载体》(Gene Transfer Vectors for Mammalian Cell)(Miller and Calos,1987)；《新编分子生物学实验指南》(Current Protocols in Molecular Biology)”(Ausubel,1987)；《PCR：聚合酶链式发应》(PCR:The Polymerase Chain Reaction)，(Mullis,1994)；《新编免疫性实验指南》(Current Protocols in Immunology)(Coligan,1991))。这些技术可用于产生本发明的多核苷酸和多肽，以及，同样地，在制备和实践本发明时可以考虑这些技术。

提出下述实施例以便为本领域普通技术人员提供如何制备和使用本发明的分析、筛选和治疗方法的完整公开和描述，并非旨在限制本发明人认为的本发明的范围。

实施例

实施例1.线粒体的功能在Parkin缺陷携带者的细胞中是正常的

发明人鉴定了不具有功能性Parkin蛋白的健康的parkin纯合突变携带者。由于线粒体是产生ATP形式能量的主要细胞器和受parkin突变影响的最初靶标，测定了来自Parkin缺陷突变携带者(其后称为“携带者”)和患者(缺乏功能性Parkin的复合杂合子；其后称为“患者”)的成纤维细胞中的线粒体ATP合成率。

方法

细胞培养

之前已描述了用于建立和培养人成纤维细胞和人嗅觉神经球细胞系的方案(Koentjoro,et al.,2012,Mov Disord 27(10),1299-303；Park,et al.,2011；Hum Mutat 32(8),956-64)。对于所有实验，对细胞进行传代至最多15代。

ATP合成率的评估

如之前描述，测定ATP合成率(Shepherd,et al.,2006)。简言之，通过胰蛋白酶化收获成纤维细胞，随后使用BCA蛋白分析试剂盒(Thermo Scientific,Rockford,IL,USA)，根据生产商的说明书测定总的蛋白浓度。将细胞以1mg/mL总蛋白稀释于细胞悬浮缓冲液(150mM KCl，25mM Tris-HCl pH 7.6，2mM EDTA pH 7.4，10mM KPO₄pH 7.4，0.1mM MgCl₂和0.1％(w/v)BSA(Sigma))中。通过将250μL细胞悬液与750μL底物缓冲液(10mM苹果酸，10mM丙酮酸盐，1mM ADP，40μg/mL毛地黄皂苷和0.15mM五磷酸腺苷(Sigma))于37℃孵育10分钟来诱导ATP的合成。该孵育之后，通过向50μL小份的反应混合物添加450μL煮沸的淬灭缓冲液(100mM Tris-HCl，4mM EDTA pH 7.75(Sigma))并且于100℃孵育2分钟来终止反应。将得到的反应混合物以1:10在淬灭缓冲液中进一步稀释，并且使用ATP生物发光测定试剂盒(Roche Diagnostics,Basel,Switzerland)，根据生产商的说明书，在FB10光度计(Berthold Detection Systems,Pforzheim,Germany)中测量ATP的量。

细胞毒性测试

根据生产商的方案，使用CytoTox 96非放射性细胞毒性分析试剂盒(Promega,Madison,WI,U.S.A.)测定细胞死亡。简言之，将人嗅觉神经球细胞以每孔50,000个细胞接种在24孔培养板中，并且培养48小时。然后将细胞暴露于增加剂量的鱼藤酮(Sigma；1.5μM、2.5μM和12.5μM)72小时。将50μL小份的培养基与底物混合物孵育30分钟。使用Benchmark酶标仪(Bio-Rad,Hercules,CA,U.S.A.)，于490nm用分光光度法测量乳酸脱氢酶(LDH)的活性。

结果

当与对照相比时(37.4±1.2)，在患者细胞中ATP合成率显著降低(31.4±3.0，p<0.05)，但是在携带者细胞中不显著降低(36.4±3.5)(图1A)。然后将细胞用鱼藤酮处理，以检查其在携带者细胞中的作用。鱼藤酮是线粒体复合体I抑制剂，并且显示增加线粒体功能障碍细胞(如Parkin相关的PD细胞模型)中的细胞毒性。当暴露于鱼藤酮时，患者的细胞呈现增加的毒性，而对照和携带者细胞类似地响应(图1B和1C)。

图1显示(A)当与对照相比时，在源自携带者的成纤维细胞中腺苷三磷酸(ATP)合成率是正常的，但是在患者的成纤维细胞中显著降低。(B)使用释放进培养基的乳酸脱氢酶(LDH)活性，测试人嗅觉神经球细胞对鱼藤酮的敏感性。当与对照(白色柱)相比时，增加剂量的鱼藤酮(0、1.5、2.5和12.5μM)以剂量响应模式显著地提高患者细胞(黑色柱)培养基中的LDH活性，而携带者(灰色柱)显示与对照细胞类似的细胞毒性程度。(C)人嗅觉神经球细胞中，鱼藤酮诱导的细胞死亡。使用以上描述的细胞毒性分析测试细胞对鱼藤酮的敏感性。当与对照(白色柱)和携带者细胞(灰色柱)相比时，增加剂量的鱼藤酮(0、1.5、2.5和12.5μM)以剂量响应方式显著降低患者细胞(黑色柱)中的细胞活力。在单因素方差分析和随后的事后Tukey’s HSD多重比较检验中，*；p<0.05，**；p<0.01和***；p<0.001。

这些结果表明患者中的线粒体功能障碍，但是在携带者细胞中保持线粒体的功能，尽管具有相同的Parkin缺陷病况。

实施例2.在携带者细胞中CCCP诱导的线粒体自噬是正常的。

在携带者细胞中观察到的正常线粒体功能，暗示了补偿Parkin损失的线粒体质量控制的正常功能。使用CCCP在携带者细胞中诱导线粒体自噬，并且使用三种不同方法的组合进行检查；通过柠檬酸合酶活性(线粒体基质酶)测量线粒体质量，通过实时定量PCR测量mtDNA含量，以及通过共聚焦显微镜共定位线粒体和自噬体。为了使用共聚焦显微镜在视觉上监测线粒体自噬，产生了表达自噬体标志物GFP-LC3和线粒体标志物RFP-Mito的成纤维细胞。

方法

慢病毒的产生和细胞系的建立

绿色荧光蛋白(GFP)标记LC3载体来自Ernst Wolvetang博士的惠赠。使用Lenti-X HTX慢病毒包装系统(Clontech,Mountain View,CA,USA)和Lipofectamine 2000(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)，根据生产商的说明书，产生表达GFP-LC3的慢病毒。在转染后48小时和72小时，收集含有慢病毒的培养基，随后在测量病毒滴度之前，使用Lenti-X浓缩器(Clontech)进行浓缩。

为了产生表达GFP-LC3的稳定细胞系，在4μg/mL聚凝胺(Sigma,St.Louis,MO,USA)的存在下，用1感染复数(MOI)的慢病毒转导成纤维细胞24小时，随后在含有2μg/mL杀稻瘟素(Invitrogen)的培养基中生长，用于筛选。

线粒体清除的评估

将成纤维细胞以每孔200,000个细胞接种在6孔培养板中，并且用10μM的DMSO或CCCP(Sigma)处理24小时，以通过降低线粒体膜的电位来诱导线粒体自噬。

为了测量线粒体质量，使用柠檬酸合酶分析试剂盒(Sigma)，根据生产商的说明书，测定柠檬酸合酶(线粒体基质酶)的活性。简言之，用细胞刮棒收获成纤维细胞，并且将其重悬于细胞裂解缓冲液(补充有蛋白酶抑制剂混合物的CelLytic M细胞裂解试剂(Sigma))，随后进行简短的超声处理。使用BCA蛋白分析试剂盒(Thermo Scientific)，根据生产商的说明书，在测定蛋白的浓度之后，将10μg总蛋白与底物缓冲液(1×分析缓冲液，300μM乙酰CoA，100μM 5，5′-二硫基-(2-硝基苯甲酸))混合，随后添加100μM草酰乙酸盐溶液以起始反应。在添加草酰乙酸盐溶液之前和之后，每10秒测定反应混合物于412nm(OD412)处的光吸收，持续1.5分钟。通过从添加草酰乙酸盐之后每分钟的OD412，减去添加草酰乙酸盐之前每分钟的OD412(本底活性)，来测定柠檬酸合酶活性。

使用如之前所报道的实时定量聚合酶链式反应(qPCR)(Parfait,et al.,1998)，进行线粒体DNA的定量。简言之，用细胞刮棒收获成纤维细胞。然后，使用QIAamp DNA Mini试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)，根据生产商的说明书，提取总DNA(即核DNA[nDNA]和线粒体DNA[mtDNA])。根据生产商的说明书，使用TaqMan基因表达预混液(Invitrogen)，在Rotor Gene 6000(Qiagen)上进行多重qPCR分析。用于反应的引物和TaqMan探针在下文表1中列出。使用Rotor-Gene 6000系列软件v.1.7，相对于nDNA计算mtDNA的量。

表1.用于定量线粒体DNA的引物和探针

使用共聚焦显微镜，进行线粒体和自噬体的共定位研究。简言之，将表达GFP-LC3的30,000个成纤维细胞接种至35mmμ-Dish培养皿(Ibidi,Martinsried,Germany)并且培养48小时，随后根据生产商的说明书，用CellLight Mitochondria-RFP BacMan 2.0(Invitrogen)进行转导以标记线粒体。24小时孵育之后，用20μM CCCP(Sigma)处理细胞4小时以诱导线粒体自噬，并且使用Leica TCS SP5II共聚焦显微镜(Leica Microsystems,Wetzlar,Germany)进行活细胞成像。得到来自至少两次独立实验的50个单个细胞的图像并进行分析。使用LAS-AF软件v.2.6.0(Leica Microsystems)，用以下的条件和运计测定共定位度：共定位度[％]＝共定位区域÷阈值和背景消除设为30％的前景区域；前景区域＝图像区域-背景区域。

结果

暴露于CCCP引起对照(相比于媒介物对照平均51.8％的降低，p<0.001)和携带者细胞(相比于媒介物对照38.7％的降低，p<0.001)中的线粒体质量显著降低，但是在患者细胞中没有引起显著降低(p＝0.16)。类似地，通过CCCP的处理，mtDNA的含量在对照(35.4％，p<0.01)和携带者细胞(27.6％，p<0.01)中显著减少，但是在患者细胞中不显著(p＝0.84)。在共聚焦显微镜中，在CCCP处理之前，观察到GFP-LC3和RFP-Mito之间最小限度的共定位(数据未示出)。当通过CCCP诱导线粒体自噬时，在对照和携带者的细胞中观察到GFP-LC3和RFP-Mito之间显著增加的共定位，其表示线粒体自噬提高，而此类变化在患者细胞中未观察到。共定位的定量揭示了患者细胞中的共定位度(8.6±9.5％，p<0.01)相比于对照(100±28.3％)显著较低，其暗示了有缺陷的线粒体自噬，而携带者细胞中观察到的共定位(101.9±36.5％)与对照细胞相当。

图2显示(A)相比于媒介物处理的相对物，柠檬酸合酶活性在对照和携带者的细胞中显著降低，但是在患者细胞中不显著。(B)从媒介物处理的细胞(黑色柱)或者用10μM CCCP(白色柱)处理24小时的细胞分离DNA，随后使用实时定量PCR进行线粒体DNA的定量。在CCCP处理之后，线粒体DNA(mtDNA)相对于核DNA(nDNA)的相对量，在对照和携带者的细胞中显著减少，但是在患者细胞中不显著。在双尾学生t-检验中，N.S；不显著，**；p<0.01，***；p<0.001。(C)将表达GFP-LC3(自噬体标志物，左图中的绿色荧光)和RFP-Mito(线粒体标志物，中间图中的红色荧光)的成纤维细胞，用20μM CCCP处理4小时。在对照和携带者的细胞中观察到GFP-LC3和RFP-mito(右图中的黄色点)之间高的共定位度，其表示线粒体自噬提高，但是在患者细胞中没有提高。比例尺：10μm。(D)从50个单个细胞计算共定位度。当与对照相比时，患者细胞呈现显著低的共定位度，而携带者细胞显示类似的程度。在单因素方差分析，随后事后Tukey’s HSD多重比较检验中，**；p<0.01。

实施例3.在携带者细胞中线粒体自噬和自噬异常激活的过程中缺乏Parkin功能的补偿

为了确认携带者细胞中线粒体自噬中缺乏对Parkin功能的补偿，评估了当CCCP处理时线粒体的Parkin募集和线粒体融合蛋白2(Mfn2)的泛素化。

方法

线粒体的分离

使用采用标准Dounce匀浆器和甘露糖醇-蔗糖-EDTA(MSE)缓冲液(25mM甘露糖醇，75mM蔗糖，100mM EDTA(Sigma))的方案，从成纤维细胞分离线粒体。简言之，通过胰蛋白酶消化收集细胞，并且将其在3mL冷MSE缓冲液中重悬。使用机动Dounce匀浆器(Kika Labortechnik，Staufen，Germany)裂解细胞。向匀浆液添加另外3ml MSE缓冲液，随后于4℃以600×g离心10分钟。然后将含有线粒体的上清液于4℃以12,000×g进一步离心15分钟，收集线粒体。在离心之后，保留上清液(“细胞溶质级分”)，并且根据生产商的说明书，通过具有9kDa分子量截留的离心蛋白浓缩器(Thermo Scientific)进行浓缩。同时，将含有线粒体的小球(“线粒体级分”)用1ml MSE缓冲液洗涤两次，并且最后重悬于60μL裂解缓冲液(补充有蛋白酶抑制剂混合物的CelLytic M细胞裂解试剂(Sigma))中。

蛋白印迹分析

使用XCell SureLock小型电泳槽电泳系统和XCell II印迹模块(Invitrogen)，通过蛋白印迹测定蛋白的表达。简言之，使用NuPAGE Novex 4％-12％Bis-Tris SDS/聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen)，对20至30μg总细胞裂解物或线粒体/细胞溶质级分进行电泳，并将其转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Thermo Scientific)。然后依次应用蛋白特异性一抗和缀合有辣根过氧化物酶的二抗来探测膜上有印迹的蛋白。分析中使用的抗体详述于下文表2中。使用SuperSignal West Pico或Femto化学发光底物(Thermo Scientific)产生化学发光，并使用LAS4000(Fujifilm,Tokyo,Japan)进行检测。

表2.在蛋白印迹分析中使用的抗体

TBST.具有Tweer20的Tris缓冲盐水。RT.室温

RNA的提取和实时定量RT-PCR分析

使用RNeasy小量提取试剂盒(Qiagen)，根据生产商的说明书，制备来自成纤维细胞的总RNA，然后根据生产商的说明书，用SuperScript III第一链合成系统(Invitrogen)将其反转录进cDNA。使用得到的cDNA，采用QuantiTect SYBR Green PCR试剂盒(Qiagen)，根据生产商的说明书，在Rotor Gene 6000(Qiagen)上以实时定量RT-PCR(qRT-PCR)的方式测定基因表达。反应中使用的引物在下文表3中列出。

表3.用于qRT-PCR分析的引物

结果

当暴露于CCCP时，Parkin在对照细胞的线粒体级分中高度累积，而在细胞溶质级分中的蛋白是减少的，表明线粒体的Parkin募集。此外，在CCCP处理之后，对照细胞显示泛素化Mfn2的增加且非泛素化形式的量减少，表明了Parkin-介导的泛素化和Mfn2的降解。然而，当CCCP处理时，在携带者细胞中没有观察到这些Parkin相关事件中的任一种，这确认了线粒体自噬过程中Parkin功能的缺乏。此外，在CCCP处理之前和之后，相比于对照，PINK1转录物的表达水平在携带者中没有升高，这支持了在携带者细胞中Parkin/PINK1介导的线粒体自噬缺乏补偿激活。此外，存在介导线粒体的非特异性降解的极度活跃自噬的可能性。因此，还通过监测CCCP处理时LC3-I向LC3-II(作为用于自噬功能的指示剂)的转化，测试这种可能性。而且，在别处已表明CCCP以与针对雷帕霉素相当的数量级的激活诱导HeLa细胞、HCT116细胞和MEF中的自噬。在检查的所有细胞系中，在CCCP处理之前和之后检测到LC3-II/β-肌动蛋白比值的类似增加，表明自噬机制在基础条件和/或诱导线粒体自噬条件下的功能正常。综合考虑，这些结果表明，携带者细胞中观察到的CCCP诱导的线粒体自噬不受PINK1/Parkin通路或自噬的异常激活介导，这暗示涉及独立于Parkin的线粒体自噬通路。

如图3所示，(A)从用媒介物或10μM CCCP处理6小时的成纤维细胞分离线粒体和细胞溶质级分，并且通过蛋白印迹测定Parkin和Mfn2的亚细胞定位。对于线粒体级分使用针对VDAC的抗体，以及对于细胞溶质级分使用针对β-肌动蛋白的抗体，确认了级分的质量。在对照细胞中，在基础条件下野生型50kDa Parkin主要存在于细胞溶质级分中。当暴露于CCCP时，Parkin的水平在线粒体级分中增加而在细胞溶质级分中减少，表明Parkin向线粒体的易位。在携带者细胞中不存在Parkin向线粒体的易位。在暴露于CCCP之后，在对照中观察到非泛素化形式Mfn2表达的降低以及泛素化形式(Ub-Mfn2)的存在，但是在携带者细胞中未观察到。Mito：线粒体级分；Cyto：细胞溶质级分；Mfn2：线粒体融合蛋白2；VDAC，电压依赖性阴离子通道。(B-D)将成纤维细胞在基础条件下培养，或者用10μM CCCP处理6小时，然后收集蛋白。(B)通过蛋白印迹来测定对照、携带者和患者细胞中LC3-I和LC3-II的表达，并且使用光密度法对条带进行定量。将β-肌动蛋白(42kDa)用作上样对照。(C)当进行CCCP处理时，相比于未处理组，LC3-II/β-肌动蛋白比值的水平显著增加；然而，在细胞系之间不存在差异。CCCP诱导LC3-I向LC3-II的转化。在双尾学生t-检验中，*；p<0.05，以及**；p<0.01。(D)当与对照相比时，在CCCP处理之前和之后，PINK1的表达在携带者和患者细胞中减少。在单因素方差分析，随后的事后Tukey’s HSD多重比较检验中，*；p<0.05，以及**；p<0.01。

实施例4.在携带者细胞中Nix和GABARAP-L1的表达水平是升高的

为了评估Nix介导的线粒体自噬是否为携带者细胞中由CCCP诱导的线粒体自噬增加的原因，使用qRT-PCR评估基础条件和CCCP处理条件下Nix、GABARAP-L1和GABARAP-L2的表达水平。

方法

在提取总RNA以及cDNA合成之前，将成纤维细胞在基础条件下培养，或者用10μM CCCP处理6小时。通过qRT-PCR测定Nix、GABARAP-L1和GABARAP-L2的表达。

结果

在基础条件下，Nix的表达在对照和携带者细胞之间是相当的，但是当通过CCCP诱导线粒体自噬时，其在携带者细胞中显著增加(p<0.01)。在两种条件下，当与对照相比时，携带者细胞还显示升高水平的GABARAP-L1，但GABARAP-L2的表达减少。另一方面，甚至在CCCP处理之后，当与对照细胞相比时，发现这些基因的表达在患者细胞中维持显著较低。综合考虑，这些结果表示在携带者细胞中Nix被CCCP处理诱导和其结合伴侣GABARAP-L1的高表达水平，这暗示它们涉及替代性线粒体自噬。

图4显示(A)基础条件下，在对照和携带者的细胞中Nix的表达是类似的，但是在患者细胞中显著降低。当与对照和患者细胞相比时，在携带者细胞中观察到升高水平的GABARAP-L1。当与对照相比时，在携带者和患者细胞中GABARAP-L2的表达显著减少。(B)在CCCP处理条件下，当与对照相比时，携带者细胞显示Nix和GABARAP-L1显著高的表达，但GABARAP-L2没有显著高的表达。当与对照和携带者的细胞相比时，在患者细胞中Nix、GABARAP-L1和GABARAP-L2的表达保持显著降低。在单因素方差分析，随后的事后Tukey’s HSD多重比较检验中，*；p<0.05，以及**；p<0.01。

实施例5.Nix的敲除损伤了在携带者细胞中CCCP诱导的线粒体自噬

为了确认Nix涉及CCCP诱导的线粒体自噬，我们使用siRNA使Nix沉默，并且评估在CCCP诱导的线粒体自噬中的变化。

方法

siRNA介导的Nix敲除

使用Dharmacon ON-TARGET加SMART pool-人BNIP3L(称为Nix siRNA；Thermo Scientific,#L-011815-00-0005)和DharmaFECT1siRNA转染试剂(Thermo Scientific,#T-2001-01)，根据生产商的说明书，进行成纤维细胞中Nix的敲除。将ON-TARGET加非靶向siRNA#1(称为杂乱(scramble)siRNA；Thermo Scientific,#D-001810-01-05)用作阴性对照。

转染后48小时，分别使用qRT-PCR和蛋白印迹，在mRNA和蛋白水平确认基因敲除。靶mRNA水平大于95％的减少被认为是成功敲除。

结果

siRNA转染后48小时，Nix的表达水平在mRNA水平(>95％)和蛋白水平显著降低，表示成功敲除。暴露于CCCP后，转染有杂乱siRNA的细胞显示由柠檬酸合酶活性测量的线粒体质量的显著降低(相比于各自的媒介物对照，在对照细胞中63.0％的降低，p<0.001，在携带者细胞中30.1％的降低，p<0.05)，表示正常的线粒体自噬。然而，Nix siRNA的转染废除了携带者中的线粒体质量的降低，但在对照细胞中没有废除(对照细胞中47.6％的降低，p<0.01，以及携带者细胞中8.5％的降低，p＝0.15)。对转染有杂乱siRNA的细胞中mtDNA含量的评估(对照细胞中20.7％的降低，p<0.001，以及携带者中33.0％的降低，p<0.05)，以及转染有Nix siRNA的细胞中mtDNA含量的评估(对照细胞中36.0％的降低，p<0.01，以及在携带者细胞8.1％的降低，p＝0.39)，获得类似的结果。此外，当通过CCCP诱导线粒体自噬时，相比于转染有杂乱siRNA的细胞，转染有Nix siRNA的携带者细胞显示GFP-LC3和RFP-mito共定位的显著减少，而在基础条件下，观察到转染有杂乱siRNA和Nix siRNA的携带者细胞之间类似较低的共定位度(数据未示出)。共定位的定量揭示，当与各自的杂乱siRNA细胞相比时，在Nix siRNA感染的携带者细胞中的显著降低(63.0％的降低，p<0.001)，这表明CCCP诱导的线粒体自噬的损伤。综合考虑，这些结果表示，在具有Parkin功能损失的携带者细胞中，Nix促进CCCP诱导的线粒体自噬。

图5显示在mRNA水平(A)和蛋白水平(B)确认了Nix的成功敲除。(C和D)在Nix敲除之后，从媒介物处理的细胞或用10μM CCCP处理24小时的细胞制备细胞裂解物和DNA。(C)使用柠檬酸合酶分析来测量线粒体质量。当CCCP处理时，柠檬酸合酶的活性在用杂乱siRNA处理的细胞和Nix siRNA处理的对照细胞中显著降低，但在用Nix siRNA处理的携带者细胞中没有显著降低。(D)线粒体DNA的定量显示，在CCCP处理之后，mtDNA针对nDNA的相对量在杂乱siRNA处理的细胞和Nix siRNA处理的对照细胞中显著减少，但在用Nix siRNA处理的携带者细胞中没有显著减少。在双尾学生t-检验中，NS；不显著，*；p<0.05，**；p<0.01，***；p<0.001。(E)将表达GFP-LC3(自噬体标志物，左图中的绿色荧光)和RFP-Mito(线粒体标志物，中间图中的红色荧光)的成纤维细胞，用25nM杂乱siRNA或Nix siRNA处理。在siRNA转染后72小时，将细胞与20μM CCCP孵育4小时以诱导线粒体自噬。在CCCP的处理下，在用杂乱siRNA处理的携带者细胞中观察到GFP-LC3和RFP-Mito之间的高共定位度(右图中的黄点)，这表示升高的线粒体自噬，而Nix siRNA损害了携带者细胞中的线粒体自噬。比例尺：10μm。(F)从50个单个细胞的图像计算共定位度。在CCCP的处理下，当与杂乱siRNA处理的相对物相比时，Nix siRNA处理的携带者细胞呈现显著低的共定位度。双尾学生t-检验中，***；p<0.001。

实施例6.患者细胞中Nix表达的特异性诱导恢复了线粒体自噬

为了确认Nix表达和CCCP诱导的线粒体自噬之间的关系，相对于对照和携带者的细胞，我们增加了Nix表达缺陷细胞中Nix的表达，并且评估了CCCP诱导的线粒体自噬中的变化。

方法

Nix的表达增加

为了评估豆蔻酸佛波醇乙酸酯(PMA)对Nix表达的影响，将对照细胞和患者细胞(“先证者”)暴露于PMA(10nM或20nM)24小时。24小时之后收获细胞，并且通过如上概述的蛋白印迹测定Nix和GABARAP-L1蛋白的表达。

使用如上概述的方法，评估诱导Nix的表达对线粒体自噬的功能性影响。将患者细胞用CCCP和PMA共处理24小时，并且经通过柠檬酸合酶活性测量的线粒体质量以及通过实时定量PCR测量的mtDNA含量来检查线粒体自噬。用于该分析的细胞包括如上文所描述的“患者”细胞，以及分离自被鉴定在c.1309T>G(p.W437G)处具有PINK1纯合突变-“PINK1突变(PINK1mut)”的PD患者个体的细胞。

结果

图6显示，通过蛋白印迹来测定对照和患者细胞中Nix(A-B)和GABARAP-L1(C-D)的表达，并且使用光密度法对条带进行定量。将β-肌动蛋白(42kDa)用作上样对照。当PMA处理时，与媒介物对照相比，Nix/β-肌动蛋白比值的水平增加(A-B)。当暴露于PMA时，GABARAP-L1的表达没有增加(C-D)。

与通过暴露于PMA来特异性诱导患者细胞中Nix的表达一致，在CCCP的存在下施用10nM PMA的细胞表现出线粒体质量和线粒体DNA的显著降低。经柠檬酸合酶分析来评估线粒体质量表明，向对照细胞施用PMA不影响CCCP诱导的线粒体自噬。然而，在缺乏功能性Parkin且在响应CCCP处理时具有受损的线粒体自噬的细胞中，PMA显著地降低了线粒体质量(以媒介物对照为100％，针对CCCP+PMA相对于CCCP，79.82％±4％相对于103.7％±2％，p<0.01)。类似地，与在对照细胞中观察到的水平类似(72.79±6％)，当细胞施用PMA时线粒体DNA显著地减少(以媒介物对照为100％，针对CCCP+PMA相对于CCCP，77.06±4％相对于93.97±5％，p<0.05)。

图7显示通过PMA诱导Nix恢复了患者细胞中的线粒体自噬。(A)从媒介物处理的细胞(黑色柱)、CCCP处理的细胞(白色柱)、PMA处理的细胞(灰色)以及用10nM PMA和10μM CCCP(检验者(checker))处理24小时的细胞制备细胞裂解物，随后测量柠檬酸合酶活性。PMA和CCCP的共处理显著降低了患者细胞和“PINK1突变”细胞中柠檬酸合酶的活性，另外所述降低在单独的CCCP处理时没有观察到。(B)从媒介物处理的细胞(黑色柱)、CCCP处理的细胞(白色柱)、PMA处理的细胞(灰色)以及用10nM PMA和10μM CCCP(检验者)处理24小时的细胞分离DNA，随后使用实时定量PCR进行线粒体DNA的定量。在PMA和CCCP共处理后，线粒体DNA(mtDNA)针对核DNA(nDNA)的相对量，在患者细胞和PINK1突变细胞中显著减少。在单因素方差分析，随后进行的事后Tukey’s HSD多重比较检验中，NS；不显著*；p<0.05，以及**；p<0.01。

这些结果表示，施用增加Nix表达的试剂能够恢复Parkin功能损失相关的受损的线粒体自噬。

实施例7.患者细胞和携带PINK1突变的细胞中Nix的敲除废除了通过特异性诱导Nix所实现的CCCP诱导的线粒体自噬的恢复。

为了评估在用诱导Nix表达的试剂所处理的患者细胞中观察到的线粒体自噬恢复的特异性，在分离自携带parkin复合杂合突变的个体的细胞以及分离自携带PINK1纯合突变的个体的细胞中评估线粒体自噬。

方法

siRNA-介导的Nix敲除

为了评估豆蔻酸佛波醇乙酸酯(PMA)-诱导的线粒体自噬恢复的特异性，如上文的实施例5中所概述的，使对照细胞、分离自携带parkin复合杂合突变的个体的细胞(“患者”)以及分离自携带PINK1纯合突变的个体的细胞(“PINK1”)进行siRNA-介导的Nix敲除。简言之，将细胞暴露于非靶向siRNA(杂乱siRNA)或靶向Nix的siRNA(Nix siRNA)，随后用CCCP和PMA共处理24小时。

24小时之后收获细胞，并且如上概述的经通过实时定量PCR测量mtDNA含量来评估Nix的敲除对线粒体自噬的影响。

结果

图8(A)显示用杂乱siRNA或靶向Nix的siRNA处理细胞后Nix的表达。实现了Nix的成功敲除。图8(B)还显示了，当与各自的Nix siRNA-媒介物处理的细胞相比时，在PMA和CCCP共处理之后，用Nix siRNA处理的患者细胞和PINK1细胞不显示mtDNA的显著减少。在单因素方差分析，随后的事后Tukey’s HSD多重比较检验中，NS；不显著，以及*；p<0.05。

通过PMA和CCCP连续处理，Nix-沉默细胞中mtDNA的量相对于nDNA不存在减少，表明在缺乏功能性parkin或PINK1的细胞中PMA相关的线粒体自噬恢复是Nix特异的。

这些结果确认，在缺乏PINK1/Parkin线粒体自噬通路的细胞中，通过PMA所恢复的线粒体自噬确实是由Nix介导的。

实施例8.Nix的过表达恢复了患者细胞中CCCP诱导的线粒体自噬。

为了确认Nix表达和CCCP诱导的线粒体自噬之间的关系，我们在缺乏功能性parkin的患者细胞(且相对于对照和“携带者”细胞具有有缺陷的Nix表达)中过表达Nix，并且评估在CCCP诱导的线粒体自噬中的变化。

方法

Nix的过表达

将在pCMV6-Nix(Origene；#RC203315)中的野生型Nix cDNA(NM_004331)，亚克隆进含有FLAG标签的pER4慢病毒载体。使用Lenti-X HTX慢病毒包装系统(Clontech,Mountain View,CA,USA)和Lipofectamine 2000(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)，根据生产商的说明书，产生用于表达Nix-FLAG的慢病毒。在转染后48小时和72小时，收集含有慢病毒的培养基，随后在测量病毒滴度之前，使用Lenti-X浓缩器(Clontech)进行浓缩步骤。在4μg/mL聚凝胺的存在下，用空的慢病毒载体(pEmpty)或慢病毒Nix-FLAG载体(pNix-FLAG)以每个细胞10个感染单位慢病毒的比例，转导成纤维细胞24小时，并且用于随后的实验。

使用上文概述的方法，评估Nix的过表达对线粒体自噬的功能性影响。简言之，用CCCP或媒介物将转导有慢病毒的细胞处理24小时，并且经由通过实时定量PCR测量的mtDNA含量，以及如实施例2中概述的自噬体和线粒体的共定位度来检查线粒体自噬。

结果

图9显示，Nix的过表达恢复了缺乏功能性parkin的细胞(包括患者细胞；“Parkin突变”)和分离自携带纯合PINK1突变的个体的细胞(“PINK1突变”)中CCCP诱导的线粒体自噬。用含有空载体(pEmpty)或含有Nix-FLAG载体(pNix-FLAG)的慢病毒转导成纤维细胞。从媒介物处理的细胞和CCCP处理的细胞分离DNA，随后使用实时定量PCR进行线粒体DNA的定量。(A)在表达Nix-FLAG的Parkin和PINK1突变体中，当与媒介物处理的细胞相比时，在CCCP处理之后，线粒体DNA(mtDNA)相对于核DNA(nDNA)的相对量显著减少。在单因素方差分析，随后的事后Tukey’s HSD多重比较检验中，NS；不显著，**；p<0.01。(B)将转导有慢病毒的表达GFP-LC3(绿色)和RFP-Mito(红色)的患者细胞，用20μM CCCP处理4小时。在表达Nix-FLAG的患者细胞中观察到自噬体和线粒体的共定位(右图中的黄色点)，这表示线粒体自噬的激活，但在表达空载体的患者细胞中没有观察到。比例尺：10μm。使用徕卡(Leica)应用套件高级荧光(LAS AF)软件，从50个单个细胞图像计算共定位率(C)。CCCP处理后，相比于转导有空载体的细胞，表达Nix-FLAG的患者细胞呈现显著高的共定位率。在双尾学生t-检验中，***p<0.001。

图10显示Nix的过表达改善Parkin和PINK1突变的成纤维细胞中的线粒体功能。用空慢病毒载体(pEmpty)或Nix-FLAG载体(pNix-FLAG)转导Parkin和PINK1突变细胞，并且培养72小时。在毛地黄皂苷-透性化的细胞中，在苹果酸和丙酮酸盐的存在下，用分光光度法测量线粒体的ATP合成率。当与转导有空载体的细胞相比时，过表达Nix的细胞显示ATP合成率的显著增加。在单因素方差分析，随后事后Tukey’s HSD多重比较检验中，如在图中所示，NS；不显著，**；p<0.01，以及相对于表达pEmpty的对照细胞在表达pEmpty的突变细胞中^##；p<0.01。

这些结果表明，向缺乏功能性parkin或PINK1且呈现受损的线粒体自噬和线粒体功能的细胞施用增大Nix表达的试剂，恢复了线粒体自噬和线粒体的功能。

序列表

<110> 北悉尼地方卫生区

<120> 治疗或预防神经退行性病症的组合物和方法

<130> P093792C

<140> AU 2014901398

<141> 2014-04-16

<160> 20

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 219

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

Met Ser Ser His Leu Val Glu Pro Pro Pro Pro Leu His Asn Asn Asn

1 5 10 15

Asn Asn Cys Glu Glu Asn Glu Gln Ser Leu Pro Pro Pro Ala Gly Leu

20 25 30

Asn Ser Ser Trp Val Glu Leu Pro Met Asn Ser Ser Asn Gly Asn Asp

35 40 45

Asn Gly Asn Gly Lys Asn Gly Gly Leu Glu His Val Pro Ser Ser Ser

50 55 60

Ser Ile His Asn Gly Asp Met Glu Lys Ile Leu Leu Asp Ala Gln His

65 70 75 80

Glu Ser Gly Gln Ser Ser Ser Arg Gly Ser Ser His Cys Asp Ser Pro

85 90 95

Ser Pro Gln Glu Asp Gly Gln Ile Met Phe Asp Val Glu Met His Thr

100 105 110

Ser Arg Asp His Ser Ser Gln Ser Glu Glu Glu Val Val Glu Gly Glu

115 120 125

Lys Glu Val Glu Ala Leu Lys Lys Ser Ala Asp Trp Val Ser Asp Trp

130 135 140

Ser Ser Arg Pro Glu Asn Ile Pro Pro Lys Glu Phe His Phe Arg His

145 150 155 160

Pro Lys Arg Ser Val Ser Leu Ser Met Arg Lys Ser Gly Ala Met Lys

165 170 175

Lys Gly Gly Ile Phe Ser Ala Glu Phe Leu Lys Val Phe Ile Pro Ser

180 185 190

Leu Phe Leu Ser His Val Leu Ala Leu Gly Leu Gly Ile Tyr Ile Gly

195 200 205

Lys Arg Leu Ser Thr Pro Ser Ala Ser Thr Tyr

210 215

<210> 2

<211> 3505

<212> DNA

<213> 智人

<400> 2

cgtcaggggc aggggaggga cggcgcaggc gcagaaaagg gggcggcgga ctcggcttgt 60

tgtgttgctg cctgagtgcc ggagacggtc ctgctgctgc cgcagtcctg ccagctgtcc 120

gacaatgtcg tcccacctag tcgagccgcc gccgcccctg cacaacaaca acaacaactg 180

cgaggaaaat gagcagtctc tgcccccgcc ggccggcctc aacagttcct gggtggagct 240

acccatgaac agcagcaatg gcaatgataa tggcaatggg aaaaatgggg ggctggaaca 300

cgtaccatcc tcatcctcca tccacaatgg agacatggag aagattcttt tggatgcaca 360

acatgaatca ggacagagta gttccagagg cagttctcac tgtgacagcc cttcgccaca 420

agaagatggg cagatcatgt ttgatgtgga aatgcacacc agcagggacc atagctctca 480

gtcagaagaa gaagttgtag aaggagagaa ggaagtcgag gctttgaaga aaagtgcgga 540

ctgggtatca gactggtcca gtagacccga aaacattcca cccaaggagt tccacttcag 600

acaccctaaa cgttctgtgt ctttaagcat gaggaaaagt ggagccatga agaaaggggg 660

tattttctcc gcagaatttc tgaaggtgtt cattccatct ctcttccttt ctcatgtttt 720

ggctttgggg ctaggcatct atattggaaa gcgactgagc acaccctctg ccagcaccta 780

ctgagggaaa ggaaaagccc ctggaaatgc gtgtgacctg tgaagtggtg tattgtcaca 840

gtagcttatt tgaacttgag accattgtaa gcatgaccca acctaccacc ctgtttttac 900

atatccaatt ccagtaactc tcaaattcaa tattttattc aaactctgtt gaggcatttt 960

actaacctta tacccttttt ggcctgaaga cattttagaa tttcctaaca gagtttactg 1020

ttgtttagaa atttgcaagg gcttcttttc cgcaaatgcc accagcagat tataattttg 1080

tcagcaatgc tattatctct aattagtgcc accagactag acctgtatca ttcatggtat 1140

aaattttact cttgcaacat aactaccatc tctctcttaa aacgagatca ggttagcaaa 1200

tgatgtaaaa gaagctttat tgtctagttg ttttttttcc cccaagacaa aggcaagttt 1260

ccctaagttt gagttgatag ttattaaaaa gaaaacaaaa caaaaaaaaa aggcaaggca 1320

caacaaaaaa atatcctggg caataaaaaa aatattttaa accagctttg gagccacttt 1380

tttgtctaag cctcctaata gcgtctttta atttatagga ggcaaactgt ataaatgata 1440

ggtatgaaat agaataagaa gtaaaataca tcagcagatt ttcatactag tatgttgtaa 1500

tgctgtcttt tctatggtgt agaatctttc tttctgataa ggaacgtctc aggcttagaa 1560

atatatgaaa ttgctttttg agatttttgc gtgtgtgttt gatatttttt acgataatta 1620

gctgcatgtg aatttttcat gaccttcttt acatttttta ttttttattt ctttattttt 1680

ttttctctaa gaagaggctt tggaatgagt tccaatttgt gatgttaata caggcttctt 1740

gttttaggaa gcatcaccta tactctgaag cctttaaact ctgaagagaa ttgtttcaga 1800

gttattccaa gcacttgtgc aacttggaaa aacagacttg ggttgtggga acagttgaca 1860

gcgttctgaa aagatgccat ttgtttcctt ctgatctctc actgaataat gtttactgta 1920

cagtcttccc aaggtgattc ctgcgactgc aggcactggt cattttctca tgtagctgtc 1980

ttttcagtta tggtaaactc ttaaagttca gaacactcaa cagattcctt cagtgatata 2040

cttgttcgtt catttctaaa atgtgaagct ttaggaccaa attgttagaa agcatcagga 2100

tgaccagtta tctcgagtag attttcttgg atttcagaac atctagcatg actctgaagg 2160

ataccacatg ttttatatat aaataattac tgtttatgat atagacattg atattgacta 2220

tttagagaac cgttgttaat tttaaaacta gcaatctata aagtgcacca ggtcaacttg 2280

aataaaaaca ctatgacaga caggtttgcc agtttgcaga aactaactct tttctcacat 2340

caacatttgt aaaattgatg tgttatagtg gaaaataaca tatagattaa acaaaatttt 2400

tatctttttt caagaatata gctggctatc tttaagaaag atgatatatc ctagttttga 2460

aagtaatttt cttttttctt tctagcattt gatgtctaaa taattttgga catctttttc 2520

ctagaccatg tttctgtctt actcttaaac ctggtaacac ttgatttgcc ttctataacc 2580

tatttatttc aagtgttcat atttgaattt ctttgggaag aaagtaaatc tgatggctca 2640

ctgatttttg aaaagcctga ataaaattgg aaagactgga aagttaggag aactgactag 2700

ctaaactgct acagtatgca atttctatta caattggtat tacagggggg aaaagtaaaa 2760

ttacacttta cctgaaagtg acttcttaca gctagtgcat tgtgctcttt ccaagttcag 2820

cagcagttct atcagtggtg ccactgaaac tgggtatatt tatgatttct ttcagcgtta 2880

aaaagaaaca tagtgttgcc ctttttctta aagcatcagt gaaattatgg aaaattactt 2940

aaaacgtgaa tacatcatca cagtagaatt tattatgaga gcatgtagta tgtatctgta 3000

gccctaacac atgggatgaa cgttttactg ctacacccag atttgtgttg aacgaaaaca 3060

ttgtggtttg gaaaggagaa ttcaacaatt aatagttgaa attgtgaggt taatgtttaa 3120

aaagctttac acctgtttac aatttgggga caaaaaggca ggcttcattt ttcatatgtt 3180

tgatgaaaac tggctcaaga tgtttgtaaa tagaatcaag agcaaaactg cacaaacttg 3240

cacattggaa agtgcaacaa gttcccgtga ttgcagtaaa aatatttact attctaaaaa 3300

aatgagaatt gaagacttag ccagtcagat aagttttttc atgaacccgt tgtggaaatt 3360

attggaatta actgagccaa agtgattatg cattcttcat ctattttagt tagcactttg 3420

tatcgttata tacagtttac aatacatgta taacttgtag ctataaacat tttgtgccat 3480

taaagctctc acaaaacttt aaaaa 3505

<210> 3

<211> 117

<212> PRT

<213> 智人

<400> 3

Met Lys Phe Gln Tyr Lys Glu Asp His Pro Phe Glu Tyr Arg Lys Lys

1 5 10 15

Glu Gly Glu Lys Ile Arg Lys Lys Tyr Pro Asp Arg Val Pro Val Ile

20 25 30

Val Glu Lys Ala Pro Lys Ala Arg Val Pro Asp Leu Asp Lys Arg Lys

35 40 45

Tyr Leu Val Pro Ser Asp Leu Thr Val Gly Gln Phe Tyr Phe Leu Ile

50 55 60

Arg Lys Arg Ile His Leu Arg Pro Glu Asp Ala Leu Phe Phe Phe Val

65 70 75 80

Asn Asn Thr Ile Pro Pro Thr Ser Ala Thr Met Gly Gln Leu Tyr Glu

85 90 95

Asp Asn His Glu Glu Asp Tyr Phe Leu Tyr Val Ala Tyr Ser Asp Glu

100 105 110

Ser Val Tyr Gly Lys

115

<210> 4

<211> 1885

<212> DNA

<213> 智人

<400> 4

cagctctagc gaaaagccgc cggtatttct ccatctggct ctcctctacc tccaggcagg 60

ctcacccgag atccccgccc cgaacccccc ctgcacactc ggcccagcgc tgttgccccc 120

ggagcggacg tttctgcagc tattctgagc acaccttgac gtcggctgag ggagcgggac 180

agggtcagcg gcgaaggagg caggccccgc gcggggatct cggaagccct gcggtgcatc 240

atgaagttcc agtacaagga ggaccatccc tttgagtatc ggaaaaagga aggagaaaag 300

atccggaaga aatatccgga cagggtcccc gtgattgtag agaaggctcc aaaagccagg 360

gtgcctgatc tggacaagag gaagtaccta gtgccctctg accttactgt tggccagttc 420

tacttcttaa tccggaagag aatccacctg agacctgagg acgccttatt cttctttgtc 480

aacaacacca tccctcccac cagtgctacc atgggccaac tgtatgagga caatcatgag 540

gaagactatt ttctgtatgt ggcctacagt gatgagagtg tctatgggaa atgagtggtt 600

ggaagcccag cagatgggag cacctggact tgggggtagg ggaggggtgt gtgtgcgcga 660

catggggaaa gagggtggct cccaccgcaa ggagacagaa ggtgaagaca tctagaaaca 720

ttacaccaca cacaccgtca tcacattttc acatgctcaa ttgatatttt ttgctgcttc 780

ctcggcccag ggagaaagca tgtcaggaca gagctgttgg attggctttg atagaggaat 840

ggggatgatg taagtttaca gtattcctgg ggtttaattg ttgtgcagtt tcatagatgg 900

gtcaggaggt ggacaagttg gggccagaga tgatggcagt ccagcagcaa ctccctgtgc 960

tcccttctct ttgggcagag attctatttt tgacatttgc acaagacagg tagggaaagg 1020

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gtggcccctg atcttccctg tctcacactt cttttctccc atcccggttg caatctcact 1140

cagacatcac agtaccaccc caggggtggc agtagacaac aacccagaaa tttagacagg 1200

gatctcttac ctttggaaaa taggggttag gcatgaaggt ggttgtgatt aagaagatgg 1260

ttttgttatt aaatagcatt aaactggaat tgacaagagt gttgagcatc cctgtctaac 1320

ctgctctttc tctttggtgc cccttatctc accccttcct tggaatttaa taagtctcag 1380

gcatttccaa ttgtagacta aaaccactct tagcatctcc tctagtattt tccatgtatc 1440

aggacagagg tgtcttatgt agggaggggg caagtatgaa gtaaggtaat tatatactac 1500

tctcattcag gattcttgct cccatgctgc tgtcccttca ggctcacatg cacaggaatg 1560

ctacatgatg gccagctgct tccctccttg gttatcatcc actgcagctg ctagttagaa 1620

aggtttggag ggatgacttt tagtaaatca tggggatttt attgatttat tttcactttt 1680

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accttaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 1885

<210> 5

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ccctgaactg cagatcacca atgtggtag 29

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tcttctgact gagagctatg gtc 23

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gacgccttat tcttctttgt c 21

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gggagaccaa aagcttcat 19