本申请要求于2014年04月07日提交的韩国专利申请第10-2014-0041299号的优先权，上述说明书的所有内容通过引用的方式纳入本申请。
本发明涉及提高药物包封率的高分子微球的制备方法，更详细地涉及一种高分子微球的制备方法，所述方法包括：制备内水相(W1)和油相(O)的步骤；混合内水相和油相来制备W1/O乳剂并进行冷却的步骤；与外水相(W2)进行混合来制备W1/O/W2乳剂的步骤；以及干燥并收集已制备的W1/O/W2乳剂的步骤。
背景技术：
相对于普通的快速释放型(rapid release)制剂，控释型(controlled release)制剂在体内按规定时间持续释放药物，因此可长时间保持药物的有效血药浓度。因此，可减少因频繁给予普通的制剂而导致的血药浓度的波动，并且由此可降低副作用，从而减少给药频率，因此具有提高患者的用药依从性(compliance)的优点。
为了开发这种控释型制剂，最近正多方面地进行利用生物降解性高分子微球的药物递送实验，生物降解性高分子微球药物递送系统可在希望的期间内定量控制药物剂量，减少副作用，并且提高药效。
在利用高分子微球的药物传递系统的开发中，重点之一为如何提高在生产率方面的药物包封率。
在作为现有技术的美国授权专利US4,954,298中的基于由内水相(W1)/油相(O)/外水相(W2)形成的高分子微球的控释型制剂中，通过冷却内水相(W1)/油相(O)乳剂来增加粘度，并由此改善药物包封率。
但是，为了提高药物包封率有必要进一步改善工序。
技术实现要素：
技术问题
本发明人在研究关于制备W1/O/W2型含药物的高分子微球时可提高药物包封率的方法的过程中，证实了在特定温度以下并保持规定时间的条件下进行将W1/O乳剂混合在W2中来制备W1/O/W2的过程时，药物包封率有显著提高，并由此完成了本发明。
因此，本发明的目的在于，提供一种高分子微球的制备方法，所述方法包括：制备包含药物、增稠剂和水性溶剂的内水相(W1)，并制备包含聚合物和脂溶性溶剂的油相(O)的步骤；混合在上述步骤制备的内水相和油相来制备W1/O乳剂，并且冷却所制备的上述W1/O乳剂来增加粘度的步骤；将在上述步骤中粘度增加的W1/O乳剂分散于包含水溶性溶液且温度保持在18℃以下的外水相(W2)中，将温度保持在18℃以下达10分钟以上，并通过混合来制备W1/O/W2乳剂的步骤；以及干燥并收集在上述步骤制备的W1/O/W2乳剂的步骤。
本发明的另一目的在于，提供通过上述高分子微球的制备方法制备的高分子微球。
解决问题的方案
为了实现上述目的，本发明提供高分子微球的制备方法，所述方法包括：制备包含药物、增稠剂和水性溶剂的内水相(W1)，并且制备包含聚合物和脂溶性溶剂的油相(O)的步骤；混合在上述步骤制备的内水相和油相来制备W1/O乳剂，并且冷却所制备的上述W1/O乳剂来增加粘度的步骤；将在上述步骤中粘度增加的W1/O乳剂分散于包含水溶性溶液且温度保持在18℃以下的外水相(W2)中，将温度保持在18℃以下达10分钟以上，并通过混合来制备W1/O/W2乳剂的步骤；以及干燥并收集在上述步骤制备的W1/O/W2乳剂的步骤。
为了实现本发明的另一目的，本发明提供一种通过上述高分子微球的制备方法制备的高分子微球。
以下，详细描述本发明。
本发明提供一种高分子微球的制备方法，所述方法包括：步骤(a)，制备包含药物、增稠剂和水性溶剂的内水相W1，并且制备包含聚合物及脂溶性溶剂的油相O；步骤(b)，混合在上述步骤(a)制备的内水相和油相来制备W1/O乳剂，并且冷却所制备的上述W1/O乳剂来增加粘度；步骤(c)，将在上述步骤(b)中增加粘度的W1/O乳剂分散于包含水溶性溶液且温度保持在18℃以下的外水相W2中，将温度保持在18℃以下达10分钟以上，并通过混合来制备W1/O/W2乳剂；以及步骤(d)，干燥并收集在上述步骤(c)制备的W1/O/W2乳剂。
以下，根据步骤对本发明的制备方法进行说明。
在步骤(a)中，制备包含药物、增稠剂和水性溶剂的内水相(W1)，并且制备包含聚合物和脂溶性溶剂的油相(O)。
在步骤(a)中制备用于制备W1/O乳剂的内水相和油相。本发明的内水相的特征在于，包含药物、增稠剂和水性溶剂，油相的特征在于，包含聚合物和脂溶性溶剂。
所述药物是指适合用于疾病的诊断、处置、缓解、治疗或预防或者适合用于其他医学目的药剂、生理学制剂、生物学活性化合物或它们的混合物。本发明的药物均包含化合物、肽、蛋白质、抗体、核酸或它们的盐，优选地，可以为水溶性药物。
更优选地，本发明的药物可以为具有生理学活性的肽，最优选地，可以为醋酸亮丙瑞林。
醋酸亮丙瑞林(Leuprorelin acetate)作为分类为黄体生成素释放激素(LHRH)激动剂的激素制剂，也被称为亮脯利特(Leuprolide)、醋酸亮丙瑞林(Leuprorelin acetate)、亮氨酰脯氨酸醋酸盐(Leuprolide acetate)。在睾酮或雌激素依赖性癌细胞中，使它们缺少激素而起到减少或缩小肿瘤大小的作用，主要适用于乳腺癌、对激素产生反应的前列腺癌、子宫内膜癌、子宫肌瘤、中枢性性早熟的治疗，但还可以作为治疗其他疾病的目的而使用。
所述增稠剂通过增加内水相的粘度来制备W1/O乳剂，从而提供冷却时粘度增加的效果。例如，本发明的增稠剂可以为酪蛋白、明胶、胶原等的高分子化合物，纤维素、糊精、琼脂等的碳水化合物，黄原胶等的天然橡胶，优选地，可以为明胶。
所述水性溶剂是指可溶解作为水溶性的本发明的药物的溶剂，通常，不对适合用于药物溶解的水性溶剂进行限制。本发明的水性溶剂不限定于此，但是例如，可以为水、碳数为1至4个的低级醇(例如，甲醇、乙醇、丙醇等)、乙腈、丙酮、四氢呋喃等。优选地，可以为乙醇、甲醇、水或它们的混合物。更优选地，本发明的水性溶剂可以为水。
形成内水相(W1)的水性溶剂、药物和增稠剂的重量比可根据水性溶剂的种类、药物的种类而不同，但不限定于此，例如，能够以水性溶剂：药物：增稠剂＝1∶0.01～2∶0.01～0.5的重量比混合，优选地，相对于1重量份的水性溶剂，能够以0.05至1重量份的药物、0.05至0.2重量份的增稠剂的比率进行混合。
能够以依次混合或同时混合水性溶剂、药物和增稠剂的方法制备内水相(W1)，优选地，可在加温的条件下混合内水相。优选地，所述加温条件可以为30至80℃，更优选地，可以为50至70℃。
所述聚合物是指形成高分子微球的外壁的高分子化合物，本发明的聚合物只要是在制备高分子微球的过程中使用的本技术领域公知的高分子化合物，就可不受限制，优选地，虽然并不限定于此，但是例如，可以为羟基脂肪酸聚酯、聚乳酸(poly(lactic acid))和聚羟基乙酸(poly(glycolic acid))的共聚物、仅由聚乳酸或聚丙交酯形成的聚合物、聚乳酸-乙醇酸共聚物、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚磷腈、聚亚胺基碳酸酯、聚磷酸酯、聚酸酐、聚原酸酯、乳酸和己内酯的共聚物、聚已内酯、聚羟基戊酸酯、聚羟基丁酸酯、聚氨基酸、乳酸和氨基酸的共聚物及它们的混合物，更优选地，可以为聚乳酸和聚羟基乙酸的共聚物。在本发明的高分子微球的制备方法中使用的聚合物的重均分子量未特别限制，但通常可以为2,000至800,000，优选地，可以为5,000至100,0000，更优选地，可以为10,000至50,000。
所述聚乳酸和聚羟基乙酸的共聚物(PLGA)的乳酸与乙醇酸的摩尔比可以为0至100∶0至100，优选地，可以为50至90∶10至50(例如，50∶50、65∶35、75∶25、85∶15、90∶10)，更优选地，可以为70至80∶20至30(例如，75∶25)。
所述脂溶性溶剂用于溶解高分子量的聚合物，通常在制备用于控释型制剂的高分子微球的过程中使用的脂溶性溶剂可不受限制。例如，本发明的脂溶性溶剂可以为二氯甲烷、氯仿、二氯乙烷、三氯乙烷、四氯化碳等的卤代烃，乙醚、异丙醚等的醚类，乙酸乙酯、乙酸丁酯等的脂肪酯，苯、甲苯、二甲苯等的芳香族烃。优选地，可以为卤代烃，更优选地，可以为二氯甲烷。
只要是可溶解聚合物的脂溶性溶剂的量，则不进行特别限制，脂溶性溶剂的量可根据聚合物的种类和脂溶性溶剂的种类而不同，例如，可以为聚合物重量的0.1倍至10倍，优选地，可以为0.5倍至4倍，更优选地，可以为聚合物重量的1倍至2倍。
油相(W1)可通过在脂溶性溶剂中混合聚合物的方法制备，并可根据需要，利用混合器(stirrer、mixer)或振荡器(voltex)进行混合。
在步骤(b)中，混合在上述步骤(a)制备的内水相和油相来制备W1/O乳剂，并且冷却所制备的上述W1/O乳剂来增加粘度。
在步骤(b)中，在混合在上述步骤(a)制备的内水相和油相来制备W1/O乳剂之后，进行冷却来增加粘度。
所述W1/O乳剂通过混合内水相和油相的方法制备，所述混合可通过公知的方法进行。例如，所述混合方法可通过不连续振荡方法、利用旋桨式搅拌器、涡轮式搅拌器等的搅拌方法、胶体磨法、均质器法或超声波方法进行，优选地，可通过均质器法进行。优选地，本发明的W1/O乳剂可通过在油相中加入内水相，并通过均质器(homogenizer)进行均质化的方法制备。
内水相与油相的混合比可根据聚合物、药物、水性溶剂和脂溶性溶剂的种类而不同，例如，虽然并不限定于此，但相对于1重量份的内水相，能够以1至100重量份的比率混合油相，优选地，相对于1重量份的内水相，能够以1至20重量份的比率混合油相，更优选地，相对于1重量份的内水相，能够以5至10重量份的比率混合油相。
对所制备的W1/O乳剂进行冷却来增加粘度。
根据粘度的增加，可提高部分药物的包封率。但是，仅通过如上所述的W1/O乳剂的粘度增加，在包封率增加效果方面，其增加量存在局限，因此在制备控释型制剂的方面无法实现足够的包封率，并且必须需要外水相(W2)的温度调节及其保持时间的调节。
所述冷却温度只要是可增加本发明的W1/O乳剂的粘度的足够的温度，就无特别限定，优选地，可以为18℃以下。
在步骤(c)中，将在上述步骤(b)中粘度增加的W1/O乳剂分散于包含水溶性溶液且温度保持在18℃以下的外水相(W2)中，将温度保持在18℃以下达10分钟以上，并通过混合来制备W1/O/W2乳剂。
在步骤(c)中，将粘度增加的上述W1/O乳剂分散于外水相(W2)来制备W1/O/W2乳剂。
本发明的外水相(W2)的特征在于，其包含水溶性溶液。
所述水溶性溶液是指在水性溶剂中溶解有乳化剂(乳化稳定剂)的溶液。
所述水性溶剂可以为水、甲醇、乙醇、丙醇等碳数为1至4个的低级醇、乙腈、丙酮、四氢呋喃或它们的混合物，优选地，可以为乙醇、甲醇、水或它们的混合物。更优选地，可以为水。
除了乳化剂以外，本发明的外水相(W2)还可额外地包含用于调节外水相的pH的合适的缓冲液(buffer)或用于调节渗透压的渗透压调节剂(例如，甘露醇)。因为所述缓冲液或渗透压调节剂可增加药物的包封率和稳定性。
所述乳化剂可以为稳定地形成乳剂的公知的乳化剂，例如，明胶、油酸钠、硬脂酸钠、月桂基磺酸钠、十二烷基硫酸钠(SDS)等的阴离子表面活性剂、Tween80、Tween60等的聚氧乙烯山梨醇脂肪酯(聚山梨醇酯(Polysorbate))、聚氧乙烯蓖麻油衍生物等的非离子表面活性剂、聚乙烯醇、羧甲基纤维素、卵磷脂、透明质酸或者它们的混合物，优选地，可以为聚乙烯醇(PVA，polyvinyl alcohol)。
本发明的W1/O/W2乳剂的制备步骤的特征在于，在保持18℃以下的外水相(W2)的温度的状态下，对粘度增加的W1/O乳剂进行分散，在分散的步骤中也使温度保持18℃以下达最少10分钟以上。
在将W1/O乳剂分散于外水相的步骤中，通过将温度保持18℃以下达最少10分钟以上，大幅度增加药物的包封率。这一点在本发明中第一次公开。
为了将所述分散步骤的温度保持在18℃以下，上述外水相(W2)的温度优选为18℃，并且可更优选为10℃以上且18℃以下。
在外水相(W2)中分散粘度增加的W1/O乳剂并进行混合的方法可通过公知的混合方法进行，与此相关的内容与在制备上述W1/O乳剂的过程中混合内水相与油相的方法中的记载相同。
优选地，在外水相(W2)分散粘度增加的W1/O乳剂并进行混合的温度保持在18℃以下，更优选地，可以为10℃以上且18℃以下，最优选地，可以为15℃以上且18℃以下。
并且，优选地，所述温度至少需要保持10分钟以上。当保持时间小于10分钟时，药物包封率会急剧下降。更优选地，所述保持时间可以为10分钟以上且120分钟以下，最优选地，可以为30分钟以上且90分钟以下。当所述保持时间持续120分钟以上时，由于高分子微球的组分，随着持续时间的增加，包封率增加程度并不大，因此有可能效率低下。
在本发明的比较例和实施例中，在各种温度下保持各种时间的条件下制备W1/O乳剂，并检测药物包封率和药物含量。
其结果，当初始温度为20℃、25℃时，证实了包封率非常低(比较例1和比较例2)，当初始温度为18℃且未将所述温度保持10分钟以上时，也证实了药物包封率低至20％左右(比较例3)。
相反地，在将粘度增加的W1/O乳剂分散于外水相(W2)中时，在保持18℃的温度达10分钟后，逐渐提高温度时，证实了药物包封率明显得到改善(实施例1)，当将所述温度保持30分钟以上时，证实了药物包封率进一步明显得到改善(实施例2至实施例4)。
在步骤(d)中，干燥并收集在上述步骤(c)所制备的W1/O/W2乳剂。
在步骤(d)中，通过对上述制备的W1/O/W2乳剂进行干燥，制备高分子微球，并将其收集。
上述干燥可通过为了从所制备的高分子微球去除溶剂而通常使用的常规方法来进行。例如，上述干燥可通过对所制备的高分子微球进行单纯搅拌、加热、充氮气等、在减压条件下搅拌、以调节的真空条件对溶剂进行蒸发的方法进行。优选地，可通过在减压条件下进行搅拌来去除溶剂的水中干燥法进行干燥。
所述收集是指从水相中分离并获得高分子微球，可通过离心分离、过滤等从液相分离固体成分的常规方法进行。
可对在上述步骤(d)中制备的高分子微球进一步进行如下的清洗步骤，即，将所制备的高分子微球额外地再分散到蒸馏水等中，并进行混合后再收集的清洗步骤。通过如上所述的清洗步骤可去除包含在微粒子表面的药剂残留物、外水相(W2)的乳化稳定剂等。
并且，可通过冻结干燥等的方法对根据本发明的高分子微球的制备方法制备的高分子微球进行固化，从而制备更稳定的高分子微球。更优选地，可将所制备的高分子微球悬浮于注射用水等的合适的溶液后，混合公知的赋形剂(例如，甘露醇等的糖类)、分散剂等，此后，通过冻结干燥来进行固化。
当通过本发明的高分子微球的制备方法来制备高分子微球时，可制备高药物包封率的高分子微球，因此可减少药物的损失，从而经济性地制备控释型制剂。并且，与现有的方法相比，可制备提高药物含量的高分子微球。
因此，本发明提供通过本发明的高分子微球的制备方法来制备的高分子微球。
与通过现有的方法来制备的高分子微球相比，本发明的高分子微球由于具有高药物包封率，因此在制备上具有经济性，并且具有高药物含量。
通过本发明的高分子微球的制备方法来制备的高分子微球可根据包含的药物种类适用于目标疾病的治疗中，因此，本发明提供包含本发明的高分子微球作为有效成分的疾病治疗用药学组合物。
所述疾病为可通过包含本发明的高分子微球的药物来进行治疗的疾病，优选地，可为前列腺癌、子宫内膜癌、子宫肌瘤和中枢性性早熟。
本发明的药学组合物单独包含含有药物有效量的药物的高分子微球或者还可额外地包含一种以上的药学上可接受的载体。所述“药物有效量”是指相比于阴性对照组显示更多的反应的量，优选地，是指用于疾病治疗或预防疾病的足够的量。本发明的高分子微球的药物有效量为0.001至1000mg/天/kg体重，优选地，可以为0.005至1mg/天/kg体重。但是，所述药物有效量可根据疾病及其严重程度、患者的年龄、体重、健康状态、性别、给药途径和治疗期等诸多因素而合适地进行改变。
所述“药学上可接受的”是指如下文中所述的非毒性组合物，即，生理上可接受的且在对人体给药时不抑制活性成分的作用，并且通常不产生胃肠道疾病、眩晕症等的过敏反应或与其相似的反应的组合物。本发明的组合物与所述药学上可接受的载体一起，可通过本发明所属技术领域的公知的方法，并且根据给药途径制备多种剂型。虽然未对给药途径进行限定，但其能够以口服或非口服的方式给药。作为非口服给药途径包括例如经皮、鼻腔、腹腔、肌肉、皮下或静脉等多种途径。
以非口服的方式进行给药时，本发明的药学组合物可与合适的非口服用载体一起，以注射剂、经皮注射剂和鼻腔吸入剂的形式根据本技术领域所属的公知的方法制备剂型。在制备所述注射剂时，必须需要进行灭菌，并且需要防止细菌和真菌等的微生物的污染。在制备注射剂时，虽然未对合适的载体进行限制，但可以为包含水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、它们的混合物和/或食用油的溶剂或分散介质。更优选地，作为合适的载体可使用Hank’s液、林格氏液、含三乙醇胺的磷酸盐缓冲盐水(phosphate buffered saline，PBS)或注射用灭菌水、10％的乙醇、40％的丙二醇和5％的葡萄糖等的等渗溶液等。为了保护上述注射剂免受微生物污染，还可包含防腐剂、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等的多种抗菌剂和抗真菌剂。并且，在大部分的情况下，所述注射剂还可包含氯化糖或氯化钠等的等渗剂。经皮给药剂包含软膏、乳膏、洗剂、凝胶、外用液、石膏、擦剂、喷雾剂等的形式。上述“经皮给药”是指通过局部地向皮肤给予药学组合物使包含在药学组合物中的有效量的活性成分递送到皮肤内的方式。这些剂型记载于作为药物化学通常公知的药剂配方手册的文献中(Remington′s Pharmaceutical Science，15th Edition，1975，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania)。
除此之外的药学上可接受的载体可参照以下文献(Remington′s Pharmaceutical Sciences，19th ed.，Mack Publishing Company，Easton，PA，1995)。
发明的效果
如上所述，本发明涉及一种提高药物包封率的高分子微球的制备方法，更详细地涉及一种高分子微球的制备方法，所述方法包括：制备内水相(W1)和油相(O)的步骤；混合内水相和油相来制备W1/O乳剂并进行冷却的步骤；与外水相(W2)进行混合来制备W1/O/W2乳剂的步骤；以及干燥并收集所制备的W1/O/W2乳剂的步骤。本发明的高分子微球制备方法，通过将固化油相的步骤保持在特定温度达特定时间以上的过程，来提高药物包封率，并且可制备具有高药物含量的高分子微球，因此在制备缓释型药物中是有效的。
具体实施方式
以下，通过实施例对本发明进行详细说明。
但是，以下实施例仅用于示例性说明本发明，本发明的内容并不限于以下实施例。
比较例
通过普通方法制备的微粒子的药物包封率试验
比较例1：根据W1/O乳剂的冷却的包封率检测
在0.45g的醋酸亮丙瑞林粉末和0.08g的明胶混合物中添加1g的蒸馏水，在加热至约60℃的温度的同时，溶解上述粉末，从而取得W1(内水相)溶液。在4.0g的DL-乳酸-乙醇酸共聚物(重均分子量：10,000-15,000)粉末中添加6.65g的二氯甲烷，并进行涡旋振荡(voltexing)，从而取得O(油相)溶液。在O溶液中添加W1溶液，通过均质器(homogenizer)进行乳化，从而制备W1/O乳剂。
在使用保持在约3℃的冷却装置来提高W1/O相的粘度后，与调节到25℃的1.0wt％的聚乙烯醇(PVA)水溶液(1250ml，以下体积相同)混合，然后通过高速搅拌机(homomixer，Siverson，L4R)进行搅拌，从而制备W1/O/W2乳剂。在制备乳剂的过程中，温度持续保持在约25℃。对所制备的W1/O/W2乳剂进行约4小时的水中干燥，在通过开口部为75μm的滤网进行过滤后，进行离心分离，并收集微粒子。使用蒸馏水对所收集的微粒子进行再分散，在完成混合后，反复进行离心分离，在充分清洗微粒子表面后，对所取得的高分子微粒子进行冻结干燥，从而取得包含醋酸亮丙瑞林的高分子微粒子(以下，称为“高分子微球”)。对所取得的高分子微球的药物含量和药物包封率进行检测。
通过如下的方法进行高分子微球的药物含量检测实验。
精确获取50mg的高分子微球，并加入到100mL容量的烧瓶中，用2mL的DMSO完全溶解高分子微粒子后，填充到标记线，并进行超声波提取而制备试液后，进行液相色谱法来完成检测。液相色谱法的分析在如下条件中进行。
色谱柱：2.1mm×50mm，Waters ACQUITY CSH C181.7μm
检测器：紫外线吸收计(波长为220nm)
流速：0.5mL/min
流动相：包含0.2％的三氟乙酸的水/乙腈(75/25，v/v)
实验结果证实了在以比较例1的条件进行实验的组中，包含在所干燥的高分子微球中的药物的含量为3.4％(重量比)，药物包封率为34.0％。
比较例2：W1/O/W2乳剂制备温度为20℃的高分子微球的包封率检测
在0.50g的醋酸亮丙瑞林粉末和0.08g的明胶混合物中添加0.5g的蒸馏水，在加热至约60℃的温度的同时，溶解上述粉末，从而取得W1溶液。在4.0g的DL-乳酸-乙醇酸共聚物(重均分子量：10,000-15,000)粉末中添加8.0g的二氯甲烷，并进行涡旋振荡，从而取得O溶液。在O溶液中添加W1溶液，通过均质器进行乳化，从而制备W1/O乳剂。
在使用保持在约18℃的冷却装置来提高W1/O相的粘度后，与调节到20℃的1.0wt％的聚乙烯醇(PVA)水溶液混合，然后通过高速搅拌机(homomixer，Siverson，L4R)进行搅拌，从而制备W1/O/W2乳剂。在制备乳剂的过程中，将温度持续保持在低于比较例1的18℃～20℃，并按时间检测保持的温度。保持的温度如下列表1所示。对所制备的W1/O/W2乳剂进行约4小时的水中干燥，在通过开口部为75μm的滤网进行过滤后，进行离心分离，并收集微粒子。使用蒸馏水对所收集的微粒子进行再分散，在完成混合后，反复进行离心分离，在充分清洗微粒子表面后，收集所述微粒子，并进行冻结干燥来取得高分子微球。以与比较例1相同的方法对所取得的高分子微球的药物含量和药物包封率进行检测。
表1比较例1和比较例2的W1/O/W2制备温度比较
实验结果证实了在以比较例2的条件进行实验的组中，包含在所干燥的高分子微球中的药物的含量为1.6％(重量比)，药物包封率为15.0％。
由此，证实了当制备W1/O/W2时，即使将初始温度设定为20℃后，将温度保持在18℃的情况下，也无法取得足够的药物包封率。
比较例3：W1/O/W2乳剂制备温度为18℃的高分子微球的包封率检测
在0.50g的醋酸亮丙瑞林粉末和0.08g的明胶混合物中添加0.5g的蒸馏水，在加热至约60℃的温度的同时，溶解上述粉末，从而取得W1溶液。在4.0g的DL-乳酸-乙醇酸共聚物(重均分子量：10,000-15,000)粉末中添加8.0g的二氯甲烷，并进行涡旋振荡，从而取得O溶液。在O溶液中添加W1溶液，通过均质器进行乳化，从而制备W1/O乳剂。
在使用保持在约18℃的冷却装置来提高W1/O相的粘度后，与调节到18℃的0.25wt％的聚乙烯醇(PVA)水溶液混合，然后通过高速搅拌机(homomixer，Siverson，L4R)进行搅拌，从而制备W1/O/W2乳剂。在制备乳剂的过程中，将温度持续保持在低于比较例1的18℃～20℃，与比较例2不同地，按时间保持的温度，初始由18℃温度开始，在规定时间后保持在20℃。并按时间检测温度，所检测的温度如下列表2所示。对所制备的W1/O/W2乳剂进行约4小时的水中干燥，通过开口部为75μm的滤网进行过滤后，进行离心分离，并收集微粒子。使用蒸馏水对所收集的微粒子进行再分散，在完成混合后，反复进行离心分离，在充分清洗微粒子表面后，收集所述微粒子，并进行冻结干燥来取得高分子微球。以与比较例1相同的方法对所取得的高分子微球的药物含量和药物包封率进行检测。
表2比较例2和比较例3的W1/O/W2制备温度比较
实验结果证实了在以比较例3的条件进行实验的组中，包含的药物的含量为2.2％(重量比)，药物包封率为20.2％。
由此，证实了当制备W1/O/W2时，即使将初始温度设定为18℃后，在10分钟内将温度升温到20℃且持续保持的情况下，也无法取得足够的药物包封率。
实施例：以本发明的高分子微球的制备方法制备的微粒子的药物包封率实验
实施例1：将W1/O/W2乳剂制备温度保持在18℃达10分钟以上的高分子微球的包封率检测
在0.50g的醋酸亮丙瑞林粉末和0.08g的明胶混合物中添加0.5g的蒸馏水，在加热至约60℃的温度的同时，溶解上述粉末，从而取得W1溶液。在4.0g的DL-乳酸-乙醇酸共聚物(重均分子量：10,000-15,000)粉末中添加8.0g的二氯甲烷，并进行涡旋振荡，从而取得O溶液。在O溶液中添加W1溶液，通过均质器进行乳化，从而制备W1/O乳剂。
在使用保持在约18℃的冷却装置来提高W1/O相的粘度后，与调节到18℃的0.25wt％的聚乙烯醇(PVA)水溶液混合，然后通过高速搅拌机(homomixer，Siverson，L4R)进行搅拌，从而制备W1/O/W2乳剂。在制备乳剂的过程中，将温度从18℃开始，在保持10分钟的相同温度后，逐渐升温，以在60分钟内达到23℃。按时间检测温度，所检测的温度如表3所示。对所制备的W1/O/W2乳剂进行约4小时的水中干燥，在通过开口部为75μm的滤网进行过滤后，进行离心分离，并收集微粒子。使用蒸馏水对所收集的微粒子进行再分散，在完成混合后，反复进行离心分离，在充分清洗微粒子表面后，收集所述微粒子，并进行冻结干燥来取得高分子微球。以与比较例1相同的方法对所取得的高分子微球的药物含量和药物包封率进行检测。
表3比较例3和实施例1的W1/O/W2制备温度比较
实验结果证实了在以实施例1的条件进行实验的组中，包含的药物的含量为8.1％(重量比)，药物包封率为74.0％。
由此，证实了虽然初始温度相同，但与在10分钟内升温至20℃的比较例3相比，在10分钟内保持18℃的实施例1的情况下，与比较例3相比，药物含量和药物包封率明显增加至366％。由此，证实了了在制备W1/O/W2类型的高分子微球时，使W2形成温度从18℃以下开始，并将其温度保持10分钟以上，药物含量和药物包封率有明显提高。
实施例2：将W1/O/W2乳剂制备温度保持在15℃达30分钟以上的高分子微球的包封率检测
在0.52g的醋酸亮丙瑞林粉末和0.09g的明胶混合物中添加1.0g的蒸馏水，在加热至约60℃的温度的同时，溶解上述粉末，从而取得W1溶液。在4.0g的DL-乳酸-乙醇酸共聚物(重均分子量：10,000-15,000)粉末中添加13.3g的二氯甲烷，并进行涡旋振荡，从而取得O溶液。在O溶液中添加W1溶液，通过均质器进行乳化，从而制备W1/O乳剂。
在使用保持在约15℃的冷却装置来使W1/O相的胶凝化后，与调节到15℃的0.25wt％的聚乙烯醇(PVA)水溶液混合，然后通过高速搅拌机(homomixer，Siverson，L4R)进行搅拌，从而制备了W1/O/W2乳剂(旋转次数：约5000rpm)。在制备乳剂的过程中，将温度持续保持在低于比较例4的15℃～20℃，并增加初始低温保持时间。按时间检测温度，所检测的温度如表4所示。对所制备的W1/O/W2乳剂进行约4小时的水中干燥，在通过开口部为75μm的滤网进行过滤后，进行离心分离，并收集微粒子。使用蒸馏水对所收集的微粒子进行再分散，在完成混合后，反复进行离心分离，在充分清洗微粒子表面后，收集所述微粒子，并进行冻结干燥来取得高分子微球。以与比较例1相同的方法对所取得的高分子微球的药物含量和药物包封率进行检测。
表4实施例1和实施例2的W1/O/W2制备温度比较
检测结果证实了在以实施例2的条件进行实验的组中，包含的药物的含量为10.8％(重量比)，药物包封率为96％。
由此，证实了与实施例相比1，将W2的临界温度以下保持时间增加到30分钟的情况，显现进一步提高的药物包封率。
实施例3和实施例4：将W1/O/W2乳剂制备温度持续保持在18℃以下的高分子微球的包封率检测
在0.50g的醋酸亮丙瑞林粉末和0.08g的明胶混合物中添加0.5g的蒸馏水，在加热至约60℃的温度的同时，溶解上述粉末，从而取得W1溶液。在4.0g的DL-乳酸-乙醇酸共聚物(重均分子量：10,000-15,000)粉末中添加8.0g的二氯甲烷，并进行涡旋振荡，从而取得O溶液。在O溶液中添加W1溶液，通过均质器进行乳化，从而制备W1/O乳剂。
在使用保持在18℃(实施例3)或17℃(实施例4)的冷却装置提高W1/O相的粘度后，与调节到18℃(实施例3)或17℃(实施例4)的0.25wt％的聚乙烯醇(PVA)水溶液混合，然后通过高速搅拌机(homomixer，Siverson，L4R)进行搅拌，从而取得W1/O/W2乳剂。在制备乳剂的过程中，将温度持续保持在18℃以下，并按时间检测温度，保持温度如表5所示。对所制备的W1/O/W2乳剂进行约4小时的水中干燥，在通过开口部为75μm的滤网进行过滤后，进行离心分离，并收集微粒子。使用蒸馏水对所收集的微粒子进行再分散，在完成混合后，反复进行离心分离，在充分清洗微粒子表面后，收集所述微粒子，并进行冻结干燥来取得高分子微球。以与比较例1相同的方法对所取得的高分子微球的药物含量和药物包封率进行检测。
表5实施例2至实施例4的W1/O/W2制备温度比较
检测结果证实了在以实施例3的条件进行实验的组中，药物的含量为10.3％(重量比)，药物包封率为94％。并且，证实了在以实施例4的条件进行实验的组中，包含的药物的含量为10.4％(重量比)，药物包封率为95％。
由此，证实了将W2保持在15℃至18℃的情况，与现有制备方法相比，大幅度提高了药物包封率，因此通过成功的药物封装实现高分子微球的制备是可行的。
产业上的可利用性
因此，本发明涉及一种提高药物包封率的高分子微球的制备方法，更详细地涉及一种高分子微球的制备方法，所述方法包括：制备内水相(W1)和油相(O)的步骤；混合内水相和油相来制备W1/O乳剂并进行冷却的步骤；与外水相(W2)进行混合来制备W1/O/W2乳剂的步骤；以及干燥并收集所制备的W1/O/W2乳剂的步骤。本发明的高分子微球的制备方法，通过将油相固化的步骤保持在特定温度达特定时间以上的过程，来提高药物包封率，并且可制备具有高药物含量的高分子微球，因此在制备缓释型药物中是有效的，进而使其在产业上的可利用性高。