活化人CD40的抗体和针对人PD‑L1的抗体的组合疗法的制作方法
本发明涉及结合人CD40的特异性抗体与结合人PD-L1的特异性抗体的组合疗法。这些组合在癌症疗法的领域中特别有用。
发明背景
免疫调控性抗体提供一种治疗办法且可用于直接强化抗肿瘤免疫应答或可用作抗癌疫苗的佐剂(Melero,I.,et al.Nat Rev Cancer 7,2007,95-106)。激动性抗CD40抗体构成这些试剂中的最有效类别之一。CD40是肿瘤坏死因子超家族的一个细胞表面成员，在抗原呈递细胞(APC)诸如树突细胞，B细胞和巨噬细胞上表达。抗CD40激动剂的临床前研究提示用交联性抗体触发抗原呈递细胞(APC)上的CD40能取代正常情况下经由CD40配体提供的CD4 T细胞帮助及推动CD8效应T细胞活化以及扩充(Li,F.et al,Science 333,2011,1030-1034)。另外，CD40活化的巨噬细胞还可以发挥直接杀肿瘤功能(Beatty,G.L.,et al.,Science 331,2011,1612-1616；Vonderheide,R.H.,et al.,Oncoimmunology 2,2013,e23033)。CD40激动剂披露于WO 2003/040170。
最近，发现了T细胞功能障碍或无反应性与抑制性受体，编程性死亡1多肽(PD-1)的诱导的且持续的表达并行发生。从而，靶向PD-1和经由与PD-1相互作用来发信号的其它分子，诸如编程性死亡配体1(PD-L1)和编程性死亡配体2(PD-L2)的治疗剂是一个强烈感兴趣的领域。已经提出抑制PD-L1信号传导作为增强T细胞免疫来治疗癌症(例如肿瘤免疫力)和感染(包括急性和慢性(例如持久的)感染二者)的手段。针对PD-L1的抗体记载于例如WO 2010/077634。
共刺激或对T细胞提供两种截然不同的信号是抗原呈递细胞(APC)对静息T淋巴细胞的淋巴细胞活化的一种广泛接受的模型(Lafferty,et al.,Aust.J.Exp.Biol.Med.Sci.53,1975,27-42)。在治疗上对共刺激的机制感兴趣，因为操作共刺激信号已经显示出提供增强或终止基于细胞的免疫应答的手段。然而，作为一种最佳疗法，共靶向CD40和PD-L1仍然有待商品化，存在尚未满足的一项重大医学需求。
发明概述
本发明包含结合人CD40的抗体与结合人PD-L1的抗体的组合疗法，其用于治疗增殖性疾病，特别是癌症。
本发明进一步包含一种药物产品，其包含A)第一成分，该第一成分包含作为活性组分的特异性结合且活化人CD40的抗体或其抗原结合部分；和B)第二成分，该第二成分包含作为活性组分的PD-L1抗体；其用于组合，顺序或同时治疗增殖性疾病，特别是癌症。
本发明进一步包含特异性结合且活化人CD40的抗体或其抗原结合部分；和PD-L1抗体用于制造药物的用途，该药物用于组合，顺序或同时治疗增殖性疾病，诸如癌症，优选实体瘤。
本发明进一步包含一种试剂盒，其包含如上文限定的药物产品。
本发明进一步包含一种治疗罹患增殖性疾病，特别是癌症的患者的方法，所述方法包含组合，同时或顺序施用抗CD40抗体和PD-L1抗体。
附图简述
图1：(a)同位Panc02-H7-Fluc胰腺癌模型中组合的muFGK4.5(抗CD40)和抗PD-L1较之媒介和单药疗法对照的肿瘤生长抑制的分析，(b)来自a-CD40+a-PDL1组合组的小鼠的个体肿瘤生长曲线。
图2：在处理第22天用组合的muFGK4.5和抗PD-L1处理的小鼠个体。
图3：同位Panc02H7-Fluc胰腺癌模型中组合的muFGK4.5和抗PD-L1抗体(“联合”)较之对照和单药疗法的免疫药效学(PD)分析。
图4：牵涉人抗CD40-和抗PD-L1抗体的组合处理的临床试验的剂量和剂量进度表。PD-L1抗体的剂量固定于1200mg。
图5：添加抗TNFα作为第三成分在小鼠中阻止由抗CD40/抗PD-L1组合处理诱导的重量减轻。
图6：添加抗TNFα作为第三成分不损害抗CD40/抗PD-L1组合处理的抗肿瘤活性。
序列表简述
SEQ ID NO 1: 人CD40
SEQ ID NO 2: 人PD-L1
SEQ ID NO 3: 依照本发明的CD40抗体的轻链可变域(VL)。
SEQ ID NO 4: 依照本发明的CD40抗体的重链可变域(VH)。
SEQ ID NO:5 重链可变域VH变体1，抗PD-L1 243.55
SEQ ID NO:6 重链可变域VH变体2，抗PD-L1 243.55
SEQ ID NO:7 重链可变域VH变体3，抗PD-L1 243.55
SEQ ID NO:8 轻链可变域VL变体1，抗PD-L1 243.55
SEQ ID NO:9 轻链可变域VL变体2，抗PD-L1 243.55
SEQ ID NO:10 轻链可变域VL变体3，抗PD-L1 243.55
SEQ ID NO:11 轻链可变域VL变体4，抗PD-L1 243.55
SEQ ID NO:12 轻链可变域VL变体5，抗PD-L1 243.55
SEQ ID NO:13 轻链可变域VL变体6，抗PD-L1 243.55
SEQ ID NO:14 轻链可变域VL变体7，抗PD-L1 243.55
SEQ ID NO:15 轻链可变域VL变体8，抗PD-L1 243.55
SEQ ID NO:16 轻链可变域VL变体9，抗PD-L1 243.55
SEQ ID NO:17 轻链可变域VL变体10，抗PD-L1 243.55
SEQ ID NO:18 轻链可变域VL变体11，抗PD-L1 243.55
SEQ ID NO:19 轻链可变域VL变体12，抗PD-L1 243.55
SEQ ID NO:20 轻链可变域VL变体13，抗PD-L1 243.55
SEQ ID NO:21 轻链可变域VL变体14，抗PD-L1 243.55
SEQ ID NO:22 轻链可变域VL变体15，抗PD-L1 243.55
SEQ ID NO:23 轻链可变域VL变体16，抗PD-L1 243.55
发明详述
PD-L1(编程性死亡配体1)是结合PD-1(一种在T细胞活化后在T细胞上表达，在长期刺激的状态下诸如在慢性感染或癌症中维持的抑制性受体)的两种配体(PD-L1和PD-L2)之一(参见例如Blank C et al,Cancer Immunol Immunother,2005,54:307-14；及Keir ME et al,Annual Rev Immunol,2008,26:677-704)。已经报告了肿瘤细胞上PD-L1的异常表达使得它们的免疫原性低得多(Dong H et al,Nat Med,2002,8:793-800)且阻止抗肿瘤免疫力，导致免疫逃脱(Blank C et al,Cancer Immunol Immunother,2007,56:739-45)。用单克隆抗体阻断PD-L1或PD-1在数种小鼠肿瘤模型中导致强且常常迅速的抗肿瘤效果(参见例如Iwai Y.et al,Proc Natl Acad Sci USA,2002,99:12293-7；及Strome SE et al,Cancer Res 2003,63:6501-5)，提示肿瘤特异性T细胞可能以无活性或受阻抑状态存在于肿瘤微环境中，而且抑制PD-1/PD-L1途径可能重新激励肿瘤特异性T细胞应答。基于该实验数据，预期阻断PD-L1或PD-1增强正在发生的针对肿瘤抗原的免疫应答(Merelli B et al,Crit Rev Oncol Hematol.,2014,89:140-65)。例如，对PD-L1的抗体记载于例如WO 2010/077634。
经由它在抗原呈递细胞(APC)(包括B淋巴细胞，树突细胞(DC)，和单核细胞)上的表达，CD40(肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的一个成员)是抗肿瘤免疫应答的一种至关重要调节物(参见例如Grewal IS et al,Ann Rev Immunol,1998,16:111-35；Van Kooten C et al,J Leukoc.Biol,2000,67:2-17；及O'Sullivan B et al,Crit Rev Immunol.2003,23(1 2):83-107)。经CD40刺激的DC上调抗原加工和呈递途径并迁移至淋巴结以活化幼稚T细胞。在鼠模型中显示了激动性CD40抗体替代CD4+淋巴细胞的功能，导致细胞毒性T淋巴细胞(CTL)扩充，能够清除已建立的淋巴瘤(参见例如Sotomayor EM et al,Nature Medicine,1999,5(7):780-7；及Gladue RP et al,Cancer Immunol Immunother,2011,60(7):1009-17)。CD40激动剂通过活化宿主APC，然后宿主APC驱动针对肿瘤的T细胞应答来触发免疫刺激(参见例如Vonderheide RH,Clin Cancer Res,2007,13:1083-8)。
CD40激动剂和PD-L1抑制剂的组合如此可经由CD40激动活性触发次级淋巴器官中抗肿瘤T细胞的引发和扩充，同时去除PD-1/PD-L1介导的抗肿瘤T细胞免疫遏制。然而，免疫疗法和更具体而言T细胞介导的免疫应答还可能导致严重的不利事件(AE)，诸如输注相关反应，细胞因子释放(CRS，“细胞因子风暴”或“高细胞因子血症”)，和免疫相关毒性。
依照本发明，现在已经发现CD40激动剂和PD-L1抑制剂的组合，顺序或同时应用在体内导致超过叠加的(即协同性的)肿瘤生长抑制和甚至个别肿瘤消除。在一个优选实施方案中，这两种成分(即CD40激动剂和PD-L1抑制剂)的施用是顺序的。
因此，在一个实施方案中，本发明提供包含CD40激动剂和PD-L1抑制剂的协同性组合。
在另一个实施方案中，本发明提供所述CD40激动剂和所述PD-L1抑制剂在人中的可接受的(即可耐受的)应用的剂量和剂量方案。对于当前组合治疗，这些剂量和剂量方案降低或消除免疫相关毒性的风险且提高安全性概况和耐受性。
人CD40抗原是一种50kDa细胞表面糖蛋白，它属于肿瘤坏死因子受体(TNF-R)家族(Stamenkovic et al.,EMBO J.8:1403-10(1989))。它也称作“肿瘤坏死因子受体超家族成员5”。备选名称包括B细胞表面抗原40，Bp50，CD40L受体，CDw40，CDW40，MGC9013，p50或TNFRSF5。它以例如UniProt编目号P25942登记。在一个实施方案中，人CD40抗原具有依照SEQ ID NO:1的序列(见表1)。
表1：人CD40抗原的蛋白质序列
人PD-L1(或PDL1)抗原也称作“编程性细胞死亡1配体1”或CD274分子。备选名称包括B7-H，B7H1，B7-H1，B7同系物1，MGC142294，MGC142296，PDCD1L1，PDCD1LG1，PDCD1配体1，PDL1，PD-L1，编程性死亡配体1。在一个实施方案中，人PD-L1抗原具有SEQ ID NO:2的序列(表2)，如例如以UniProt编目号Q9NZQ7登记的。
表2：人PD-L1抗原的蛋白质序列
依照本发明，“抗CD40抗体”(或“CD40抗体”，“a-CD40抗体”)是结合，或特异性结合且活化人CD40的抗体。在一个实施方案中，人CD40具有依照SEQ ID NO:1的序列。如本文中使用的，“结合人CD40”或“特异性结合人CD40”或“结合人CD40的”或“抗CD40抗体”指以1.0x10-8mol/l或更小的KD值，在一个实施方案中，1.0x10-9mol/l或更小的KD值的结合亲和力特异性结合人CD40抗原的抗体。结合亲和力用标准结合测定法，诸如表面等离振子共振技术(GE-Healthcare Uppsala，Sweden)来测定。如此，如本文中使用的，“结合且活化人CD40的抗体”指以1.0x10-8mol/l或更小(在一个实施方案中，1.0x10-8mol/l-1.0x10-13mol/l)的KD，在一个实施方案中，1.0x10-9mol/l或更小(在一个实施方案中，1.0x10-9mol/l-1.0x10-13mol/l)的KD的结合亲和力特异性结合人CD40抗原的抗体。在另一个实施方案中，依照本发明的抗CD40抗体以4x10-10M或更小的KD结合人CD40。
在本发明的一个实施方案中，结合人CD40的抗体是激动剂(“CD40激动剂”)。“激动剂”与细胞上的受体结合并启动与该受体的天然配体所启动的相似或相同的反应或活性。“CD40激动剂”诱导任何或所有，但不限于下述应答：B细胞增殖和/或分化；经由诸如ICAM-1，E-选择蛋白，VC-AM，等等分子的细胞间粘附的上调；促炎性细胞因子诸如IL-1，IL-6，IL-8，IL-12，TNF，等等的分泌；通过诸如TRAF(例如TRAF2和/或TRAF3)，MAP激酶诸如NIK(NF-kB诱导性激酶)，I-κB激酶(IKK/.β.)，转录因子NF-kB，Ras和MEK/ERK途径，PI3K AKT途径，P38MAPK途径，等等途径的经由CD40受体的信号转导；通过诸如XIAP，mcl-1，bcl-x，等等分子的抗凋亡信号的转导；B和/或T细胞记忆产生；B细胞抗体生成；B细胞同种型转换，MHC II类和CD80/86的细胞表面表达的上调，等等。
激动剂活性意图是比由阴性对照诱导的激动剂活性大至少30％，35％，40％，45％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，或100％的激动剂活性，如在B细胞应答的测定法测量的。
在另一个实施方案中，CD40激动剂具有比由阴性对照诱导的激动剂活性大至少2倍或大至少3倍的激动剂活性，如在B细胞应答的测定法测量的。
如此，例如，在感兴趣的B细胞应答是B细胞增殖的情况中，激动剂活性会是诱导比由阴性对照诱导的B细胞增殖水平大至少2倍或大至少3倍的B细胞增殖水平。
如本文中使用的，“CD40激动剂”包括激动CD40/CD40L相互作用的任何模块。典型地，这些模块会是激动性CD40抗体或激动性CD40L多肽。举例而言，这些抗体包括特异性激动CD40/CD40L结合相互作用的人抗体，嵌合抗体，人源化抗体，双特异性抗体，scFv，和抗体片段。在一个实施方案中，激动性CD40抗体会包含嵌合的，完全人的或人源化的CD40抗体。在另一个优选实施方案中，激动性CD40抗体会包含嵌合的，完全人的或人源化的CD40抗体。
在一个实施方案中，所述CD40抗体是IgG2亚类的完全人抗体。在还有另一个实施方案中，所述抗体是WO2003/040170中具体披露的任何抗CD40抗体。在仍有另一个实施方案中，依照本发明的CD40激动剂选自下组：依照WO2003/040170的称作3.1.1，7.1.2，10.8.3，15.1.1，21.4.1，21.2.1，22.1.1，23.5.1，23.25.1，23.29.1和24.2.1的抗体。分泌那些抗体的杂交瘤已经依照布达佩斯条约保藏。保藏号可见WO2003/040170的段落[0250]。在另一个实施方案中，依照本发明的CD40抗体包含抗体21.4.1(ATCC保藏号PTA-3605)的重链可变域氨基酸序列和轻链可变域氨基酸序列。在还有另一个实施方案中，依照本发明的CD40抗体由抗体21.4.1(ATCC保藏号PTA-3605)的重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列组成。
在一个实施方案中，依照本发明的人抗CD40抗体包含氨基酸SEQ ID NO:3的轻链可变域和氨基酸SEQ ID NO:4的重链可变域(表3)。
表3：依照本发明的CD40激动剂的轻链可变域(VL)和重链可变域(VH)的氨基酸序列。
依照本发明，“PD-L1抗体”是结合或特异性结合人PD-L1的抗体。在一个实施方案中，人PD-L1具有依照SEQ ID NO:2的序列。如本文中使用的，“结合人PD-L1”或“特异性结合人PD-L1”或“结合人PD-L1的”或“抗PD-L1抗体”指以1.0x10-8mol/l或更低的KD值，在一个实施方案中，1.0x10-9mol/l或更低的KD值的结合亲和力特异性结合人PD-L1抗原的抗体。结合亲和力用标准结合测定法，诸如表面等离振子共振技术(GE-Healthcare Uppsala，Sweden)来测定。如此，如本文中使用的，“结合人PD-L1的抗体”指以1.0x10-8mol/l或更低(在一个实施方案中，1.0x10-8mol/l-1.0x10-13mol/l)的KD，在一个实施方案中，1.0x10-9mol/l或更多(在一个实施方案中，1.0x10-9mol/l-1.0x10-13mol/l)的KD的结合亲和力特异性结合人PD-L1抗原的抗体。
在一个实施方案中，本文所述组合疗法中使用的结合人PD-L1的抗体选自下组：243.55.S70，243.55.H1，243.55.H12，243.55.H37，243.55.H70，243.55.H89，243.55.S1，243.55.5，243.55.8，243.55.30，243.55.34，243.55.S37，243.55.49，243.55.51，243.55.62，和243.55.84。
这些抗体记载于WO 2010/77634(序列显示于WO 2010/77634的图11)且特征在于包含下述重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)序列(表4)：
表4：选定PD-L1抗体的VH和VL的组合
表5：依照表4的SEQ ID NO的序列
因此，依照本发明，结合人PD-L1的抗体(即成分B的抗体)特征在于
a)SEQ ID NO:5的重链可变域VH和SEQ ID NO:8的轻链可变域VL，或
b)SEQ ID NO:6的重链可变域VH和SEQ ID NO:9的轻链可变域VL，或
c)SEQ ID NO:6的重链可变域VH和SEQ ID NO:10的轻链可变域VL，或
d)SEQ ID NO:6的重链可变域VH和SEQ ID NO:11的轻链可变域VL，或
e)SEQ ID NO:6的重链可变域VH和SEQ ID NO:12的轻链可变域VL，或
f)SEQ ID NO:6的重链可变域VH和SEQ ID NO:13的轻链可变域VL，或
g)SEQ ID NO:6的重链可变域VH和SEQ ID NO:14的轻链可变域VL，或
h)SEQ ID NO:6的重链可变域VH和SEQ ID NO:15的轻链可变域VL，或
i)SEQ ID NO:6的重链可变域VH和SEQ ID NO:16的轻链可变域VL，或
j)SEQ ID NO:6的重链可变域VH和SEQ ID NO:17的轻链可变域VL，或
k)SEQ ID NO:6的重链可变域VH和SEQ ID NO:18的轻链可变域VL，或
l)SEQ ID NO:6的重链可变域VH和SEQ ID NO:19的轻链可变域VL，或
m)SEQ ID NO:6的重链可变域VH和SEQ ID NO:20的轻链可变域VL，或
n)SEQ ID NO:6的重链可变域VH和SEQ ID NO:21的轻链可变域VL，或
o)SEQ ID NO:6的重链可变域VH和SEQ ID NO:22的轻链可变域VL，或
p)SEQ ID NO:7的重链可变域VH和SEQ ID NO:23的轻链可变域VL。
因此，在一个实施方案中，本发明提供一种药物产品，其包含A)第一成分，该第一成分包含作为活性组分的特异性结合且活化人CD40的抗体或其抗原结合部分；和B)第二成分，该第二成分包含作为活性组分的PD-L1抗体；其用于组合，顺序或同时治疗增殖性疾病，特别是癌症。
在这个实施方案内，A)中的抗体是以4x10-10M或更小的KD结合人CD40的IgG2亚类的完全人抗体；或包含SEQ ID NO:3的VL和SEQ ID NO:4的VH的抗体；或包含抗体21.4.1(ATCC保藏号PTA-3605)的重链可变域氨基酸序列和轻链可变域氨基酸序列的抗体；或包含抗体21.4.1(ATCC保藏号PTA-3605)的重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列的抗体；且B)中的抗体是本文中之前a)至p)中提到的任何PD-L1抗体。
在还有另一个实施方案中，本发明提供一种药物产品，其包含A)第一成分，该第一成分包含作为活性组分的以4x10-10M或更小的KD结合人CD40的IgG2亚类的完全人抗体；和B)第二成分，该第二成分包含作为活性组分的选自包含下述各项的抗体的PD-L1抗体：
a)SEQ ID NO:5的重链可变域VH和SEQ ID NO:8的轻链可变域VL，或
b)SEQ ID NO:6的重链可变域VH和SEQ ID NO:9的轻链可变域VL，或
c)SEQ ID NO:6的重链可变域VH和SEQ ID NO:10的轻链可变域VL，或
d)SEQ ID NO:6的重链可变域VH和SEQ ID NO:11的轻链可变域VL，或
e)SEQ ID NO:6的重链可变域VH和SEQ ID NO:12的轻链可变域VL，或
f)SEQ ID NO:6的重链可变域VH和SEQ ID NO:13的轻链可变域VL，或
g)SEQ ID NO:6的重链可变域VH和SEQ ID NO:14的轻链可变域VL，或
h)SEQ ID NO:6的重链可变域VH和SEQ ID NO:15的轻链可变域VL，或
i)SEQ ID NO:6的重链可变域VH和SEQ ID NO:16的轻链可变域VL，或
j)SEQ ID NO:6的重链可变域VH和SEQ ID NO:17的轻链可变域VL，或
k)SEQ ID NO:6的重链可变域VH和SEQ ID NO:18的轻链可变域VL，或
l)SEQ ID NO:6的重链可变域VH和SEQ ID NO:19的轻链可变域VL，或
m)SEQ ID NO:6的重链可变域VH和SEQ ID NO:20的轻链可变域VL，或
n)SEQ ID NO:6的重链可变域VH和SEQ ID NO:21的轻链可变域VL，或
o)SEQ ID NO:6的重链可变域VH和SEQ ID NO:22的轻链可变域VL，或
p)SEQ ID NO:7的重链可变域VH和SEQ ID NO:23的轻链可变域VL；
其用于组合，顺序或同时治疗增殖性疾病，特别是癌症。
在还有另一个实施方案中，本发明提供一种药物产品，其包含A)第一成分，该第一成分包含作为活性组分的包含SEQ ID NO:3的VL和SEQ ID NO:4的VH的抗体；和B)第二成分，该第二成分包含作为活性组分的选自包含下述各项的抗体的PD-L1抗体：
a)SEQ ID NO:5的重链可变域VH和SEQ ID NO:8的轻链可变域VL，或
b)SEQ ID NO:6的重链可变域VH和SEQ ID NO:9的轻链可变域VL，或
c)SEQ ID NO:6的重链可变域VH和SEQ ID NO:10的轻链可变域VL，或
d)SEQ ID NO:6的重链可变域VH和SEQ ID NO:11的轻链可变域VL，或
e)SEQ ID NO:6的重链可变域VH和SEQ ID NO:12的轻链可变域VL，或
f)SEQ ID NO:6的重链可变域VH和SEQ ID NO:13的轻链可变域VL，或
g)SEQ ID NO:6的重链可变域VH和SEQ ID NO:14的轻链可变域VL，或
h)SEQ ID NO:6的重链可变域VH和SEQ ID NO:15的轻链可变域VL，或
i)SEQ ID NO:6的重链可变域VH和SEQ ID NO:16的轻链可变域VL，或
j)SEQ ID NO:6的重链可变域VH和SEQ ID NO:17的轻链可变域VL，或
k)SEQ ID NO:6的重链可变域VH和SEQ ID NO:18的轻链可变域VL，或
l)SEQ ID NO:6的重链可变域VH和SEQ ID NO:19的轻链可变域VL，或
m)SEQ ID NO:6的重链可变域VH和SEQ ID NO:20的轻链可变域VL，或
n)SEQ ID NO:6的重链可变域VH和SEQ ID NO:21的轻链可变域VL，或
o)SEQ ID NO:6的重链可变域VH和SEQ ID NO:22的轻链可变域VL，或
p)SEQ ID NO:7的重链可变域VH和SEQ ID NO:23的轻链可变域VL；
其用于组合，顺序或同时治疗增殖性疾病，特别是癌症。
在还有另一个实施方案中，本发明提供一种药物产品，其包含A)第一成分，该第一成分包含作为活性组分的包含抗体21.4.1(ATCC保藏号PTA-3605)的重链可变域氨基酸序列和轻链可变域氨基酸序列的抗体；和B)第二成分，该第二成分包含作为活性组分的选自包含下述各项的抗体的PD-L1抗体：
a)SEQ ID NO:5的重链可变域VH和SEQ ID NO:8的轻链可变域VL，或
b)SEQ ID NO:6的重链可变域VH和SEQ ID NO:9的轻链可变域VL，或
c)SEQ ID NO:6的重链可变域VH和SEQ ID NO:10的轻链可变域VL，或
d)SEQ ID NO:6的重链可变域VH和SEQ ID NO:11的轻链可变域VL，或
e)SEQ ID NO:6的重链可变域VH和SEQ ID NO:12的轻链可变域VL，或
f)SEQ ID NO:6的重链可变域VH和SEQ ID NO:13的轻链可变域VL，或
g)SEQ ID NO:6的重链可变域VH和SEQ ID NO:14的轻链可变域VL，或
h)SEQ ID NO:6的重链可变域VH和SEQ ID NO:15的轻链可变域VL，或
i)SEQ ID NO:6的重链可变域VH和SEQ ID NO:16的轻链可变域VL，或
j)SEQ ID NO:6的重链可变域VH和SEQ ID NO:17的轻链可变域VL，或
k)SEQ ID NO:6的重链可变域VH和SEQ ID NO:18的轻链可变域VL，或
l)SEQ ID NO:6的重链可变域VH和SEQ ID NO:19的轻链可变域VL，或
m)SEQ ID NO:6的重链可变域VH和SEQ ID NO:20的轻链可变域VL，或
n)SEQ ID NO:6的重链可变域VH和SEQ ID NO:21的轻链可变域VL，或
o)SEQ ID NO:6的重链可变域VH和SEQ ID NO:22的轻链可变域VL，或
p)SEQ ID NO:7的重链可变域VH和SEQ ID NO:23的轻链可变域VL；
其用于组合，顺序或同时治疗增殖性疾病，特别是癌症。
在还有另一个实施方案中，本发明提供一种药物产品，其包含A)第一成分，该第一成分包含作为活性组分的包含抗体21.4.1(ATCC保藏号PTA-3605)的重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列的抗体；和B)第二成分，该第二成分包含作为活性组分的选自包含下述各项的抗体的PD-L1抗体：
a)SEQ ID NO:5的重链可变域VH和SEQ ID NO:8的轻链可变域VL，或
b)SEQ ID NO:6的重链可变域VH和SEQ ID NO:9的轻链可变域VL，或
c)SEQ ID NO:6的重链可变域VH和SEQ ID NO:10的轻链可变域VL，或
d)SEQ ID NO:6的重链可变域VH和SEQ ID NO:11的轻链可变域VL，或
e)SEQ ID NO:6的重链可变域VH和SEQ ID NO:12的轻链可变域VL，或
f)SEQ ID NO:6的重链可变域VH和SEQ ID NO:13的轻链可变域VL，或
g)SEQ ID NO:6的重链可变域VH和SEQ ID NO:14的轻链可变域VL，或
h)SEQ ID NO:6的重链可变域VH和SEQ ID NO:15的轻链可变域VL，或
i)SEQ ID NO:6的重链可变域VH和SEQ ID NO:16的轻链可变域VL，或
j)SEQ ID NO:6的重链可变域VH和SEQ ID NO:17的轻链可变域VL，或
k)SEQ ID NO:6的重链可变域VH和SEQ ID NO:18的轻链可变域VL，或
l)SEQ ID NO:6的重链可变域VH和SEQ ID NO:19的轻链可变域VL，或
m)SEQ ID NO:6的重链可变域VH和SEQ ID NO:20的轻链可变域VL，或
n)SEQ ID NO:6的重链可变域VH和SEQ ID NO:21的轻链可变域VL，或
o)SEQ ID NO:6的重链可变域VH和SEQ ID NO:22的轻链可变域VL，或
p)SEQ ID NO:7的重链可变域VH和SEQ ID NO:23的轻链可变域VL；
其用于组合，顺序或同时治疗增殖性疾病，特别是癌症。
在还有另一个实施方案中，本发明提供一种药物产品，其包含A)第一成分，该第一成分包含作为活性组分的包含SEQ ID NO:3的VL和SEQ ID NO:4的VH的抗体；和B)第二成分，该第二成分包含作为活性组分的包含SEQ ID NO:8的VL和SEQ ID NO:5的VH的抗体；其用于组合，顺序或同时治疗增殖性疾病，特别是癌症。
在还有另一个实施方案中，本发明提供一种药物产品，其包含A)第一成分，该第一成分包含作为活性组分的包含抗体21.4.1(ATCC保藏号PTA-3605)的重链可变域氨基酸序列和轻链可变域氨基酸序列的抗体；和B)第二成分，该第二成分包含作为活性组分的包含抗体243.55.S70的重链可变域氨基酸序列和轻链可变域氨基酸序列的抗体；其用于组合，顺序或同时治疗增殖性疾病，特别是癌症。
在还有另一个实施方案中，本发明提供一种药物产品，其包含A)第一成分，该第一成分包含作为活性组分的包含抗体21.4.1(ATCC保藏号PTA-3605)的重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列的抗体；和B)第二成分，该第二成分包含作为活性组分的包含抗体243.55.S70的重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列的抗体；其用于组合，顺序或同时治疗增殖性疾病，特别是癌症。
在一个实施方案中，成分A)和B)是分开施用的，优选时间相差1，或2，或3，或4，或5，或6，或7天。在另一个实施方案中，成分A)和B)的施用之间的差异可以是介于1天和21天之间，优选介于1天和14天，或1天和10天，或1天和7天之间的任何时间。
在另一个实施方案中，本发明提供特异性结合且活化人CD40的抗体，或其抗原结合部分；和PD-L1抗体用于制造药物的用途，该药物用于组合，顺序或同时治疗增殖性疾病，诸如癌症，优选实体瘤。
本发明进一步包括一种用于治疗需要疗法的患者的方法，其特征在于对该患者施用治疗有效量的依照本发明的抗体。本发明包括依照本发明的抗体用于所描述的疗法的用途。
如此，本发明的一个实施方案是本文所述CD40抗体或其抗原结合部分，其用于与本文所述抗PD-L1抗体组合治疗癌症。如本文中使用的，术语“癌症”可以是例如肺癌，非小细胞肺(NSCL)癌，支气管肺泡细胞肺癌，骨癌，胰腺癌，皮肤癌，头或颈癌，皮肤或眼内黑素瘤，子宫癌，卵巢癌，直肠癌，肛门区癌，胃癌，胃的癌，结肠癌，乳腺癌，子宫癌，输卵管，子宫内膜癌，宫颈癌，阴道癌，外阴癌，何杰金氏病，食管癌，小肠癌，内分泌系统癌，甲状腺癌，甲状旁腺癌，肾上腺癌，软组织肉瘤，尿道癌，阴茎癌，前列腺癌，膀胱癌，肾或输尿管癌，肾细胞癌，肾盂癌，间皮瘤，肝细胞癌，胆管癌，中枢神经系统(CNS)赘生物，脊髓轴肿瘤，脑干胶质瘤，多形性成胶质细胞瘤，星形细胞瘤，许旺细胞瘤，室管膜瘤，成神经管细胞瘤，脑膜瘤，鳞状细胞癌，垂体腺瘤，淋巴瘤，淋巴细胞性白血病，包括任何上述癌症的难治性形式，或一种或多种上述癌症的组合。在一个优选实施方案中，此类癌症是乳腺癌，结直肠癌，黑素瘤，头和颈癌，肺癌或前列腺癌。在一个实施方案中，此类癌症是选自乳腺癌，肺癌，结肠癌，卵巢癌，黑素瘤癌症，膀胱癌，肾的癌，肾癌，肝癌，头和颈癌，结直肠癌，胰腺癌，胃的癌瘤癌，食管癌，间皮瘤或前列腺癌的实体瘤。在另一个实施方案中，此类癌症是血液学肿瘤，诸如例如白血病(诸如AML，CLL)，淋巴瘤，骨髓瘤。在仍有另一个实施方案中，该癌症是乳腺癌，肺癌，结肠癌，结直肠癌，胰腺癌，胃的癌或前列腺癌。
在一个实施方案中，当前组合疗法用于预防或治疗转移。
在一个实施方案中，当前组合疗法用于治疗免疫相关疾病诸如肿瘤免疫或延迟免疫相关疾病诸如肿瘤免疫的进展。
在一个实施方案中，当前组合疗法用于刺激免疫应答或功能，诸如T细胞活性。
术语“表位”表示人CD40或PD-L1中能够特异性结合抗体的蛋白质决定簇。表位通常由诸如氨基酸或糖侧链等分子的化学活性表面编组组成，而且表位通常具有特定三维结构特征，以及特定电荷特征。构象和非构象表位的区别在于在变性溶剂存在下丧失对前者而非后者的结合。
如本文中使用的，“可变域”(轻链可变域VL，重链可变域VH)表示直接牵涉抗体结合抗原的轻和重链域对中的每一个。可变轻和重链域具有相同的整体结构且每个域包含四个框架(FR)区，其序列广泛保守，通过三个“高变区”(或互补决定区，CDR)连接。框架区采取β-片层构象，而CDR可形成连接β-片层结构的环。每条链中的CDR通过框架区保持它们的三维结构且与来自另一条链的CDR一起形成抗原结合位点。抗体的重和轻链CDR3区在依照本发明的抗体的结合特异性/亲和力中发挥特别重要的作用且因此提供本发明的又一个目标。
在本文中使用时，术语“抗体的抗原结合部分”指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。抗体的抗原结合部分包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基。“框架”或“FR”区是可变域中除如本文中定义的高变区残基以外那些区域。因此，抗体的轻和重链可变域自N端至C端包含域FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，和FR4。尤其，重链的CDR3是对抗原结合贡献最大的区域且限定抗体的特性。CDR和FR区依照Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)的标准定义来确定和/或是那些来自“高变环”的残基。
在本发明的一个实施方案中，特异性结合且活化人CD40的抗体的“抗原结合部分”包含抗体21.4.1(ATCC保藏号PTA-3605)的重链可变域和轻链可变域的CDR1，CDR2和CDR3。
如本文中使用的，术语“核酸”或“核酸分子”意图包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链的或双链的，但是优选是双链DNA。
如本申请内使用的，术语“氨基酸”表示天然发生羧基α-氨基酸的组，包括丙氨酸(三字母代码：ala，单字母代码：A)，精氨酸(arg，R)，天冬酰胺(asn，N)，天冬氨酸(asp，D)，半胱氨酸(cys，C)，谷氨酰胺(gln，Q)，谷氨酸(glu，E)，甘氨酸(gly，G)，组氨酸(his，H)，异亮氨酸(ile，I)，亮氨酸(leu，L)，赖氨酸(lys，K)，甲硫氨酸(met，M)，苯丙氨酸(phe，F)，脯氨酸(pro，P)，丝氨酸(ser，S)，苏氨酸(thr，T)，色氨酸(trp，W)，酪氨酸(tyr，Y)，和缬氨酸(val，V)。
抗体的“Fc部分”没有直接牵涉抗体结合抗原，但是展现各种效应器功能。“抗体的Fc部分”是熟练技术人员熟知的术语且基于抗体的木瓜蛋白酶切割来定义。根据它们的重链的恒定区的氨基酸序列，抗体或免疫球蛋白分成类：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，而且这些中的数种可进一步细分成亚类(同种型)，例如IgG1，IgG2，IgG3，和IgG4，IgA1，和IgA2。依照重链恒定区，不同类的免疫球蛋白分别称作α，δ，ε，γ，和μ。抗体的Fc部分直接牵涉ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)和CDC(补体依赖性细胞毒性)，其基于补体活化，C1q结合和Fc受体结合。补体活化(CDC)通过补体因子C1q结合至大多数IgG抗体亚类的Fc部分来启动。虽然抗体对补体系统的影响取决于某些条件，但是结合至C1q是由Fc部分中限定的结合位点引起的。此类结合位点是现有技术已知的且记载于例如Boackle,R.J.,et al.,Nature 282(1979)742-743；Lukas,T.J.,et al.,J.Immunol.127(1981)2555-2560；Brunhouse,R.,and Cebra,J.J.,Mol.Immunol.16(1979)907-917；Burton,D.R.,et al.,Nature 288(1980)338-344；Thommesen,J.E.,et al.,Mol.Immunol.37(2000)995-1004；Idusogie,E.E.,et al.,J.Immunol.164(2000)4178-4184；Hezareh,M.,et al.,J.Virology 75(2001)12161-12168；Morgan,A.,et al.,Immunology 86(1995)319-324；EP 0 307 434。此类结合位点是例如L234，L235，D270，N297，E318，K320，K322，P331和P329(编号方式依照Kabat，E.A.的EU索引，见下文)。亚类IgG1，IgG2和IgG3的抗体通常显示补体活化和C1q和C3结合，而IgG4不活化补体系统且不结合C1q和C3。
在一个实施方案中，依照本发明的抗体可包含自人起源衍生的Fc部分和优选人恒定区的所有其它部分。如本文中使用的，术语“自人起源衍生的Fc部分”表示如下的Fc部分，它是亚类IgG1，或IgG2，或IgG3或IgG4的人抗体的Fc部分，优选来自人IgG1或IgG2亚类的Fc部分，来自人IgG1或IgG2亚类的突变Fc部分(在一个实施方案中，具有L234A+L235A上的突变)，来自人IgG4亚类的Fc部分或来自人IgG4亚类的突变Fc部分，在一个更加具体的实施方案中，具有S228P上的突变。在另一个实施方案中，所述抗体可具有降低的或最小限度的效应器功能。在一个实施方案中，最小限度的效应器功能可源自无效应器性(effectorless)Fc突变。在一个实施方案中，无效应器性Fc突变是L234A/L235A或L234A/L235A/P329G或N297A或D265A/N297A。在一个实施方案中，对于彼此独立的每种抗体，无效应器性Fc突变可选自包含L234A/L235A，L234A/L235A/P329G，N297A和D265A/N297A的组。
在一个实施方案中，依照本发明的抗体是单克隆抗体。在另一个实施方案中，依照本发明的抗体是人IgG类的(即IgG1，或IgG2，或IgG3或IgG4亚类的)。在还有另一个实施方案中，一种抗体优选是IgG2亚类的且另一种是IgG1或IgG4亚类的。
在一个实施方案中，本文所述抗体特征在于人起源的恒定链。此类恒定链是现有技术公知的且记载于例如Kabat，E.A.(参见例如Johnson,G.and Wu,T.T.,Nucleic Acids Res.28(2000)214-218)。
本文所述抗体优选是通过重组手段生成的。此类方法是现有技术广泛知道的且包括在原核和真核细胞中表达蛋白质及随后分离抗体多肽并通常纯化至药学可接受的纯度。对于蛋白质表达，通过标准方法将编码轻和重链或其片段的核酸插入表达载体。在适宜的原核或真核宿主细胞(诸如CHO细胞，NS0细胞，SP2/0细胞，HEK293细胞，COS细胞，酵母，或大肠杆菌细胞)中实施表达，并自细胞(自上清液或在细胞裂解后)回收抗体。
抗体的重组生成是现有技术公知的且记载于例如综述性文章Makrides,S.C.,Protein Expr.Purif.17(1999)183-202；Geisse,S.,et al.,Protein Expr.Purif.8(1996)271-282；Kaufman,R.J.,Mol.Biotechnol.16(2000)151-161；Werner,R.G.,Drug Res.48(1998)870-880。
抗体可以存在于完整细胞中，细胞裂解物中，或经部分纯化的，或实质性纯的形式。实施纯化是为了清除其它细胞成分或其它污染物，例如其它细胞核酸或蛋白质，其通过标准技术进行，包括碱/SDS处理，CsCl成带，柱层析，琼脂糖凝胶电泳，和本领域公知的其它技术。参见Ausubel,F.,et al.,ed.Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing and Wiley Interscience,New York(1987)。
NS0细胞中的表达记载于例如Barnes,L.M.,et al.,Cytotechnology 32(2000)109-123；Barnes,L.M.,et al.,Biotech.Bioeng.73(2001)261-270。瞬时表达记载于例如Durocher,Y.,et al.,Nucl.Acids.Res.30(2002)E9。可变域的克隆记载于Orlandi,R.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)3833-3837；Carter,P.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)4285-4289；Norderhaug,L.,et al.,J.Immunol.Methods 204(1997)77-87。一种优选的瞬时表达系统(HEK 293)记载于Schlaeger,E.-J.and Christensen,K.,in Cytotechnology 30(1999)71-83及Schlaeger,E.-J.,in J.Immunol.Methods 194(1996)191-199
将依照本发明的重和轻链可变域与启动子，翻译起始，恒定区，3'非翻译区，聚腺苷酸化，和转录终止的序列组合以形成表达载体构建物。可以将重和轻链表达构建物组合成单一载体，共转染，连续转染，或分开转染入宿主细胞，然后融合宿主细胞以形成表达这两条链的单一宿主细胞。
例如，对于原核生物合适的控制序列包括启动子，任选的操纵基因序列，和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子，增强子和聚腺苷酸化信号。
当核酸放置成与另一核酸序列处于功能性关系时，它是“可操作连接的”。例如，如果前序列(presequence)或分泌前导的DNA表达成参与多肽的分泌的前蛋白(preprotein)，那么它与多肽的DNA可操作连接；如果启动子或增强子影响编码序列的转录，那么它与该序列可操作连接；或者如果核糖体结合位点的定位推动翻译，那么它与编码序列可操作连接。通常，“可操作连接”意味着所连接的DNA序列是毗邻的，而且在分泌前导的情况中是毗邻且同框的。然而，增强子不必是毗邻的。连接通过方便的限制性位点处的连接来实现。如果不存在此类位点，那么依照常规实践使用合成寡核苷酸衔接头或接头。
通过常规免疫球蛋白纯化规程将单克隆抗体与培养液恰当分开，诸如例如蛋白A-Sepharose，羟磷灰石层析，凝胶电泳，透析，或亲和层析。编码单克隆抗体的DNA和RNA易于使用常规规程来分离和测序。杂交瘤细胞可充当此类DNA和RNA的来源。一旦分离，就可以将DNA插入表达载体，然后将表达载体转染入其它情况下不生成免疫球蛋白蛋白质的宿主细胞(诸如HEK293细胞，CHO细胞，或骨髓瘤细胞)，以在宿主细胞中获得重组单克隆抗体的合成。
如本文中使用的，表述“细胞”，“细胞系”，和“细胞培养物”可互换使用，而且所有此类名称包括后代。如此，词语“转化子”和“经转化细胞”包括原代主题细胞及自其衍生的培养物，不管传代的次数。还要理解的是，由于有意或无意的突变，所有后代在DNA内容方面可以不是精确相同的。包括具有与初始转化细胞中所筛选的相同的功能或生物学活性的变体后代。
用于生成依照本发明使用的特定抗体的方法还披露于WO2003/040170(关于抗CD40抗体)和WO2010/77634(关于PD-L1抗体)。
在另一个方面，本发明提供含有一种或一组本发明的单克隆抗体或其抗原结合部分，与药学可接受载剂一起配制的组合物，例如药物组合物。
如本文中使用的，“药学可接受载剂”包括任何和所有生理学相容的溶剂，分散介质，涂层，抗细菌和抗真菌剂，等张和吸收/再吸收延迟剂，等等。优选的是，载剂适合于注射或输注。
本发明的组合物可以通过多种本领域已知方法来施用。正如技术人员会领会的，施用路径和/或模式会根据期望结果而变化。
药学可接受载剂包括无菌含水溶液或分散体和用于制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。此类介质和药剂对于药学活性物质的用途是本领域已知的。在水以外，载剂还可以是例如等张缓冲盐水溶液。
不管所选择的施用路径，通过本领域技术人员知道的常规方法将可以以合适水合形式使用的本发明的化合物和/或本发明的药物组合物配制成药学可接受剂量形式。
依照本发明使用的特定抗体的药物组合物可以是技术人员知道的标准制剂，而且披露于例如WO2003/040170(关于抗CD40抗体)和WO2010/77634(关于PD-L1抗体)。
本发明的药物组合物中活性组分的实际剂量水平可以变化，从而获得活性组分对特定患者，组合物，和施用模式有效实现期望治疗性响应，对患者无毒的量(有效量)。所选择的剂量水平会取决于多种药动学因素，包括所采用的本发明特定组合物或其酯，盐或酰胺的活性，施用路径，施用时间，所采用的特定化合物的排泄速率，与所采用的特定组合物组合使用的其它药物，化合物和/或材料，所治疗的患者的年龄，性别，重量，状况，整体健康和在先医学史，及医学领域公知的类似因素。
术语“方法治疗”或其等同语在应用于例如癌症时指设计成减少或消除患者中癌细胞的数目，或减轻癌症的症状的规程或作用过程。癌症或其它增殖性病症的“治疗方法”并非必然意味着癌细胞或其它病症事实上会消除，细胞或病症的数目事实上会减少，或癌症或其它病症的症状事实上会减轻。通常，即使成功的可能性较低，但是鉴于患者的医学史和估算存活预期，仍然认为诱导总体有益作用过程，也会实施治疗癌症的方法。
术语“组合施用”或“共施用”，“组合疗法”或“组合治疗”指例如作为分开的配制剂/应用(或作为单一配制剂/应用)施用本文所述抗CD40抗体和抗PD-L1抗体。共施用可以是同时的或者是任意次序顺序的，其中优选有一段时间所有活性剂同时发挥它们的生物学活性。在一个实施方案中，本文中使用的成分A和B任一可以使用静脉内路径(i.v.)，例如经由连续输注，或皮下路径(s.c.)通过它自己的，分开的药物制剂来施用。在一个实施方案中，成分A和B通过静脉内路径/制剂分开共施用。在另一个实施方案中，成分A和B通过皮下路径/制剂分开共施用。在仍有另一个实施方案中，成分A和B分开共施用，一个通过皮下路径/制剂，另一个通过静脉内路径/制剂。
不言自明的是，以“治疗有效量”(或简单的说，“有效量”)将抗体施用于患者，该量的相应化合物或组合会引发研究人员，兽医，医生或其他临床医师寻求的组织，系统，动物或人的生物学或医学应答。
共施用的每种成分的剂量和共施用的时机会取决于所治疗的患者的类型(物种，性别，年龄，重量，等)和状况及所治疗的疾病或疾患的严重程度。特别地，基于免疫系统活化的治疗一般可能携带压倒性免疫应答(有时称作细胞因子释放综合征(CRS))或抗药物抗体(ADA)应答的风险。找到牵涉CD40激动剂的治疗性临床相关治疗方案(即可耐受的且有效的剂和剂量进度表)构成一项当前未满足的医学需求。
如此，在一个实施方案中，顺序共施用成分(A和B)，其中或是在同一天在两次分开的施用(i.v.或s.c.)中施用每种单一成分的剂量，或是在第1天施用一种并在第2天和第42天之间，或第2天和第21天之间，或第2天和第14天之间，或第2天和第7天之间的任何一天共施用第二种成分。在另一个实施方案中，在施用第一种成分之后在第2，或7，或14，或21天共施用第二种成分。在另一个实施方案中，在施用第一种成分之后在第2天或第21天共施用第二种成分。
在另一个实施方案中，第一个施用的成分是成分A，即如本文中限定的抗CD40抗体。在这个实施方案内，以介于4mg和16mg之间，优选4mg，或8mg，或16mg的固定剂量施用成分A。
在另一个实施方案中，在第1天以16mg的剂量施用成分A一次，接着是第42天的成分B的给药以及每3周，或每14或7天的成分B的进一步维持给药。
在另一个实施方案中，在第1天以16mg的剂量施用成分A一次，接着是第21天的成分B的第一次给药以及每3周，或每14或7天的成分B的进一步维持给药。
在另一个实施方案中，在第1天以4mg的剂量施用成分A一次，接着是第21天的成分B的第一次给药以及每3周，或每14或7天的成分B的进一步维持给药。
在另一个实施方案中，在第1天以4mg的剂量施用成分A一次，接着是第14天的成分B的第一次给药以及每3周，或每14或7天的成分B的进一步维持给药。
在另一个实施方案中，在第1天以4mg的剂量施用成分A一次，接着是第7天的成分B的第一次给药以及每3周，或每14或7天的成分B的进一步维持给药。
在另一个实施方案中，在第1天以16mg的剂量施用成分A一次，接着是第14天的成分B的第一次给药以及每3周，或每14或7天的成分B的进一步维持给药。
在另一个实施方案中，在第1天以16mg的剂量施用成分A一次，接着是第7天的成分B的第一次给药以及每3周，或每14或7天的成分B的进一步维持给药。
在另一个实施方案中，在第1天施用成分B，接着是第2天成分A以介于4mg和16mg之间的固定剂量的单次施用；再接着是每3周，或每14或7天的成分B的维持给药。在这个实施方案内，成分A的固定剂量优选选自4mg，8mg，14mg，15mg或16mg。
在还有另一个实施方案中，在治疗的第1天施用成分B，接着是每3周(21天)的进一步施用，并且在治疗的第2天施用成分A，接着是3次另外的施用，每次间隔在6周(42天)内。在这个实施方案内，以介于4mg和16mg之间，优选4mg，8mg，14mg，15mg或16mg的固定剂量施用成分A。
在还有另一个实施方案中，在治疗的第1天施用成分B，接着是每3周(21天)的进一步施用，并且在治疗的第2天施用成分A，接着是3次另外的施用，每次间隔在3周(21天)内。在这个实施方案内，以介于4mg和16mg之间，优选4mg，8mg，14mg，15mg或16mg的固定剂量施用成分A。
在涉及施用/剂量方案的所有上述实施方案内，以1200mg的固定剂量施用成分B(即抗PD-L1抗体)。继续成分B的治疗或“维持给药”直至疾病进展。
在还有另一个实施方案中，本发明提供牵涉抗CD40抗体和抗PD-L1抗体的组合疗法的任何剂量进度表，如图4中所示。
如此，在一个实施方案中，本发明提供一种药物产品，其包含如本文中限定的成分A和B，其中成分A)和B)是分开施用的。
在另一个实施方案中，本发明提供所述药物产品，其中成分A和/或B是静脉内(i.v.)或皮下(s.c.)施用的。
在还有另一个实施方案中，本发明提供所述药物产品，其中成分A是以介于4和16mg之间的固定剂量施用的，且成分B是以1200mg的固定剂量施用的。
在仍有另一个实施方案中，本发明提供所述药物产品，其中成分A和B的施用隔开1至42天，优选1，或7，或14或21或42天。
在仍有另一个实施方案中，本发明提供所述药物产品，其中成分A与成分B一起施用1至4次，随后只用成分B继续治疗直至疾病进展。
在另一个更加具体的实施方案中，本发明提供任何上述剂量方案，其中成分A是如下的成分，其包含作为活性组分的包含SEQ ID NO:3的VL和SEQ ID NO:4的VH的抗体；且成分B是如下的成分，其包含作为活性组分的包含SEQ ID NO:8的VL和SEQ ID NO:5的VH的抗体。
在另一个实施方案中，本发明提供特异性结合且活化人CD40的抗体或其抗原结合部分；和PD-L1抗体用于制造药物的用途，该药物用于组合，顺序或同时治疗增殖性疾病，诸如癌症，优选实体瘤。
在与抗PD-L1抗体组合的抗CD40抗体以外，还可以涵盖别的治疗选项，诸如化疗剂或放疗。
在一个实施方案中，此类可以与本文所述抗CD40抗体和本文所述抗PD-L1抗体一起施用的别的化疗剂包括但不限于抗肿瘤剂，包括烷化剂，包括：氮芥，诸如二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、异环磷酰胺(ifosfamide)、美法仑(melphalan)和苯丁酸氮芥(chlorambucil)；亚硝基脲(nitrosourea)，诸如卡莫司汀(carmustine)(BCNU)、洛莫司汀(lomustine)(CCNU)、和司莫司汀(semustine)(甲基-CCNU)；TemodalTM(替莫唑胺(temozolamide))、乙撑亚胺/甲基蜜胺诸如三乙撑蜜胺(TEM)、三乙烯硫代磷酰胺(塞替派(thiotepa))、六甲基蜜胺(HMM，六甲蜜胺(altretamine))；烃基磺酸酯，诸如白消安(busulfan)；三嗪，诸如达卡巴嗪(dacarbazine)(DTIC)；抗代谢物，包括叶酸类似物，诸如甲氨喋呤(methotrexate)和三甲曲沙(trimetrexate)，嘧啶类似物，诸如5-氟尿嘧啶(5FU)、氟脱氧尿苷、吉西他滨(gemcitabine)、胞嘧啶阿拉伯糖苷(AraC，阿糖胞苷(cytarabine))、5-氮胞苷、2,2'-二氟脱氧胞苷，嘌呤类似物，诸如6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、硫唑嘌呤(azathioprine)、T-脱氧柯福霉素(喷司他丁(pentostatin))、赤式羟基壬基腺嘌呤(erythrohydroxynonyladenine,EHNA)、磷酸氟达拉滨(fludarabine phosphate)、和2-氯脱氧腺苷(克拉屈滨(cladribine)，2-CdA)；天然产物，包括抗有丝分裂药物，诸如帕利他赛(paclitaxel)、长春花生物碱(包括长春碱(vinblastine)(VLB)、长春新碱(vincristine)、和长春瑞滨(vinorelbine))、泰索帝(taxotere)、雌莫司汀(estramustine)、和磷酸雌莫司汀；表鬼臼毒素(pipodophylotoxin)，诸如依托泊苷(etoposide)和替尼泊苷(teniposide)；抗生素，诸如放线菌素D(actinomycin D)、道诺霉素(daunomycin)(柔红霉素(rubidomycin))、多柔比星(doxorubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、伊达比星(idarubicin)、博来霉素(bleomycin)、普卡霉素(plicamycin)(光辉霉素(mithramycin))、丝裂霉素C(mitomycin C)、和放线菌素(actinomycin)；酶，诸如L-天冬酰胺酶；生物学应答改性剂，诸如干扰素-α、IL-2、G-CSF和GM-CSF；包括铂配位复合物的混杂剂，诸如奥沙利铂(oxaliplatin)、顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)，蒽二酮，诸如米托蒽醌(mitoxantrone)，取代的脲，诸如羟基脲、甲基肼衍生物，包括N-甲基肼(MIH)和丙卡巴肼(procarbazine)、肾上腺皮质阻抑剂，诸如米托坦(mitotane)(o、p-DDD)和氨鲁米特(aminoglutethimide)；激素和拮抗剂，包括肾上腺皮质类固醇拮抗剂，诸如强的松(prednisone)及等效物、地塞米松(dexamethasone)和氨鲁米特(aminoglutethimide)；GemzarTM(吉西他滨(gemcitabine))、妊娠素，诸如己酸羟基孕酮(hydroxyprogesterone caproate)、乙酸甲羟孕酮(medroxyprogesterone acetate)和乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)；雌激素，诸如己烯雌酚(diethylstilbestrol)和乙炔雌二醇等效物；抗雌激素，诸如他莫昔芬(tamoxifen)；雄激素，包括丙酸睾酮(testosterone propionate)和氟甲睾酮(fluoxymesterone)/等效物；抗雄激素，诸如氟他胺(flutamide)、促性腺激素释放激素类似物和亮丙瑞林(leuprolide)；和非类固醇抗雄激素，诸如氟他胺(flutamide)。靶向后成机制的疗法包括但不限于组蛋白脱乙酰基酶抑制剂，脱甲基化剂(例如Vidaza)和释放转录阻抑(ATRA)疗法也可以与抗原结合蛋白组合。在一个实施方案中，化疗剂选自下组：紫杉烷(像例如帕利他赛(泰素(Taxol))、多西他赛(泰索帝(Taxotere))、经修饰的帕利他赛(例如Abraxane和Opaxio)、多柔比星、舒尼替尼(Sutent)、索拉非尼(Nexavar)、和其它多激酶抑制剂、奥沙利铂、顺铂和卡铂、依托泊苷、吉西他滨、和长春碱。在一个实施方案中，化疗剂选自下组：紫杉烷(像例如帕利他赛(Taxol)、多西他赛(Taxotere)、经修饰的帕利他赛(例如Abraxane和Opaxio)。在一个实施方案中，别的化疗剂选自5-氟尿嘧啶(5-FU)、亚叶酸、伊立替康、或奥沙利铂。在一个实施方案中，化疗剂为5-氟尿嘧啶、亚叶酸和伊立替康(FOLFIRI)。在一个实施方案中，化疗剂为5-氟尿嘧啶和奥沙利铂(FOLFOX)。
与别的化疗剂的组合疗法的具体例子包括例如有紫杉烷(例如多西他赛或帕利他赛)或经过修饰的帕利他赛(例如Abraxane或Opaxio)，多柔比星，卡培他滨和/或贝伐珠单抗(Avastin)的疗法，用于治疗乳腺癌；有卡铂，奥沙利铂，顺铂，帕利他赛，多柔比星(或经过修饰的多柔比星(Caelyx或Doxil))，或托泊替康(Hycamtin)的疗法，用于卵巢癌；有多激酶抑制剂，MKI(Sutent，Nexavar，或706)和/或多柔比星的疗法，用于治疗肾癌；有奥沙利铂，顺铂和/或放射的疗法，用于治疗鳞状细胞癌；有泰素和/或卡铂的疗法，用于治疗肺癌。
本发明进一步提供一种用于制造药物的方法，该药物包含与药学可接受载剂一起的有效量的依照本发明的抗CD40抗体和/或PD-L1抗体。
本发明进一步提供一种试剂盒，该试剂盒包含一种药物产品，其包含A)特异性结合且活化人CD40的抗体或其抗原结合部分；和B)PD-L1抗体，以及告知技术人员(例如内科医师，肿瘤学家或其他医学从业人员)如何使用所述药物产品作为用于组合，顺序或同时治疗增殖性疾病(诸如癌症，优选实体瘤)的药物的说明书。
在仍有另一个实施方案中，依照本发明的药物产品，即包含本文中公开的成分A和B的产品，可以与第三成分(C)一起施用，其中所述第三成分是抗细胞因子(细胞因子抑制剂)，诸如例如抗IL6(a-IL6)和/或抗TNFα(a-TNFα，抗TNFα)。已经发现添加所述细胞因子抑制剂提高可耐受性同时维持上文公开的成分A和B治疗的功效(见实施例2)。
因此，在另一个实施方案中，提供一种药物产品，其包含A)第一成分，该第一成分包含作为活性组分的特异性结合且活化人CD40的抗体或其抗原结合部分；和B)第二成分，该第二成分包含作为活性组分的PD-L1抗体；和C)第三成分，该第三成分包含作为活性组分的细胞因子抑制剂；其用于组合，顺序或同时治疗增殖性疾病，特别是癌症。
在这个实施方案内，所述细胞因子抑制剂是抑制TNFα的分子。多种TNFα抑制剂，小分子和抗体批准用于人中的疗法。关于它们的可应用药物制剂，施用路径和剂量的信息因而是本领域技术人员公知的。在一个依照本发明的特定实施方案中，TNFα抑制剂是抗体，优选称作TN3-19.12的抗体的人类似物。可以依照本发明使用的其它TNFα抑制剂包括(英夫利昔单抗(infliximab))，(依那西普(etanercept))，(阿达木单抗(adalimumab))，(塞妥珠单抗(certolizumab pegol))和(戈利木单抗(golimumab))。还有，在这个实施方案内，成分C可以与成分A和B同时或分开施用。本文中关于成分A和B的施用公开的任何剂量方案也适用于该三重组合。成分C优选与成分A和/或B同时施用，或是在相同的药物制剂中或是在不同的药物中。本文中关于成分A和B公开的任何剂量方案与成分C一起形成依照本发明的另一个实施方案。在这个实施方案内，在施用成分A或B时还总是施用成分C。
在另一个实施方案中，成分C的施用在成分A和B的施用之前开始。优选地，成分C的施用在治疗的第1天开始，并自第2天起依照本文中之前关于成分A和B限定的剂量方案给予成分A和B。
在另一个实施方案中，优选在治疗的第1，2，3和4天施用成分C；在第2天施用成分A；并在第2天施用成分B，接着是单独的或与成分C组合的成分B的每周施用。
在还有另一个实施方案中，优选在治疗的第1，2，3和4天施用成分C；在第2天施用成分A；并在第9天施用成分B，接着是单独的或与成分C组合的成分B的每周施用。
在还有另一个实施方案中，优选在治疗的第1，2，3和4天施用成分C；在第2天施用成分A；并在第16天施用成分B，接着是单独的或与成分C组合的成分B的每周施用。
提供以下实施例以帮助理解本发明，其真正的范围在所附权利要求书中列出。应当理解，可以在不背离本发明精神的前提下对列出的规程做出修改。
实施例
实施例1
此实施例证明抗鼠CD40与抗PDL-1组合在同位Panc02-Fluc胰腺同基因癌症模型中的治疗功效。在这项研究中，会经由一周两次生物发光成像来评估肿瘤生长。
实验进度表：
研究组
当达到终止标准时会处死每个组的动物。会使用来自媒介组的2只scouts动物来评估疗法启动时的肿瘤负荷。
材料和方法
细胞培养和应用
Panc-02-Fluce细胞克隆(人胰腺癌细胞)最初是自ATCC(美国典型培养物保藏中心)获得的并在扩充后保藏于Roche-Glycart内部细胞库。在含有10％FCS(Sigma)和1％Glutamax+500ug/ml潮霉素的RPMI培养基中培养Panc-02-Fluc细胞。在5％CO2的水饱和气氛中于37℃培养细胞。在麻醉的C57BL/6小鼠的腹部左侧做一小切口。打开腹膜壁并用镊子小心分离胰。将10微升(0.2x106个细胞，在RPMI培养基中)细胞悬浮液注射入胰尾。使用5/0可吸收缝合线闭合腹膜壁和皮肤伤口。
动物
依照提交的指导方针(GV-Solas；Felasa；TierschG)在无特定病原体的条件下以12小时明亮/12小时黑暗的日周期维持60只黑色6雌性小鼠；实验开始时8-9周龄(购自Charles Rivers，Germany)。实验性研究方案得到地方政府审查和批准(P 2011-128)。到达后，将动物维持1周以适应新环境和进行观察。定期进行连续健康监测。
处理
在研究第0天对小鼠胰内注射RPMI中的2x105个Panc02-Fluc细胞(传代18，存活力95.9％)。在第7天对小鼠i.v.注射媒介(15只动物)，10mg/kg a-CD40(15只动物)，10mg/kg a-PD-L1，10mg/kg a-CD40+10mg/kg a-PD-L1。进度表为a-PD-L1和媒介一周一次达3周。a-CD40抗体只在第7天施用一次。
测试化合物(抗体)
化合物的规格
抗体保存于4℃。
对所有小鼠i.v.注射200μL适宜溶液。对媒介组的小鼠注射组氨酸缓冲液并对治疗组注射抗体。为了获得适当量的抗体，在必要时用组氨酸缓冲液稀释抗体溶液。对小鼠进行处理的最大数目是3次。
抗体制备：
10mg/kg等于200μg/小鼠：
下面计算每只小鼠需要的构建物的体积：
调查
监测
每天对动物管理临床症状和不利影响检测。动物的终止标准为临床病态，运动受损，毛皮不洁。
用于肿瘤标志物分析的血清提取
在注射肿瘤细胞之前3天，第一次抗体处理之后24小时和处死当天收集来自所有经处理动物的血清样品。样品保存于-20℃。
尸检
依照终止标准处死小鼠。自所有动物收集脾和肝肿瘤用于随后的组织病理学分析(PFA，冷冻)。
样品加工
切出胰肿瘤，立即在福尔马林溶液中固定，随后为石蜡包埋(Leica自动组织加工仪TP1020，Germany)和微分4μm切片(Leica RM2235旋转切片机，Germany)加工。使用标准方案实施苏木精和曙红染色。使用大鼠抗小鼠CD68(AbD Serotec，Switzerland)依照制造商的说明书检测鼠免疫细胞。
生物化学分析
大鼠IgG-ELISA和mEGFR IgG ELISA
在第一次抗体处理后24小时(研究第8天)对小鼠采血并对血清分析人IgG浓度。使用用于针对CD20的单克隆抗体的量化的ELISA(Roche Pharma Penzberg；TR-TNA5，Germany)依照方案测试血清中的治疗性抗体浓度。试剂单抗<hfcy>IgG-Bi(M-R10Z8E9；Ch.02GG)；单抗<CD20>rH-IgG(RO5072759)；单抗＜hfcy>IgG-Dig(XOSU-Sux)(M-R10Z8E9；Ch.03)由J.Schleypen(Roche Penzberg)馈赠。以连续稀释液(1:2000；1:20000；1:200000)分析血清样品。使用测量波长405nm和参考波长492nm(VersaMax可调式微量板读数仪，Molecular Devices)测量吸光度。
结果
在同基因同位Panc02模型中，与媒介和抗PD-L1相比，muFGK4.5与抗PD-L1抗体的组合展现显著的肿瘤生长抑制。此外，muFGK4.5和抗PD-L1抗体一起在体内协同性增强效应T细胞的扩充，这转化成此模型中9只小鼠中4只中肿瘤的完全消除(图1和2)。
免疫药效学(PD)分析证明了muFGK4.5将小鼠脾和血液中以及淋巴结中活化的T细胞(CD4和CD8)的数目提高大约2倍。有趣的是，9天起动疗法之后muFGK4.5与抗PD-L1抗体的组合将小鼠脾中活化的T细胞的数目进一步提高大约6至7倍(图3)。
实施例2
此实施例证明a-PDL-1和a-CD40与两种不同抗细胞因子(a-IL6和a-TNFa，单独的或一起的)的组合的功效。此信息是有用的，因为那些抗体可用于在a-CD40注射后中和细胞因子释放。
材料和方法
细胞培养和应用
Panc-02-Fluc细胞克隆H7(人胰腺癌细胞)最初是自ATCC(美国典型培养物保藏中心)获得的并在扩充后保藏于内部细胞库。在含有10％FCS(Sigma)和1％Glutamax+500ug/ml潮霉素的RPMI培养基中培养Panc-02-Fluc细胞。在5％CO2的水饱和气氛中于37℃培养细胞。
在麻醉的C57BL/6小鼠的腹部左侧做一小切口。打开腹膜壁并用镊子小心分离胰。将10微升(0.2x106个细胞，在RPMI培养基中)细胞悬浮液注射入胰尾。使用5/0可吸收缝合线闭合腹膜壁和皮肤伤口。
动物
依照提交的指导方针(GV-Solas；Felasa；TierschG)在无特定病原体的条件下以12小时明亮/12小时黑暗的日周期维持60只C57BL/6雌性小鼠；实验开始时8-9周龄(购自Charles Rivers，Germany)。实验性研究方案得到地方政府审查和批准(P 2011-128)。到达后，将动物维持1周以适应新环境和进行观察。之后对它们在背部右侧皮下植入发射机应答器进行鉴别并再维持1周进行恢复。定期进行连续健康监测。
处理
在研究第0天对小鼠胰内注射RPMI中的2x105个Panc02-Fluc细胞(传代16，存活力90.5％)。
在第6，7，8，和9天，对12只小鼠/组i.p.注射不同化合物。在第7，14和21天，对10只小鼠/组i.p.注射不同化合物(见研究组)。
测试化合物(抗体)
化合物的规格
对所有小鼠注射200μL适宜溶液。i.p.注射所有抗体。对媒介组的小鼠注射组氨酸缓冲液并对治疗组注射抗体。为了获得适当量的抗体/200μL，在必要时用组氨酸缓冲液稀释抗体溶液。对小鼠进行处理的最大数目是4次。
调查
监测
每天对动物管理临床症状和不利影响检测。动物的终止标准为临床病态，运动受损，毛皮不洁。
用于化合物分析的血清提取
在第2次，第5次和第6次抗体处理之后1小时收集来自一半经处理动物的血清样品，并在第2次，第5次和第6次抗体处理之后24小时收集来自另一半经处理动物的血清样品。在处死当天对所有动物采血。样品保存于-20℃。
尸检
依照终止标准处死小鼠。自4只小鼠/组收集脾，肝和胰肿瘤用于随后的组织病理学分析(4％甲醛，闪冻)。
样品加工
切出胰肿瘤，肝和脾，立即在10％福尔马林溶液中固定，随后为石蜡包埋(Leica自动组织加工仪TP1020，Germany)和微分4μm切片(Leica RM2235旋转切片机，Germany)加工。使用标准方案实施苏木精和曙红染色。使用大鼠抗小鼠CD68(AbD Serotec，Switzerland)依照制造商的说明书检测鼠免疫细胞。
生物化学分析
mCD40IgG-ELISA和mPDL-1IgG ELISA
使用用于抗CD40的量化的CD40/Fc嵌合物(R&D，1215-CD-050)ELISA依照方案(Roche-Glycart，Switzerland)测试血清中抗CD40浓度。使用试剂；捕捉蛋白质：6xHis标签生物素(Abcam，ab27025)和CD40/Fc嵌合物(R&D，1215-CD-050)，检测抗体：抗小鼠IgG(HRP)，(Abcam，ab98808)。以连续稀释液(1:300，1:1500，1:7500)分析血清样品。使用测量波长405nm和参考波长490nm(VersaMax可调式微量板读数仪，Molecular Devices)测量吸光度。
使用用于抗PD-L1的量化的鼠PD-L1(R&D，1019-B7-100)ELISA依照方案(Roche-Glycart，Switzerland)测试血清中的抗PD-L1浓度。使用试剂；捕捉蛋白质：IgG-FC生物素(Abcam ab98561)和鼠B7-H1/PD-L1(R&D，1019-B7-100)，检测抗体：抗小鼠IgG(HRP)，(Abcam，ab98808)。以连续稀释液(1:2500，1:12500，1:62500)分析血清样品。使用测量波长405nm和参考波长490nm(VersaMax可调式微量板读数仪，Molecular Devices)测量吸光度。
细胞因子分析
通过Luminex测定法(Bio-Plex Pro小鼠细胞因子23路测定法)依照制造商的说明书测量细胞因子。
结果
与单独的CD40激动剂和PD-L1抑制剂(分别为成分A和B)双药相比，添加抗细胞因子作为第三成分导致可耐受性提高，表现为体重减轻更少。特别是，添加抗TNFα作为第三成分(成分C)导致可耐受性提高，如例如通过监测治疗期间的体重减轻而证明的(见图5)。同时，CD40/PD-L1组合的活性在与作为第三成分的抗细胞因子一起注射时得到保留(见图6)。
序列表
<110> 豪夫迈·罗氏有限公司（F. Hoffmann-La Roche AG）
<120> 活化人CD40的抗体和针对人PD-L1的抗体的组合疗法
<130> P32260-EP-1
<160> 23
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 277
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 1
Met Val Arg Leu Pro Leu Gln Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr
1 5 10 15
Ala Val His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu
20 25 30
Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val
35 40 45
Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu
50 55 60
Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His
65 70 75 80
Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr
85 90 95
Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr
100 105 110
Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly
115 120 125
Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu
130 135 140
Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys
145 150 155 160
Cys His Pro Trp Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu Val Val Gln Gln
165 170 175
Ala Gly Thr Asn Lys Thr Asp Val Val Cys Gly Pro Gln Asp Arg Leu
180 185 190
Arg Ala Leu Val Val Ile Pro Ile Ile Phe Gly Ile Leu Phe Ala Ile
195 200 205
Leu Leu Val Leu Val Phe Ile Lys Lys Val Ala Lys Lys Pro Thr Asn
210 215 220
Lys Ala Pro His Pro Lys Gln Glu Pro Gln Glu Ile Asn Phe Pro Asp
225 230 235 240
Asp Leu Pro Gly Ser Asn Thr Ala Ala Pro Val Gln Glu Thr Leu His
245 250 255
Gly Cys Gln Pro Val Thr Gln Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg Ile Ser
260 265 270
Val Gln Glu Arg Gln
275
<210> 2
<211> 290
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 2
Met Arg Ile Phe Ala Val Phe Ile Phe Met Thr Tyr Trp His Leu Leu
1 5 10 15
Asn Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr
20 25 30
Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu
35 40 45
Asp Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile
50 55 60
Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser
65 70 75 80
Tyr Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn
85 90 95
Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr
100 105 110
Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val
115 120 125
Lys Val Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val
130 135 140
Asp Pro Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr
145 150 155 160
Pro Lys Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser
165 170 175
Gly Lys Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn
180 185 190
Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr
195 200 205
Cys Thr Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu
210 215 220
Val Ile Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr His
225 230 235 240
Leu Val Ile Leu Gly Ala Ile Leu Leu Cys Leu Gly Val Ala Leu Thr
245 250 255
Phe Ile Phe Arg Leu Arg Lys Gly Arg Met Met Asp Val Lys Lys Cys
260 265 270
Gly Ile Gln Asp Thr Asn Ser Lys Lys Gln Ser Asp Thr His Leu Glu
275 280 285
Glu Thr
290
<210> 3
<211> 107
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 3
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Tyr Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Thr Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ile Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 4
<211> 126
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 4
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asp Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Asn Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gln Pro Leu Gly Tyr Cys Thr Asn Gly Val Cys Ser Tyr
100 105 110
Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 5
<211> 118
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 5
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 6
<211> 118
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 6
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 7
<211> 118
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 7
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Leu Pro Tyr Gly Gly Ser Ser Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 8
<211> 108
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 8
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1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
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<211> 108
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 9
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1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Asn Val Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
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Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ala Pro Pro Trp
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
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<213> 人（Homo sapiens）
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<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 15
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<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 16
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
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<211> 108
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 17
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<212> PRT
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<400> 18
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<211> 108
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 19
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<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 20
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1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
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<210> 21
<211> 108
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 21
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
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<212> PRT
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<400> 22
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<211> 107
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<213> 人（Homo sapiens）
<400> 23
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
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20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ser
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Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Phe Ile Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
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