本发明涉及热稳定冻干轮状病毒疫苗制剂(thermostablefreezedriedrotavirusvaccineformulation)及其制备方法。更具体地，本发明公开了干饼(driedcake)或干粉形式的改进热稳定轮状病毒疫苗制剂。本发明还涉及具有改进热稳定性且易于使用和运输的轮状病毒疫苗。所述疫苗满足发展中和低收入国家的疫苗接种计划的要求。
背景技术：
：：公知的是轮状病毒是婴儿和幼儿严重腹泻的首要原因。据估计，全球每年有50至60万5岁以下儿童因轮状病毒腹泻而死亡，另有200万儿童住院。这些死亡中约90％至95％主要发生在发展中国家。轮状病毒具有高度传染性和抗性，无论水质和可用卫生条件如何，世界上几乎每个儿童都有感染的风险。疫苗接种已被证明是预防轮状病毒感染的最有效方式。国际研究数据表明，目前轮状病毒疫苗对严重轮状病毒胃肠炎(rotavirusgastroenteritis，RVGE)具有85％至95％的效力。有鉴于此，世界卫生组织(WorldHealthOrganization，WHO)于2009年6月5日推荐轮状病毒疫苗必须包括在所有国家的免疫接种计划中。然而，在发展中国家中，由轮状病毒感染导致90％至95％的死亡发生，而且所获得的治疗也有限，使用轮状病毒疫苗存在一些问题。发展中国家面临的两个主要问题是：1)发展中和低资源国家轮状病毒疫苗的较低的效力，2)计划适宜性(programmaticsuitability)以及目前可用疫苗的成本。据报道，到2030年，通过加速获得轮状病毒疫苗可以防止超过240万儿童死亡。如果这些疫苗在“疫苗和免疫接种全球联盟”(GlobalAllianceforVaccineandImmunization，GAVI)国家中使用，其可防止每年大约180,000例死亡并避免600万诊所或医院就诊，从而每年节省6800万美元的治疗费用。然而，为了提高这些区域中轮状病毒疫苗的到达，必须开发新的计划适宜性的疫苗并合格地用于全球。程序化适宜性是WHO为疫苗进行资格预审(prequalification)所开发的新流程，目的是解决发展中国家的需要，并促进全面免疫接种而不需要对冷链能力、人力资源、废物处理设施等进行额外投资。该流程概括了疫苗必须拥有的WHO资格预审要求的强制性、关键独特性、创新性和优选程序化适宜性特征。本领域中公知的是，疫苗必须在保持在2℃至8℃的冷藏温度下储存和运输。此外，还公知的是，疫苗必须在从冷藏中取出后立即施用。通常来说，WHO资格预审疫苗在2℃至8℃下稳定长达24至36个月。目前WHO资格预审的轮状病毒疫苗在如上所述的特定温度下仅在有限的持续时间内是稳定的。研究表明，如果当前可用的疫苗(例如，疫苗)无意中暴露或储存在高于8℃的温度下，其效力将在最大暴露的9℃至25℃下维持48小时(h)或在26℃至30℃下维持仅12小时。然而，如果疫苗暴露于高于30℃的温度，或者如果上述时间已经过去，则疫苗必须被丢弃，因为其失去其效力。有限的数据表明，如果疫苗无意中暴露于低于0℃的温度，则疫苗保持效力。另一种目前可获得的冻千疫苗(即Rotarix疫苗)在2℃至8℃下表现出稳定性，保质期(shelflife)为36个月。然而，无论稳定性特征如何，这两种疫苗在运输期间均需要保持冷链。特别是在发展中和低收入国家中，保持疫苗效力所需的冷链是非常困难的，这导致大量疫苗被浪费，并且在最坏的情况下危及潜在接受者的生命。WHO估计，每年近一半的冻干疫苗和四分之一的液体疫苗被浪费。这种浪费的最大因素之一是冷链的破坏。支持发展中国家的疫苗接种工作的GAVI联盟估计这些国家的一半医疗保健设施根本没有电力供应，只有10％有可靠的电力供应；而这是冷链操作的强制性要求。例如，在印度(具有最大轮状病毒疾病负担的国家)，UNICEF与印度政府、邦政府和WHO合作的2008年国家冷链评估报告得出结论：整个冷链基础设施和物流的管理遭受设备、基础设施和经训练人力的严重短缺。因此，热稳定疫苗存在很大的需求。许多现有的疫苗确实表现出一定程度的热稳定性。然而，现有疫苗具有较短的热稳定性期(例如VVM7或VVM14)，其未能解决该问题，因此难以到达发展中国家(developingworld)。例如，在印度，像大多数发展中国家一样，使用多层疫苗储存网络，所述网络接收、储存和供应大量疫苗，而其中所有疫苗需要在+2℃至+8℃的温度范围内储存。在这个旅途中，疫苗至少要花费一年的时间从制造商到收货人，给不充足的冷链带来巨大的负担。由于冷链是确保疫苗质量的最重要的组成部分，开发可长时间运输和储存在冷链外的热稳定疫苗是医疗行业的高度优先事项。这特别是对于冻干疫苗更加重要，因为它具有较高的浪费负担。热稳定性特征也有利于在世界上环境极端温度超过40℃以及附近没有可用冷链的地区的疫苗物流。目前可获得的冻干疫苗不具有足够的热稳定性特性以适于在冷链外储存任何有意义的时间量，并且这些疫苗必须在冷藏下储存和运输。因此，目前缺乏这样的疫苗，因此缺乏赋予疫苗足够的热稳定性的制剂方法是全球疫苗接种工作的重要障碍，特别是对于活减毒疫苗而言。了解目的疫苗的不稳定的可能机制和调整疫苗制剂以及调节工艺参数对于终止这些机制是至关重要的，对于设计成功的冻干方法也是必不可少的。尽管冻干赋予疫苗制剂以延长的稳定性，但是其导致更高的制造成本。冻干的成本与规模直接相关，规模继而由搁板(shelf)的表面积限定。这可能使得热稳定冻干疫苗在成本上相比于其热不稳定液体疫苗制剂并没有吸引力。因此，也需要设计成本有效的热稳定化方法。此外，大多数现有固体形式的疫苗包装在独立的容器/组件中，并且需要注射器和小瓶(vial)以及用于重构和施用的其他复杂且昂贵的机构。这导致疫苗施用的困难，并且通过使冷链负担过重而大大提高了疫苗的空间占用(footprint)。这也进而提高运输和分配的挑战、储存的物流，并且易于发生潜在致命的重构错误，例如缓冲液/疫苗错配、污染、错误体积的施用等。因此，需要这样的创新形式的疫苗，其在装入改进的容器/封闭件过程中提供灵活性，这改善了疫苗的物流和施用。美国专利No.6616931(WO2002/011540)描述了在缓冲液、二价金属离子、糖和聚阴离子、表面活性剂、液体和冻干形式氨基酸的方面不同的制剂中轮状病毒疫苗的稳定性。然而，这些制剂在高于22℃至30℃下没有产生任何显著时间量的热稳定性。还据引用，轮状病毒疫苗的冻干可导致病毒滴度的丧失，这又导致低产率，并且效力低于所需水平，从而导致通过冻干的疫苗制剂的无效免疫接种。还报道了用于冻干制剂的重构缓冲液，其提供缓冲胃酸所需的额外的酸中和能力。该专利还公开了在37℃下孵育30分钟或在30℃下孵育2小时的重构的冻干制剂在室温下失去效力。GlaxoSmithkline的US7285280公开了活减毒轮状病毒疫苗制剂。疫苗制剂以作为抗酸剂存在的碳酸钙冻干，在施用前用水溶液重构。或者，该专利还要求保护疫苗制剂作为冻干形式的速溶片剂，以直接置于婴儿/儿童的舌上，其中存在轮状病毒抗原。另一个GSK的美国专利8192747要求保护包含活减毒轮状病毒抗原、糖羧酸盐/酯和羧酸、己二酸以及钙离子的液体经口轮状病毒制剂，其中所述组合物具有至少12分钟的抗酸能力。美国专利申请US2012/0107356描述了在没有的稳定剂的情况下制备的疫苗制剂，其具有增强的病毒滴度、保质期和热稳定性。通过添加稳定剂可进一步延长保质期。尽管具有这种显著的热稳定性，但目前已许可的疫苗为需要在-20℃储存的液体形式。此外，该成分包括即使使用支持高产量的方法生产也会对制剂具有成本影响的蛋白质。对于要在低收入地区广泛采用的疫苗，至关重要的是保持疫苗及其组分如稳定剂的低成本。从管理和安全的角度来看，使用的赋形剂和稳定剂应该既不合动物来源的物质也不合有某动物成分，这也是至关重要的。事实上，在一些国家，出于文化和宗教原因也是不期望的。国际专利申请no.PCT/US2008/011169公开了通过在液体轮状病毒制剂中使用二价阳离子(如Zn2+和Ca2+)作为稳定剂来冻干轮状病毒制剂以保存轮状病毒。这些强化的制剂表现出优异的稳定性，如通过冻干不会引起疫苗的不稳定性的事实所证明的。使用活的G1轮状病毒株作为代表性血清型，用不同的制剂组成进行冻干。冻干的加工损失可忽略至小于0.2logffu/mL，并且在37℃下储存2个月后，初始滴度的降低分别为可忽略至0.7logffu/mL。在4℃和25℃储存3个月后，滴度降低可忽略(＜0.1logffu/mL)。在国际专利申请no.PCT/US2008/011169中的一个显著的观察结果是，Zn2+在液体轮状病毒疫苗中的存在增强了病毒生存力的稳定性，但在美国专利6,616中，Zn2+的存在加速了构成RotaTeq的轮状病毒血清型的灭活。然而，该观察结果不是仅归因于二价阳离子的存在，而是归因于蔗糖的相伴存在和pH。对于冻干，这里仅得出结论，Zn2+的存在不在冻干过程期间或在其升高的温度下储存期间使轮状病毒不稳定。因此，二价阳离子用于稳定轮状病毒疫苗的作用不清楚。也不清楚基于单一轮状病毒血清型的实验的结论和权利要求是否将适用于所有轮状病毒血清型，尤其是那些构成多价轮状病毒疫苗的轮状病毒血清型。因此，需要合理设计制剂以达到最佳且有效的制剂。因此，为了解决上述问题，需要单剂量、热稳定、成本有效的疫苗，这将对发展中和低收入国家的疫苗接种计划具有极大的优势。因此，本发明描述了具有更高滴度值并且可以在非冷藏供应链中运输的热稳定疫苗，显著降低与将疫苗运输到世界偏远角落相关的成本和复杂性。发明目的本发明的主要目的是提供改进的热稳定冻干轮状病毒疫苗制剂。本发明的另一个目的是提供改进的冻干方法以获得改进的热稳定冻干轮状病毒疫苗制剂。本发明的另一个目的是提供改进的热稳定冻干轮状病毒疫苗制剂，其消除或显著最小化在高温下较长时间的效力损失，从而降低对冷藏和冷链维持的依赖。本发明的另一个目的是提供具有更高滴度值的有效且经济上可行的热稳定冻干轮状病毒疫苗制剂。本发明的另一个目的是提供制备热稳定冻干轮状病毒疫苗的方法，所述疫苗包含选自牛、恒河猴、人、绵羊、恒河猴/人重配株(reassortant)或牛/人重配株的活轮状病毒毒株。本发明的另一个目的是提供制备包含单价和/或多价轮状病毒毒株的热稳定冻干轮状病毒疫苗的方法。本发明的另一个目的是提供单独或组合的轮状病毒疫苗制剂以及重构缓冲液，其提供足以保护活病毒免受胃酸的酸中和能力。本发明的另一个目的是制备改进的热稳定冻干轮状病毒疫苗制剂，其具有理想地用于填充和通过药物递送装置(优选经口递送装置)施用的性质。本发明的另一个目的是提供占用空间减小的成本有效的轮状病毒疫苗，其在较高温度下稳定、易于使用、易于运输并满足低收入和发展中国家的需要。发明概述因此，本发明涉及热稳定冻干轮状病毒疫苗制剂及其制备方法。所述方法涉及通过使用冻干方法产生脱水形式的疫苗来稳定轮状病毒疫苗。脱水通过在包含多种稳定剂的赋形剂的存在下使用冻干方法完成。所述稳定剂将不稳定的水相互作用转化为制剂成分的稳定相互作用，从而在低温、在室温和在较高温度下为疫苗组分提供热稳定性。本发明的热稳定冻干轮状病毒疫苗包含选自单价或多价轮状病毒或其组合的毒株，并且所述活减毒病毒选自牛、恒河猴、人、绵羊、恒河猴/人重配株或牛/人重配株。本发明的热稳定轮状病毒疫苗具有在大多数轮状病毒负担存在的区域中经常遇到的高温下保持效力的潜力，并且具有部分或完全消除疫苗冷链依赖性的潜力。本发明提供了经济的冻干方法，其中冻干在多种病毒浓度下大块完成，从而降低生产成本。本发明提供了热稳定的冻干轮状病毒疫苗，其提供了在多种容器/封闭件中包装的灵活性，例如带有重构缓冲液的提供了预填充注射器的小瓶或分别具有疫苗和缓冲液的两个小瓶以及适配器和注射器，或单个容器封闭件，其包含具有易碎密封件的双室袋(dualchamberpouch)，所述易碎密封件可在重构缓冲液室上经手指之间挤压时破裂，从而允许固体疫苗和重构缓冲液混合。因此，本发明公开了热稳定冻干轮状病毒疫苗制剂和制备所述疫苗的方法。所述疫苗具有改善的热稳定性、减小的占用空间、生产和运输的低成本以及易于使用和运输。附图简述图1：对于N＝1(o)、N＝2(Δ)和N＝3(□)，在2℃至8℃储存条件下，含有五种人牛血清型(G1、G2、G3、G4和P1)的小瓶中冻干制剂1004c的稳定性数据。图2：对于N＝1(o)、N＝2(Δ)和N＝3(□)，在37℃储存条件下，含有五种人牛血清型(G1、G2、G3、G4和P1)的小瓶中冻干制剂1004c的稳定性数据。图3：对于N＝1(o)、N＝2(Δ)和N＝3(□)，在45℃储存条件下，含有五种人牛血清型(G1、G2、G3、G4和P1)的小瓶中冻干制剂1004c的稳定性数据。图4：对于N＝1(o)、N＝2(Δ)和N＝3(□)，在2℃至8℃储存条件下，包含五种人牛血清型(G1、G2、G3、G4和P1)的冻干、经研磨和共混制剂1004c的稳定性数据。图5：对于N＝1(o)、N＝2(Δ)和N＝3(□)，在37℃储存条件下，包含五种人牛血清型(G1、G2、G3、G4和P1)的冻干、经研磨和共混制剂1004c的稳定性数据。图6：对于N＝1(o)、N＝2(Δ)和N＝3(□)，在45℃储存条件下，包含五种人牛血清型(G1、G2、G3、G4和P1)的冻干、经研磨和共混制剂1004c的稳定性数据。发明详述为了消除目前现有技术中的上述缺点，本发明涉及热稳定冻干轮状病毒疫苗制剂及其制备方法。更具体地，本发明公开了通过使用改进的冻千方法制备的改进的热稳定干饼或干粉形式的轮状病毒疫苗制剂。本发明还涉及使用重构干饼或干粉形式的疫苗制剂制备的液体或固体轮状病毒疫苗制剂，使得所述疫苗制剂具有改善的热稳定性、易于运输和使用并且是可负担的。因此，所述疫苗满足发展中和低收入国家的疫苗接种计划的要求。本发明使用冻干的方法去除水部分(含水轮状病毒疫苗的不稳定性的主要来源之一)。从液体轮状病毒疫苗制剂中提取出水部分，以用于单独的病毒或血清型，或用于多种轮状病毒血清型的组合以形成脱水的热稳定疫苗制剂。这些冻干方法导致水分含量低于约3.0％，从而防止轮状病毒血清型中的与过量水的存在相关的降解途径。在公开本发明的优选实施方案之前，应当理解，本发明不限于所描述的具体材料，因为它们可以变化。还应当理解，本文中使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并且不旨在以任何方式限制本发明的范围。必须注意，若不是上下文中另有清楚指示，则本文中使用的没有数量词修饰的名词表示一个/种或更多个/种，除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。因此，在一个优选的实施方案中，在包括稳定剂的赋形剂存在下使用冻干方法完成脱水，用稳定成分的稳定相互作用代替不稳定的水相互作用。在一个实施方案中，使用实验设计(Design-of-Experiment，DoE)的方法来鉴定潜在赋形剂、其浓度及其组合，其可能在冻干过程和其他制造步骤以及随后用于确定稳定性损失的储存期间对疫苗制剂中病毒的效力损失具有显著影响。在一些情况下，为了将实验的数量最小化，也采用了连续分数因子DoE。通过多种生物物理方法，例如差热分析(DifferentialThermalAnalysis，DTA)、差示扫描量热法(DifferentialScanningCalorimetry，DSC)，冻干显微术(FreezeDryingMicroscopy，FDM)和阻抗测量来确定潜在赋形剂的适宜性、它们的浓度及其组合。此外，还通过使用多种方法来测量直接效力，例如，在其他四种重配株病毒存在下允许对每种单独重配株病毒的特异性定量的基于多价QPCR的效力测定(MultivalentQPCR-BasedPotencyAssay，M-QPA)。生物物理方法给出了方法适宜性的指示，例如所需的时间和能量输入，并且后一种效力测量方法给出了包括稳定剂的赋形剂对加工过程期间和随后在储存期间对效力影响的指示。在一些情况下，在DoE组合物的存在下重复冻融病毒，然后在高温(即在25℃)下长时间孵育至少24小时和最多长达一周后的效力变化也已被使用。包括多种稳定剂的赋形剂选自但不限于：(a)冻干保护剂如蔗糖、海藻糖、山梨糖醇和乳糖，(b)二价阳离子，更特别是二价离子结构稳定剂如Zn(II)和Ca(II)；(c)缓冲剂，例如HEPES、Tris、磷酸盐、柠檬酸盐或组氨酸；和(d)盐，例如氯化钠(NaCl)、氯化镁、氯化钾；(e)填充剂，例如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、葡聚糖、甘露糖醇；(f)活化剂，包括L-精氨酸和/或甘氨酸，以及(g)分散剂，例如吐温(Tween)(例如吐温20和吐温80)。在一个优选的实施方案中，热稳定的冻干疫苗制剂含有范围为1.2％w/v至6.0％w/v的冻干保护剂，范围为0mM至2mM的二价阳离子如Zn(II)和Ca(II)，范围为0mM至50mM的盐，范围为10mM至50mM的缓冲剂，范围为2％至6％w/v的填充剂，范围为10mM至100mM的活化剂，范围为0％w/v至0.02％w/v的分散剂。在另一个优选的实施方案中，如此选择包括稳定剂(特别是缓冲系统)的赋形剂，以允许对二价离子(例如Zn(II)和Ca(II))的最大溶解度，其主要是最大工艺稳定性所需的，并且还在轮状病毒在高温下长时间的储存稳定性中发挥作用。在另一个实施方案中，本发明中描述的轮状病毒疫苗制剂可包含人-牛重配株的活减毒轮状病毒，即G1、G2、G3、G4和P1，以及来自牛、恒河猴、人、牛、恒河猴/人重配株或牛/人重配株的其他活减毒轮状病毒。用于本发明的病毒的另一些实例还可包括但不限于其他活减毒病毒，包括麻疹、诺如病毒、脊髓灰质炎和其他单价或多价轮状病毒。在另一个实施方案中，特别优选的冻干疫苗分别在小瓶和托盘中使用54小时冻干循环或70小时冻干循环制备。在一些情况下，可以使用来自上述多种生物物理方法的输入(玻璃化转变温度Tg’和共晶熔融温度Teu)和来自M-QPA的效力损失适当地修改冻干循环。在本发明的所有方面，使用上述优化参数和所述组合物的冻干产生具有小于3.0％的残余水分含量的干饼或干燥固体粉末。所述残余水分降低至低于3％的含量导致防止了与水的存在相关的热降解途径。所述轮状病毒疫苗制剂可使用任何适当的冻干方法获得。在一个优选的实施方案中，基于效力和生物物理学测量来选择组合物中的冻干制剂成分和浓度，以达到提供最佳冻干参数和时间的制剂，对于所述病毒血清型，其加工损失不超过Log10＝[0.2]。在另一个实施方案中，所述轮状病毒疫苗制剂可在单剂量和/或多剂量制剂中在小瓶中冻干，并且在施用前将所述疫苗用所提供的重构缓冲液重构。在另一个实施方案中，使用市售冻干托盘如冻干托盘或不锈钢托盘，将所述轮状病毒疫苗制剂以大块冻干。在另一个优选的实施方案中，将所述轮状病毒疫苗制剂以大块冻干，例如将滴度比临床相关规格高5至10倍的轮状病毒疫苗冻干，从而减小批次的大小和数量，并因此降低总体生产成本。为了获得适于填充在特别是用于单剂量容器的容器封闭件中的粉末，将大块冻干材料研磨，得到粒度D90值不小于250μm的经研磨冻干粉末。研磨单位加工可使用合适的研磨方法来完成，包括但不限于筛磨(sievemilling)、锤磨(hammermilling)、锥形筛磨(conicalsievemilling)、球磨(ballmilling)和辊磨(rollermilling)，温度范围为0℃至25℃。在另一个实施方案中，经研磨冻干粉末可与合适的掺和剂(blendingagent)共混，所述掺和剂选自但不限于：PVPK25、PVPK40、蔗糖、甘露糖醇、DE范围通常为4至20的麦芽糖糊精、果糖、葡萄糖、乳糖或相同组成的安慰剂制剂或其组合。所述组合如此制备以获得具有等于临床相关的最小浓度的轮状病毒滴度或任何期望的释放规格的粉末剂型，以及改造粉末性质，使其可接受在预定包装容器中准确和精确地进行粉末填充。在另一个实施方案中，冻干为在临床相关规格或在更高滴度的轮状病毒规模(5×于玻璃小瓶中)或使用不锈钢托盘以大块进行，其具有不超过Log10＝[0.2]的加工损失，在不考虑例如起始填充、血清型、加工规模及其组合的因素的情况下，在任何组合中的冻干轮状病毒疫苗血清型的累积效力(加工和稳定性)损失在37℃±2℃(RH75％±5.0％)经至少30、90或180天后不超过Log10＝0.5，并且在不考虑例如起始填充、血清型、加工规模及其组合的因素的情况下，在任何组合中的冻干轮状病毒疫苗血清型的累积效力(加工和稳定性)损失在45℃±2℃(RH75％±5.0％)经至少30、90或120天后不超过Log10＝0.5。轮状病毒是酸不稳定的，并且在pH2.0下以小于12分钟的半衰期迅速灭活。轮状病毒疫苗旨在经口施用，保护可被胃中存在的胃酸灭活的轮状病毒是至关重要的。施用此类疫苗的有效方式是在经口疫苗之前或与经口疫苗组合使用抗酸剂或中和缓冲剂。在本发明的另一个实施方案中，采用特殊供应品以在经口施用后保护疫苗免受胃酸，通过施用具有更好酸中和能力(AcidNeutralizationCapacity，ANC)之缓冲剂的疫苗来实现胃酸中和。缓冲/抗酸组分选自但不限于：HEPES、柠檬酸三钠二水合物、组氨酸、碳酸钙、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钙、碳酸氢钾、氢氧化铝、磷酸二氢钠一水合物或氢氧化镁或其组合。在本发明的另一个实施方案中，将所述疫苗制剂研磨并与赋予期望ANC的掺和剂和/或缓冲剂共混，所述ANC的范围为0.3mEq/剂至1.0mEq/剂疫苗粉末，并且水分含量低于3％。在本发明的另一个实施方案中，所述疫苗制剂在即将经口施用之前用重构缓冲液重构，其赋予在范围为0.3mEq/剂至1.0mEq/剂疫苗期望的ANC。在另一个实施方案中，为了向制剂提供适口性，将糖以0％w/v至60％w/v的浓度添加至重构缓冲液。糖选自但不限于乳糖、葡萄糖、蔗糖、果糖或其组合。在本发明的所有方面，疫苗制剂是干燥形式，即冻干的饼/粉末、经研磨的干燥粉末或经研磨和混合的冻干粉末。如此获得的所述以上制剂在5℃±3℃下经至少9个月(可以统计学地推测为2年)以及在37℃或45℃下经至少18周的效力损失不超过Log10＝[0.5]。在本发明的所有方面，所述粉末疫苗制剂通过当与掺和剂单独共混时以所述重构缓冲液重构，或者当与掺和剂和与具有期望ANC的缓冲剂共混时以注射用水重构来经口施用。本发明的另一方面提供了这样的无菌重构的疫苗制剂，当其在合适的含水重构缓冲液中重构并在2℃至8℃储存48小时，其不导致超过Log10＝[0.5]的整体(加工+稳定性)病毒效力损失。在本发明的另一个实施方案中，经研磨的疫苗的玻璃化转变温度(Tg)大于47℃，以提供在较高温度储存条件下的热稳定性。在另一个实施方案中，将粉末疫苗制剂分配在最终包装容器/封闭件中，所述最终包装容器/封闭件包括供应有用于重构的独立的重构缓冲液的小药囊(sachet)或小瓶。因此，所述疫苗制剂具有改善的热稳定性、易于运输和使用并且是可负担的，因此所述疫苗满足发展中和低收入国家的疫苗接种计划的要求。实施例以下实施例举例说明但不限制本发明的范围。实施例1：使用冻千方法的轮状病毒血清型的热稳定化研究1：包括稳定剂的赋形剂的选择：为了确定在冻干过程(还包括加工步骤(加工损失)和储存(稳定性损失))期间可能对轮状病毒的稳定性具有显著影响的潜在成分、其浓度及其组合，以及为了支持最佳和经济的冻干方法，应用了实验设计(DoE)的方法。使用轮状病毒的G1株作为代表株来报告病毒效力变化。为了使实验的数量最小化，使用了连续分数因子设计。分数因子设计限于表1和表2中所示的8个因素。表1：用于设计DoE制剂的多种稳定剂及其浓度表2：用于设计DoE制剂的缓冲剂和填充剂的组合组合123456789缓冲液磷酸盐磷酸盐磷酸盐HEPESHEPESHEPESTrisTrisTris填充剂葡聚糖PVP甘露糖醇葡聚糖PVP甘露糖醇葡聚糖PVP甘露糖醇为了进一步简化筛选设计，逐步地一次选择一种缓冲液和糖与填充剂的一种组合。这种分数因子设计每组合产生总共19个实验，其中缓冲剂、盐、糖：填充剂比例、氨基酸、活化剂和分散剂的浓度是变化的。为了测试稳定剂组合用于最佳冻干方法设计和用于在冻干期间支持病毒稳定性的能力，进行以下筛选实验：(a)在安慰剂组合物上进行差热分析、冻干显微术和阻抗测量，以确定影响冻干过程的临界温度。在初始筛选中省略了含有甘露糖醇的DoE组，因为这些制剂需要更长的冻干循环。(b)进行冻融(freeze-thaw，FT)研究，其中将浓度为2.0E+07IU/ml的G1血清型进行5个冷冻和解冻循环，随后在25℃下孵育1周。从这些实验中，观察到含有蔗糖：PVP的组合与G1毒株的含有蔗糖：葡聚糖的组合相比保持了好得多的效力。(c)如表3中所示，在以7.3log/mL浓度的含水进料(aqueousfeed)进行的G1的实际冻干实验中，进一步评价所选择的表现最佳的制剂的效力。将来自这些所选择的制剂的1ml液体进料分配到5ml容量的玻璃小瓶中，并使用82小时至110小时的循环冻干，其特征在于：i.将预先冻干的液体预冷至10℃至12℃，并装入冻干机。ii.将预先冻干的液体在-40℃冷冻3小时至4小时(在0.5至2.0小时内，从4℃梯度下降至-40℃)，接着在-20℃下再退火2小时(范围为0.5小时至1.5小时，从-40℃梯度上升至-20℃)。最后在-50℃下冷冻3小时至4小时。iii.在50mTorr的真空条件下，在-42℃下将冰升华最多15小时，随后在-40℃下进一步升华另外15小时至90小时或在-38℃至-35℃的温度范围进一步升华最多55小时。iv.在50mTorr真空下在20℃至25℃范围内二次干燥10小时至15小时。与未冻干的含水液体“进料”样品相比，评价所得冻干样品的初始效力(t＝0)。将一些冻干的样品在37℃±2℃下在相对湿度(RH)为75％±5％的储存条件下孵育不同时间点，并与在2℃至8℃储存条件下储存的样品进行比较，如表4中所示。在所有被评价的制剂中，当储存在37℃±2℃(RH75％±5％)长达4周时，测量1000、1004、1005、1011和1013保留的G1效力。在以葡聚糖作为填充剂的制剂中，1030在37℃±2℃(RH75％±5％)下保留长达4周的G1效力。然而，观察到该制剂不适于基于DTA和阻抗分析数据的最佳冻干。(d)还使用卡尔费休法(KarlFischermethod)评价所有制剂的水分含量。如表5中所示，制剂1005、1011和1013在重复试验中显示非常高的水分含量。与其他三种制剂相比，制剂1000和1004显示出精致的饼外观以及低水分含量。还观察到这些制剂在37℃±2℃(RH75％±5％)下在保持轮状病毒效力方面更好。制剂1002虽然显示较低的水分含量，但在37℃±2℃(RH75％±5％)下在储存第2周期间便丧失效力。冻干的制剂1000和1004产生具有低水分含量的精致饼。观察到在37℃±2℃(RH75％±5％)下储存期间，G1血清型的加工和稳定性损失不超过log10＝[0.5]，其在随后的研究中用作示例性制剂。另外，根据DoE制剂的效力和DTA数据的统计学处理，出现了稳定剂的最优组合，其包含25mMHEPES，蔗糖∶PVP比例为1.6∶6.4(g％∶g％)，25mMNaCl，50mML-精氨酸，100mM甘氨酸和2mMCaCl2.2H2O。表3：关于在冷冻-解冻-稳定性实验中鉴定的效力的最佳性能制剂的组成表4：当在37℃(RH75％±5％)下暴露4周时，含有G1血清型的冻干单价制剂的稳定性对数损失(logloss)储存条件1000100110021004100510111013103037℃00.120.700.1900002-8℃00.210.300000.260表5：使用卡尔费休法评估的所选冻干制剂的水分含量百分比制剂10001001100210041005101110131030水分含量0.751.370.820.844.984.844.031.19研究2：最佳缓冲液和填充剂组合的选择。通过统计处理实施例1，研究1中的DoE制剂的效力和DTA数据所获得的稳定剂的优化组合(如表6中所示的1057)，通过评价效力变化进一步测试优化缓冲液和填充剂。使用三种填充剂和缓冲剂组合来鉴定最佳性能组合，得到如表6中所示的多种制剂。组合物用G1和G3毒株配制。目标浓度是每个毒株为7.0log/mL。制剂1065H与1065相同，在冻干循环中添加退火步骤。冻干循环为50小时时长，其特征在于：i.在小瓶装载前将冻干器架预冷至-45℃。ii.冷冻步骤1.5小时，随后在相同温度下保持30分钟。iii.通过将温度升高至-2.0℃，然后在2小时内降至-30℃来进行初级干燥。进一步在3小时内将温度降低至-36℃，最后在5小时内降至-38℃，并将产物在该温度下保持23小时，然后在4小时内进一步升至-10℃。在所有初级干燥步骤期间保持的真空为0.080mBar。iv.通过在30分钟内升高温度至25℃并在相同温度下在零真空下将产物保持8小时来进行二级干燥。表6：用于确定缓冲剂和填充剂组合对代表性轮状病毒血清型的加工和纵向稳定性的影响的优化制剂的组成在一些组合物(1065H)中，添加了额外的退火步骤，导致58小时循环，其特征在于：i.在小瓶装载前将冻干器架预冷至-45℃。ii.冷冻步骤1.5小时，随后在相同温度下保持30分钟。iii.通过在5分钟内将温度从-45℃升至-15℃，然后在相同温度下保持2小时，随后将产物再冷冻至-45℃保持1小时来进行退火步骤。iv.通过在15分钟内将温度升高至-7.0℃，然后在2小时内进一步降温至-27℃来进行初级干燥。将温度在3小时内进一步降低至-33℃，最后在5小时内降至-35℃。将产物在该温度下保持30小时。在所有初级干燥步骤期间真空保持为0.080mBar。该步骤之后在零真空下在4小时内进一步升温至-10℃。v.通过在30分钟内升高温度至25℃并在相同温度下在零真空下将产物保持8小时来进行二级干燥。将冻干的制剂在37℃±2℃(RH75％±5％)和2℃至8℃下储存四周。通过如表7中所示的M-QPA分析对数损失值。以PVP作为填充剂与HEPES作为缓冲剂相组合的组合物得到对于代表性轮状病毒血清型G1和G3的效力的最佳保留。就效力保留而言的表现最佳的制剂1057和1063进一步评价其在2℃至8℃和37℃±2℃(RH75％±5％)的储存条件下支持五种人牛轮状病毒血清型(G1，G2，G3，G4和P1)的效力的能力。如表8中所示，发现与含有磷酸盐的1063相比，含有HEPES的制剂1057在高温下最好地支持所有五种血清型的效力。涉及磷酸盐缓冲液的组合物也导致在制剂中的Ca+2离子沉淀，表明Ca+2在纵向稳定性中的重要作用。表7：不同缓冲液和填充剂组合对G1和G3毒株的稳定性损失的影响表8：具有不同缓冲成分的五价轮状病毒制剂1057和1063经4周的稳定性损失研究3：配制重构缓冲液以向疫苗提供酸中和能力(ANC)。来自上述研究的示例性先导制剂(leadformulation)本身不显示足够的ANC。因此，制备了重构缓冲液以提供足以保护活病毒免受胃酸的期望ANC。每2.0mL重构缓冲液以400mg蔗糖、29.8mg磷酸二氢钠一水合物和127mg柠檬酸三钠二水合物于水q.s.至2.0mL来配制。ANC值使用美国药典34NF29描述的方法确定。实验一式三份进行。结果以mEq/剂量表示。观察到当溶解在重构缓冲液中时，所有上述先导制剂产生0.8mEq/2.0mL剂量的ANC值。研究4：对于示例性先导制剂1000和1004在小瓶中的纵向研究和可重复性。在37℃和2℃至8℃储存条件下测试来自研究1的两种示例性制剂1000和1004的纵向稳定性，其并入所有五种人-牛轮状病毒毒株(G1、G2、G3、G4和P1)，如表9中所示。制剂的组成、储存条件和效力分析与研究1中所述的相似。每种血清型的初始效力为7.0log/mL。以99小时循环用于如下所述将这些制剂冻干：i.将预冻干液体预冷至10℃至12℃，并装载到冻干器中，随后进行冻干循环。ii.在60分钟内将温度从4℃降低至-40℃。冷冻步骤在-40℃进行3小时，然后在-20℃下退火另外2小时。在20分钟内达到退火温度。在60分钟内将温度进一步降低至-50℃，随后在相同温度下将小瓶保持4小时。iii.初级干燥在-42℃下进行10小时，随后在-40℃下进一步升华15小时，然后在-37℃的温度下在50mTorr的真空条件下进一步升华45小时。温度在15分钟内从-42℃缓慢梯度升高至-40℃并从-40℃升至-37℃。iv.二级干燥在20℃，50mTorr真空下进行15小时。含水液体进料的固体含量在10.00g/100mL至25.00g/100mL的范围内，以获得最佳干燥、产率和/或饼外观。加工损失计算为冻干前后获得的样品之间的效力差异。在37℃±2℃和％RH75％±5％下每30天的稳定性对数损失通过在37℃±2℃和％RH75％±5％下孵育至少30天并以7天为取样间隔的样品之效力数据的线性回归来计算。表9：在1000和1004制剂中五价组合物的加工损失、稳定性损失和累积损失的总结。n＝1、2和3是三个独立的制造批次。研究5：小瓶中制剂1004的纵向热稳定性和可重复性。在37℃±2℃(RH75％±5％)，45℃±2℃(RH75％±5％)和2℃至8℃的储存条件下测试示例性制剂1004的纵向稳定性和方法可重复性。将制剂与所有五种毒株以每剂/ml按照G1：6.81、G2：6.92、G3：6.91、G4：6.78和P1：6.83(1×浓度)的对数浓度并入。开发并优化了63小时冻干循环以用于制备该制剂，并且发现其支持冻干器中的全负荷的冻干(每批＞680个小瓶)。冻干循环的细节如下：a.将预冻干液体预冷却至10℃至12℃，并装载到冻干器中，随后进行冻干循环。b.温度在60分钟内从4℃降至-40℃，并且冷冻步骤在-40℃下进行2小时，随后在-20℃下再退火2小时。在60分钟内达到退火温度。在60分钟内进一步降温至-40℃。最终冷冻在-40℃下进行1.5小时。c.在4小时内将温度升高至-33℃，并且在-33℃下进行初级干燥33小时，接着在6小时内温度升至-10℃，然后分别在3小时内升至0℃和25℃。在初级干燥步骤期间保持50mTorr的真空。d.二级干燥在25℃下在0mTorr下进行5小时。所有三个独立制造批次的最终残余水分含量低于2.0％。制剂在37℃±2℃(RH75％±5％)，45℃±2℃(RH75％±5％)和2℃至8℃下保持其效力至少12周。加工损失计算为冻干前后样品之间效力的差异。稳定性损失(对数损失)通过在不同储存条件下孵育的样品的效力数据的线性回归来计算。在括号中提及的值表示在45℃±2℃(RH75％±5％)下经12周的效力对数损失值，如表10中所示。表10：在1004制剂(37℃/2至8℃/45℃)中五价组合物的对数加工损失、对数稳定性损失和对数累积损失的总结。N＝1、2和3是三个独立的制造批次实施例2：设计可扩展和可重复的用于轮状病毒疫苗热稳定化的冻干方法研究1：制剂的优化该制剂1004在具有较高滴度(＞2000剂量)的试验规模下表现出次优的饼性质，并且通过改变填充剂浓度和糖：填充剂比例进一步优化，以提高制剂的固体含量，产生表11中所示的1004的三种变体。这些改动的制剂支持持续时间54小时的冻干循环，其包括以下步骤：i.将预冻干液体预冷至10℃至12℃并加载到冻干器中ii.将预冻干液体在-35℃(温度梯度为4℃至-35℃：2小时)冷冻1小时，在-45℃冷冻1.5小时(温度梯度为-35℃至-45℃：0.5小时)，然后在-20℃下再退火2小时(温度梯度为-45℃至-20℃：1小时)。在-40℃最终冷冻1.5小时(温度梯度为-20℃至-40℃：0.5小时)。iii.初级干燥为在50mTorr真空下，在-32℃下进行1小时并在-28℃下进行24小时(温度梯度为从-40℃至-32℃和从-32℃至-28℃：每次1小时)。温度梯度从-28℃升至0℃：10小时，随后在0mTorr真空下在25℃下进行二级干燥5小时(温度梯度为0℃至25℃：2小时)。所有上述三种制剂的最终残余水分含量低于1.0％(＜1.0％)，并形成精致的饼，然而1004b和1004c在整个保质期内在饼外观方面更好。使用上述循环将每种制剂在所有五种人-牛轮状病毒血清型(G1、G2、G3、G4和P1)的小瓶中冻干，并且当储存在37℃±2℃(RH75％±5％)和2℃至8℃的情况下评价其效力变化。加工损失计算为冻干前后样品之间的效力差异。在2℃至8℃和37℃±2℃(RH75％±5％)下每30天的稳定性损失(对数损失)为通过在该储存条件下所孵育的样品的效力数据的线性回归计算。每ml液体进料的初始对数效力值为G1：6.81、G2：6.92、G3：6.91、G4：6.78和P1：6.83。所有改动的制剂显示出精致的饼并显示这样的效力，其表现为30天内不超过Log10＝0.5的加工、稳定性和累积加工损失，如表12中所示。表11：用于确定填充剂浓度和糖：填充剂比例之效果的优化制剂的组成表12：在1004a、1004b和1004c制剂中五价组合物的加工损失、稳定性损失和累积损失的总结。研究2：制剂1004c在小瓶中的纵向热稳定性和可重复性。在37℃±2℃(RH75％±5％)和2℃至8℃的持续8周的储存条件下测试示例性制剂1004c的临床相关浓度的轮状病毒的纵向稳定性和方法可重复性。该制剂与所有五种毒株以每ml每剂按照G1：6.81、G2：6.92、G3：6.91、G4：6.78和P1：6.83(1×浓度)的对数浓度并入。将研究1的实施例2中提及的54小时冻干循环用于制备该制剂，并且发现其支持冻干器中的全负荷的冻干(每批＞680个小瓶)。在含水液体进料中的总固体含量为13g/100ml。根据冻干前后样品之间的效力差异，计算三个独立制造批次(N＝1、2、3)的加工损失。在37℃±2℃和％RH75％±5％下的稳定性损失(对数损失)通过对在37℃±2℃和％RH75％±5％下孵育的样品的效力数据的线性回归计算，如表13中所示。所有三个制造批次的水分含量低于2.0％(＜2.0％)。表13：在三个独立制造批次中1004c制剂中五价组合物的加工损失、稳定性损失和累积损失的总结研究3：小瓶中的1004c制剂的滴度放大、纵向研究和可重复性。制剂的组成与实施例2的研究1中使用的组合物相同，除了初始人-牛轮状病毒血清型浓度提高5倍(5×)，在小瓶中每ml每5剂的对数值为G1：7.51、G2：7.62、G3：7.61、G4：7.47、P1：7.52。对于所有三个独立的制造批次N＝1、2和3，含水液体进料中的总固体含量为13g/100ml。将溶液pH调节至6.10±0.1。使用54小时冻干循环(类似于实施例2的研究1)在具有3mL容量的I型玻璃小瓶中制备这种制剂。当与预冻干液体对照相比时，观察到可忽略的加工损失。纵向研究在2℃至8℃、37℃±2℃(RH75％±5％)和45℃±2℃(RH75％±5％)的储存条件下进行。数据分别描绘在图1、图2和图3中。基于该数据的线性回归，观察到冻干轮状病毒制剂在所有这些储存条件下稳定近252天(09个月)。储存在2℃至8℃的样品的斜率值显示没有损失。数据的阿伦尼乌斯动力学模拟(Arrheniuskineticssimulations)表明，在37℃±2℃(RH75％±5％)下，稳定性的预期时间段(如在此制剂内的5种血清型中的任一种的Log10＝0.5效力丧失所示)可以是23个月。类似的数据处理显示，在45℃±2℃(RH75％±5％)储存条件下，在09个月内观察到Log10＝0.5的效力损失，并得到了实时确认。研究4：示例性制剂1004c在托盘中的大块冻干将制剂1004c在不锈钢(StainlessSteel，SS)托盘中以5×浓度的轮状病毒冻干。将380mL的预冻干液体添加到SS托盘中，从而得到与实施例2的研究2和3中的小瓶中获得的液体高度相同的液体。制备了三个独立的制造批次N＝1、2和3。然而，为了最佳的饼性质和水分含量，在托盘中的大块冻干需要70小时持续时间的冻干循环。该冻干循环包括以下步骤：i.将预冻干液体预冷至10℃至12℃并装载到冻干器中ii.在-35℃下冷冻预冻干液体1小时(温度梯度为4℃至-35℃：2小时)并在-45℃下经1.5小时(温度梯度为-35℃至-45℃：0.5小时)，随后在-20℃下再退火2小时(温度梯度为-45℃至20℃：1小时)。在-40℃最终冷冻1.5小时(温度梯度为-20℃至-40℃：0.5小时)iii.在50mTorr的真空下，在-32℃下进行初级干燥1小时，并在-28℃下进行34小时(温度梯度为-40℃至-32℃和-32℃至-28℃：各1小时)。iv.在0mTorr的真空条件下，将饼在25℃下二级干燥5小时。(温度梯度为-28℃至0℃：15.5小时和0℃至25℃：2小时)。所有上述三个独立制造批次的最终残余水分含量低于3％(＜3.0％)，从而防止轮状病毒血清型中与过量水的存在相关的降解途径。在托盘中观察到没有塌陷的精致饼，这在视觉上得到确认。研究5：加工块状冻干饼以获得自由流动的粉末。为了获得适于填充在最终包装容器/封闭件中的粉末，使用球磨在250mL或2.0L不锈钢气密容器中在涡轮混合器(WillyA.BachofenAG，Switzerland.T2F型，编号131266)中研磨大块冻干的五价轮状病毒疫苗饼。添加疫苗饼和钢球以获得1∶10的重量比。使涡轮混合器(turbulamixer)以72rpm的速度工作105秒。目视检查经研磨饼是否完成，并根据需要进行30秒的进一步研磨。在封装入容器之前的所有样品制备步骤均在氮气吹扫的手套箱中在低RH条件(＜5％)下进行。将微粉化的五价轮状病毒冻干疫苗与作为掺和剂的麦芽糖糊精DE6-8(Glucidex6D)使用250mL或2.0L不锈钢气密容器在涡轮混合器(WillyA.BachofenAG，Switzerland.T2F型，编号131266)中共混。共混在23rpm下进行15分钟，然后在32rpm下进一步进行2至3分钟。将经研磨和共混的制剂针对粒度分布、溶解时间、重构后的pH、残余水分含量和玻璃化转变温度(Tg)进行表征。在步进扫描DSC中获得Tg，其具有一系列微步骤，其中温度以特定的梯度速率升高，随后为等温期。对共混粉末进行如下观察：i.以经研磨粉末的D50和D90表征的粒度(以平均体积直径报道)分别观察为85和291μm，而掺和剂表现出的粒度分别为91和270μm。ii.当用显微镜观察时，经研磨的冻干粉末和掺和剂均显示为不规则形状的颗粒。iii.经研磨样品表现出范围为2.0％至2.5％的残余水分，而最终的共混粉末显示1.0％至1.5％的低水分含量。iv.预冻干液体的pH为6.10±0.1。经研磨和共混的冻干五价轮状病毒疫苗粉末用重构缓冲液重构，并且经重构的疫苗表现出0.80mEq/2ml剂量的酸中和能力(ANC)。观察到重构后疫苗的pH为6.10±0.1。v.调制差示扫描量热法(ModulatedDifferentialScanningCalorimetry，MDSC)显示，对于三个独立托盘干燥制造批次的经研磨干燥粉末，Tg表现为尖锐转变，并在48℃±1℃下发生反转事件。vi.观察到单剂量五价轮状病毒疫苗共混粉末(130mg)在维持在23.0℃±1.0℃的2.0mL重构缓冲液中以手动温和摇动小瓶的溶解时间为60±5.0秒。而在缓冲液温度保持在2℃至8℃下，花费几乎2分钟以通过温和的手动摇动完全溶解五价轮状病毒疫苗。研究6：经研磨和共混的冻干先导制剂的纵向稳定性研究和可重复性研究。将经研磨和共混的冻干示例性制剂1004c等分至I型玻璃小瓶中，并在37℃±2℃(RH75％±5％)和45℃±2℃(RH75％±5％)下储存。在取样时，将冻干的疫苗用重构缓冲液重构，随后进行效力分析。根据在三个独立制造批次中冻干前后样品之间的效力差异计算加工损失。通过对在该储存条件下孵育至少26周的样品的效力数据进行线性回归计算稳定性损失。i.示例性制剂1004c表现出这样的累积效力损失，即使在的2℃至8℃储存条件下经26周后，其在统计学上也可重复地等于0.0，如图4中所示。ii.示例性制剂1004c表现出这样的累积效力损失，即使在37℃±2℃(RH75％±5.0％)储存条件下经26周后，其累积效力损失显著且可重复地低于0.5log，如图5中所示。iii.在45℃±2℃(RH75％±5％)储存条件的情况下，对于18周内的三个独立的制造批次，效力值可重复地达到等于0.5对数损失，如图6中所示。研究7：先导制剂1004c的重构后稳定性研究冻干的五价轮状病毒疫苗用重构缓冲液重构。将200μL的等分试样各自分配到具有1.5mL容量的eppendorf管中，并在培养箱中在2℃至8℃、25℃、37℃和-70℃储存条件下孵育。在0小时、8小时、11小时、35小时和48小时时间间隔收集样品，并评价效力。通过将在上述条件下孵育的冻干疫苗的IU/剂与在-70℃下孵育的样品进行比较，确定在上述条件下保留的轮状病毒效力。从这些研究获得的数据显示，如表14中所示，对于所有5种毒株，在25℃下其效力保持8至11小时。在2℃至-8℃和-70℃储存条件下，效力的降低可忽略不计。表14：当用重构缓冲液重构并在不同温度下孵育时，5种轮状病毒血清型的Log10效力值当前第1页1 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