用于皮肤美白的化妆品组合物的制作方法

本发明涉及用于皮肤美白(皮肤增白，skin whitening)的化妆品组合物，所述化妆品组合物包含药草(中药材，medicinal herbs)的组合提取物(混合提取物，combined extract)。

背景技术：

在决定人皮肤颜色方面涉及多种因素；这之中，存在最重要的因素，例如，黑色素细胞制备黑色素的活性、血管分布、皮肤厚度以及内部和外部色素如类胡萝卜素和胆红素的存在与否。

黑色素色素的形成受遗传因素、激素分泌、与应激相关的生理因素以及环境因素如对UV辐射的暴露所影响。

皮肤的黑色素细胞中产生的黑色素是以深色色素和蛋白质的复合物的形式存在的多酚的聚合物。黑色素在保护皮肤中的蛋白质和基因中起有益作用，因为其不仅抑制自太阳发出的UV光从而保护真皮下的皮肤器官而且还清除皮肤组织中产生的自由基。

由内部或外部皮肤的应激样刺激产生的黑色素是一种稳定的物质，即使应激消失，该物质要直到通过皮肤角质排出到外部才消失。然而，黑色素的过量产生引起色素沉着过度(hyperpigmentation)，包括黄褐斑、雀斑和斑点，并且不利地影响皮肤美观。

在解决该问题的尝试中，已将抗坏血酸、曲酸(kojic acid)、熊果苷(arbutin)、氢醌、谷胱甘肽或其衍生物或抑制酪氨酸酶的物质与化妆品或医药产品组合使用。但是，这些物质存在问题，如不充分的皮肤美白效果，对皮肤的安全性问题，以及当与化妆品组合物组合时的制剂形式和稳定性问题，因此它们的使用是受限的。因此，迫切地需要与常规用于皮肤美白的组合物相比对身体更安全并且更加高度有效的新型用于皮肤美白的化妆品组合物。

技术实现要素：

技术问题

因此本发明的一个目的是提供具有美白效果的化妆品组合物。

本发明的另一个目的是提供用于皮肤美白的方法，所述方法包括施用有效量的生地黄(鲜地黄，Rehmanniae Radix Recens)、枸杞子(Lycium fruit)、黄苓(Scutellaria root)和白芷(Angelica Dahurica root)的组合提取物。

本发明进一步的另一个目的是提供生地黄、枸杞子、黄苓和白芷的组合提取物在制备用于皮肤美白的化妆品组合物中的用途。

技术方案

在开发具有皮肤美白效果的化妆品组合物的尝试中，本发明的发明人发现以下事实，即生地黄(Rehmanniae Radix Recens)、枸杞子(Lycium fruit)、黄苓(Scutellaria root)和白芷(Angelica Dahurica root)的组合提取物在改善皮肤美白效果方面是高度有效的，从而完成了本发明。

本发明提供生地黄、枸杞子、黄苓和白芷的组合提取物。

利用通过混合四种药草的协同作用，根据本发明的生地黄、枸杞子、黄苓和白芷的组合提取物与个体药草相比细胞毒性更低并且在皮肤美白方面更有效。

在本发明中，生地黄(Rehmanniae Radix Recens)是指天然生长于韩国、中国和日本的作为玄参科(Scrophulariacea)的多年生草本植物的Rehmanniaglutinosa(Gaertner)Liboschitz ex Steudel的新鲜根。

在本发明中，枸杞子(Lyclum fruit)是从天然生长于韩国、中国和日本的作为茄科(Solanaceae)中的攀缘茎植物类的Lycium chinense Miller或Lycium barbarum Linne获得的浆果。收获成熟的浆果并阴干直至外皮软化并干燥。

在本发明中，黄苓(Scutellaria root)是从分布于韩国、中国、蒙古和东西伯利亚的作为唇形科(Lamiaceae)中的多年生草本植物的Scutellaria baicalensis Georgi获得的根。

在本发明中，白芷(Angelica Dahurica root)是从分布于韩国、中国和日本的作为伞形科(Apiaceae)中的一年生或两年生草本植物的Angelica dahurica Bentham et Hooker f.或Angelica dahurica Bentham et Hooker f.var.formosana Shan et Yuan获得的根。

这些可以容易地以低成本从国内或国外获得的药草可以简单地购买或手工收割。

在本发明中，生地黄、枸杞子、黄苓和白芷的组合提取物可以是单一药草的混合物的提取物或单一药草提取物的混合物。优选地，本发明的组合提取物作为从生地黄、枸杞子、黄苓和白芷的药草混合物获得的提取物使用。在本发明中，组合提取物可以以浓缩液或冻干粉的形式获得。

基于生地黄、枸杞子、黄苓和白芷的组合提取物的总重量，本发明的组合提取物可以包含40至50重量％的生地黄、15至25重量％的枸杞子、15至25重量％的黄苓和10至20重量％的白芷，优选地40至50重量％的生地黄、17至25重量％的枸杞子、17至25重量％的黄苓和15至20重量％的白芷。

与单一药草提取物或者两种或更多种药草的组合提取物的每一个相比，以上面限定的重量百分比含有全部四种药草的本发明的组合提取物在皮肤美白，特别是抑制酪氨酸酶激活和抑制黑色素生物合成方面显示显著优异效果，因此导致在皮肤美白方面更高的活性。

在本发明中，生地黄、枸杞子、黄苓和白芷的组合提取物可以通过热水提取、浸泡提取、回流冷却提取、超声提取等制备。提取的次数优选为1至5次。提取溶剂的实例包括，但不限于，水和C₁-C₄醇或其混合物，优选水或乙醇水溶液。提取过程中使用的提取溶剂的量为生地黄、枸杞子、黄苓和白芷的总重量的2至15倍。为了获得热水(水)提取物，水浴回流提取可以在100至110℃重复一至四次达2至24小时，优选地2至10小时。

本发明还提供通过进一步分离生地黄、枸杞子、黄苓和白芷的组合提取物获得的来自生地黄、枸杞子、黄苓和白芷的组合提取物的级分(fraction)。级分分离可以使用本领域技术人员已知的分离方法进行。优选地，将四种药草生地黄、枸杞子、黄苓和白芷悬浮在水中然后用溶剂如己烷、氯仿、乙酸乙酯、丁醇等提取，得到生地黄、枸杞子、黄苓和白芷的可溶性级分。

本发明还提供用于皮肤美白的化妆品组合物，其包含生地黄、枸杞子、黄苓和白芷的组合提取物。

根据本发明的生地黄、枸杞子、黄苓和白芷的组合提取物由于使用了安全的天然成分而在应用于皮肤时不导致副作用并且显示优异的皮肤-美白效果，因为其证明了在抑制酪氨酸酶激活和抑制黑色素生物合成方面是有效的，因此其适合于用于皮肤美白的化妆品组合物。

与单一药草提取物者两种或更多种药草的组合提取物的每一个相比，根据本发明的包含生地黄、枸杞子、黄苓和白芷的组合提取物的用于皮肤美白的化妆品组合物，由于通过组合药草生地黄、枸杞子、黄苓和白芷的组分的协同作用，而在皮肤美白方面显示优异的效果。

在本发明中，生地黄、枸杞子、黄苓和白芷的组合提取物可以以粉末或液体的形式以基于化妆品组合物的总重量的0.001至10重量％，优选地0.01至5重量％的量添加至化妆品组合物中。

除了作为活性成分的生地黄、枸杞子、黄苓和白芷的组合提取物以外，本发明的化妆品组合物的组分还可以包括化妆品组合物中的常用成分，其包括，常规佐剂(例如，抗氧化剂、稳定剂、增溶剂、维生素、色素、着色剂和香料)和载体。

本发明的化妆品组合物可以被配制成本领域中典型制备的任意类型的制剂形式，其实例包括，但不限于，溶液、混悬剂、乳液、糊剂、凝胶、霜剂、洗剂、粉剂、肥皂、含表面活性剂的清洁剂、油、粉底、粉底乳(emulsion foundation)、粉底蜡(wax foundation)、喷剂等。更特别地，本发明的化妆品组合物可以被配制成皮肤软化剂、面部洗液(面霜，face lotions)、营养霜、按摩霜、精华液、面膜(pack)、眼霜、洁面霜、洁面泡沫(洗面奶，cleansing foam)、洁面水(卸妆水，cleansing water)、面膜、喷剂(spray)或粉剂的制剂形式。

当本发明的制剂形式为糊剂、霜剂或凝胶时，动物油、植物油、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮(有机硅，silicone)、斑脱土、二氧化硅、滑石或氧化锌等可以被用作载体组分。

当本发明的制剂形式为粉剂或喷剂时，乳糖、滑石、二氧化硅、氢氧化铝、硅酸钙或聚酰胺粉末可以被用作载体组分。特别地，如果其为喷剂，则其可以另外地含有推进剂，如氯氟烃、丙烷/丁烷或二甲醚。

当本发明的制剂形式为溶液或乳液时，溶剂、增溶剂或乳化剂可以被用作载体组分，其实例可以包括水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、丁二醇、1，3-丁二醇油、聚氧乙烯氢化蓖麻油、丙三醇、甘油、脂肪族酯、苯氧基乙醇、三乙醇胺、聚乙二醇、蜡、聚山梨醇酯60、脱水山梨醇倍半油酸酯、石蜡、脱水山梨醇硬脂酸酯、亲脂性单硬脂酸甘油酯、硬脂酸、硬脂酸甘油酯/PEG-400硬脂酸酯、羧基聚合物、cytosterol、聚甘油2-油酸酯、神经酰胺、胆甾醇、steareth-4、磷酸二鲸蜡酯、澳洲胡桃油(macadamia oil)、羧基乙烯基聚合物、黄原胶或脱水山梨醇的脂肪族酯等。

当本发明的制剂形式为混悬剂时，液体稀释剂(例如，水、乙醇、丁二醇或丙二醇)、助悬剂(例如、乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇酯和聚氧乙烯脱水山梨醇酯)、微晶纤维素、羟乙基纤维素、透明质酸钠、苯氧基乙醇、偏铝酸(aluminum metahydroxide)、班脱土、琼脂或黄蓍胶等可以被用作载体成分。

当本发明的制剂形式为含表面活性剂的清洁剂时，脂肪醇硫酸酯、脂肪醇醚硫酸酯、单酯磺基琥珀酸酯(monoester sulfosuccinate)、羟乙基磺酸酯(isethionate)、咪唑鎓衍生物、牛磺酸甲酯、肌氨酸酯、脂肪族酰胺醚硫酸酯(aliphatic amide ether sulfate)、、烷基酰胺甜菜碱、脂肪醇、脂肪族甘油酯、脂肪族二乙醇酰胺、植物油、羊毛脂衍生物或乙氧基化甘油脂肪酸酯等可以被用作载体成分。

本发明还提供用于皮肤美白的方法，所述方法包括施用有效量的生地黄、枸杞子、黄苓和白芷的组合提取物。

当在本文中使用时，术语“有效量”是指具有皮肤美白效果的生地黄、枸杞子、黄苓和白芷的组合提取物的量。

根据本发明的皮肤美白方法包括将包含生地黄、枸杞子、黄苓和白芷的组合提取物的组合物与皮肤接触。当在本文中使用时，皮肤包括，但不限于，面部、颈部、手臂以及脚和腿的皮肤。在皮肤美白中，生地黄、枸杞子、黄苓和白芷的组合提取物的量可以根据对象的年龄、色素沉积的严重度或皮肤的靶区域而变化。足够的组合提取物的量可以由本领域技术人员考虑这些因素而确定。此外，生地黄、枸杞子、黄苓和白芷的组合提取物可以与有效量的另外的有助于皮肤肤色增白的活性剂一起施用。

根据本发明的皮肤美白方法还可以包括鉴别需要皮肤美白的靶皮肤区域。鉴别过程可以由用户或第三方进行，所述第三方包括，例如，皮肤科医生、美容师或另一个人。

本发明还提供生地黄、枸杞子、黄苓和白芷的组合提取物在制备用于皮肤美白的化妆品组合物中的用途。用于制备化妆品组合物的生地黄、枸杞子、黄苓和白芷的组合提取物可以与可商购的佐剂、稀释剂等组合，或者可以与另一种活性剂组合使用以产生协同作用。当在本文中使用时，另一种活性剂的实例可以包括UV阻断剂(UV blocks)、保湿剂、去角质剂(exfoliators)、软化剂、皱纹改善剂等。

有利效果

根据本发明的生地黄、枸杞子、黄苓和白芷的组合提取物由于使用安全的天然成分而不具有副作用并且证明了在抑制酪氨酸酶激活和抑制黑色素生物合成，由此产生显著的皮肤美白效果方面是有效的，因此其作为用于皮肤美白的化妆品组合物是高度有效的。

附图简述

图1是显示在施用生地黄、枸杞子、黄苓和白芷的组合提取物后细胞生存力的变化的图。

图2是显示在施用生地黄、枸杞子、黄苓和白芷的组合提取物后酪氨酸酶活性的降低的图。

图3是显示在施用生地黄、枸杞子、黄苓和白芷的组合提取物后黑色素产生的减少的图。

图4是显示在施用生地黄、枸杞子、黄苓或白芷的单一药草提取物后黑色素产生的变化的图。

实施本发明的最佳方式

下文中，将参考实施例和试验例来进一步详细地描述本发明的公开内容，给出所述实施例和试验例用于理解本发明的公开内容并且不意在限制本发明的权利要求的范围。

实施例1：制备生地黄、枸杞子、黄苓和白芷的组合提取物

为了制备生地黄、枸杞子、黄苓和白芷的组合提取物，从Omniherb Inc.购买药草；生地黄(来源于韩国的庆北道)，枸杞子(来源于韩国的忠南道)，黄苓(来源于韩国的全罗南道)，白芷(来源于韩国的庆北道)。在使用前，将各个药草用水洗涤，然后阴干。

将100g生地黄、50g枸杞子、50g黄苓和35g白芷放入1L蒸馏水中。在100℃使所得的混合物通过回流管进行回流提取4小时，并且在真空下浓缩，得到62.26g的生地黄、枸杞子、黄苓和白芷的组合提取物。

对于作为对照组的个体药草提取物，将100g各个药草放入1L蒸馏水中。在100℃使由此获得的混合物各自通过回流管进行回流提取4小时，并且在真空下浓缩，分别得到41g生地黄提取物、34g枸杞子提取物、35g黄苓提取物和31g白芷提取物。

实施例2：确定生地黄、枸杞子、黄苓和白芷的组合提取物的细胞毒性

使用MTT测定来确定生地黄、枸杞子、黄苓和白芷的组合提取物的细胞毒性。

将1ml细胞悬浮液添加至鼠源的B16F10黑素瘤细胞，以10⁴个细胞/孔的密度置于24-孔微板的各个孔中并且在细胞培养箱(在37℃用5％CO₂吹扫)中使用含10％胎牛血清、2mM谷酰胺、100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素的DMEM培养基培养24小时。然后将培养的细胞用不同浓度(0至400μg/ml)的生地黄、枸杞子、黄苓和白芷的组合提取物处理。在培养48小时后，将细胞用PBS(pH 7.4)洗涤两次，并且将1ml在培养基中10倍稀释的MTT试剂(0.5mg/ml)提供给细胞。将微板中的细胞置于细胞培养箱(在37℃用5％CO₂吹扫)中持续4小时以反应。在4小时的MTT反应后，将培养基弃去，并加入1ml DMSO溶液以将细胞溶解。通过用分光光度计测量在540nm处的吸光度来确定该时间点形成的甲染料的浓度。

细胞生存力如由公式1给出的计算。结果显示在图1中。

[公式1]

结果显示在图1中。如图1中所示，生地黄、枸杞子、黄苓和白芷的组合提取物在其浓度为约100μg/ml以下时几乎不影响细胞生存力，而在其浓度为200μg/ml以上时其相对于对照组显示显著的细胞毒性。

实施例3：对生地黄、枸杞子、黄苓和白芷的组合提取物抑制酪氨酸酶激活的效果的评价

将从鼠源B16F10黑素瘤细胞提取的酪氨酸酶用于评价估生地黄、枸杞子、黄苓和白芷的组合提取物的酪氨酸酶抑制效果。

将黑素瘤细胞添加到100mm细胞培养板中并且培养至95％汇合度。将培养的细胞用PBS(pH 7.4)洗涤两次并且使用含0.1％triton 100的0.1M磷酸盐缓冲液(pH 6.8)来提取酶。将酶溶液的蛋白浓度定量至20μg并且用不同浓度(0至1μg/ml)的生地黄、枸杞子、黄苓和白芷的组合提取物处理。在37℃反应10分钟后，将0.15％多巴(dopa)(3，4-二羟基-L-苯丙氨酸)溶液添加至反应溶液以在37℃反应20分钟。然后，使用分光光度计来测量在475nm处的吸光度.

当反应溶液为褐色时，加入蒸馏水代替0.15％多巴溶液以制备试验组(a)。另一方面，将反应溶液用0.15％多巴溶液和取决于浓度的生地黄、枸杞子、黄苓和白芷的组合提取物处理以制备试验组(b)。并且在从(b)组的吸光度减去(a)组的吸光度后，计算值。

根据公式2计算酪氨酸酶抑制活性。结果显示在图2中。

[公式2]

结果显示在图2中。相比于对照组，如图2中所示，自0.1mg/ml以上的生地黄、枸杞子、黄苓和白芷起，酪氨酸酶活性以依赖于浓度的方式下降。更具体地，利用浓度为0.1mg/ml和1mg/ml的组合提取物，酪氨酸酶活性分别降至12.1％和33.1％。

实施例4：对生地黄、枸杞子、黄苓和白芷的组合提取物对黑色素产生的抑制作用的评价

使用鼠源的B16F10黑素瘤来评价黑色素生物合成。

将B16F10黑素瘤细胞添加到100mm细胞培养板中并且在细胞培养箱(在37℃用5％CO₂吹扫)中使用含10％胎牛血清、2mM谷酰胺、100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素的DMEM培养基培养至90％汇合度。

为了测量对黑色素产生的抑制作用，将B16F10黑素瘤细胞以10⁴个细胞/孔的密度置于24-孔板的各孔中并且在细胞培养箱(在37℃用5％CO₂吹扫)中培养24小时。将细胞用不同浓度(0至100μg/ml)的生地黄、枸杞子、黄苓和白芷的组合提取物、个体药草提取物、两种以上药草的组合提取物、以及用作阳性对照的200μM曲酸处理，然后培养48小时。除去培养基，将细胞用PBS洗涤两次，用1N NaOH处理并且培养30多分钟。将培养的溶解的细胞收集并且在100℃沸腾30分钟。对于所得的溶液，利用分光光度计测量在415nm处的吸光度。使用标准曲线计算黑色素浓度，并且确定细胞溶液的蛋白浓度以校准黑色素浓度。利用BCA蛋白质测定试剂盒(Thermo Scientific，23225)基于Lowry法测量蛋白浓度。

结果显示在图3和4中。

图3(a)显示在使用如实施例1中制备的生地黄、枸杞子、黄苓和白芷的组合提取物的情况下的黑色素浓度；并且图3(b)显示以实施例1的相同浓度使用生地黄、枸杞子、黄苓和白芷的个体药草提取物的组合时的黑色素浓度。如图3中所示，在使用生地黄、枸杞子、黄苓和白芷的组合提取物的情况下黑色素产生以依赖于浓度的方式显著减少。而且，即使在使用个体药草提取物的组合时，对黑色素产生的抑制作用也几乎相同。

图4显示在使用生地黄、枸杞子、黄苓或白芷的单一药草提取物的情况下黑色素生物合成的变化。如从图4可见的，任何生地黄、枸杞子、黄苓或白芷的单一药草提取物对黑色素的生物合成都没有效果。

换言之，生地黄、枸杞子、黄苓或白芷的单一药草提取物对黑色素合成的减少几乎没有效果，而由于个体药草的协同作用，生地黄、枸杞子、黄苓和白芷的组合提取物在减少黑色素产生方面是高度有效的。

此外，当考虑各个药草提取物的细胞毒性时，与个体药草提取物的任意组合相比，以上文限定的重量份构成的生地黄、枸杞子、黄苓和白芷的组合提取物在皮肤美白方面都要有效得多。

制剂例1：制备含有生地黄、枸杞子、黄苓和白芷的组合提取物的面部洗液

根据如以下给出的表1的组成，进行程序以制备1kg的含有生地黄、枸杞子、黄苓和白芷的组合提取物(实施例1)的面部洗液。

[表1]含有生地黄、枸杞子、黄苓和白芷的组合提取物的面部洗液的组成

制剂例2：制备含有生地黄、枸杞子、黄苓和白芷的组合提取物的营养洗液

根据如以下给出的表2的组成，进行程序以制备1kg的含有生地黄、枸杞子、黄苓和白芷的组合提取物(实施例1)的营养洗液。

[表2]含生地黄、枸杞子、黄苓和白芷的组合提取物的营养洗液的组成