用于治疗泌尿生殖系统癌症的减毒或失活病原性大肠杆菌的制作方法

本发明涉及失活或减毒病原性细菌、包含所述细菌的组合物及其用于治疗癌症诸如泌尿系统癌症和前列腺癌的用途。

背景技术：

在欧洲和美国的男性中，膀胱癌均是第四常见的癌症。在超过65岁的患者中的高且上升的发病率表明该癌症的负荷将随人口老化而增加。

使用细菌来增强免疫性和治疗癌症由williamcoley于1891年首先采用，其用化脓性细菌的提取物成功治疗了肉瘤(coley,w.b.1910,procrsocmed.3,1-48)。

牛分枝杆菌(mycobacteriumbovis)卡介苗(bcg)疫苗是连同化学疗法一起用于浅表性膀胱癌的标准治疗。bcg诱导的肿瘤消除涉及伴有细胞因子的大量释放的局部免疫应答和主要通过th1细胞实现的延迟型免疫应答。

天然杀伤(nk)细胞是杀死肿瘤和病毒感染细胞的先天性免疫系统的细胞。由nk细胞实现的杀死主要通过识别存在于靶细胞的表面上的配体的天然细胞毒性受体(ncr)来介导。ncr配体在膀胱肿瘤上的表达水平可预测bcg治疗对人的膀胱癌的有效性(yutkin等jurol178,2660-2664)。在鼠类模型中，发现bcg成功治疗膀胱肿瘤依赖于nk细胞，并且在nk缺陷型小鼠中完全无效(brandau等,intjcancer2001,92,697-702)。针对非肌肉侵袭性膀胱癌的bcg疗法使复发风险降低32％，并且使肿瘤进展几率降低27％。然而，用bcg进行的免疫疗法极大受阻于它的毒性和严重不良反应，其导致10-58％的患者中断治疗。尽管是减毒的，但bcg仍然是毒性微生物，并且它接种于患者的膀胱中常常导致严重的危急生命的感染。bcg可感染肺、肝、骨和循环系统。由于bcg对抗生素的响应缓慢，所以这个感染难以治疗。此外，bcg是一种使人生厌的(高维护)、生长缓慢的微生物(倍增时间是23小时)。

由泌尿系统病原性大肠杆菌(escherichiacoli)(upec)引起的泌尿道感染(uti)是一种非常常见的疾病，并且约50％的女性在她们的生命中的某一点将具有至少一次uti发作。天然杀伤(nk)细胞识别各种病原体，然而，它们在upec介导的uti中的参与实际上是未知的。近来，本发明的发明人显示upec主要通过它们的i型菌毛粘附于nk细胞，并且通过溶血素(hemolysin)a毒素来杀死nk细胞。在不存在溶血素a下，nk细胞直接对细菌起应答，并且分泌导致受感染膀胱中的细菌负荷降低的tnf-α(gur等,2013.cellhostmicrobe14,664-674)。

wo2005/120560公开了治疗受试者的特定器官、组织或细胞的癌症的方法，所述方法包括施用一种或多种病原性细菌物种的抗原，所述病原性细菌物种在所述特定器官、组织或细胞中具有病原性。

欧洲专利号1765391公开一种或多种病原性细菌物种的杀死的细菌、或其细胞壁提取物、细胞膜提取物、全细胞提取物、或分离的抗原的制剂，所述制剂用于治疗受试者的特定器官或组织中的癌症。

radford等人(genetherapy,2002,9:1455-1463)描述了通过直接注射表达李斯特菌溶素o(listeriolysino)(肿瘤抗原)和卵清蛋白(ova)的重组大肠杆菌对小鼠进行免疫接种能够提供抗肿瘤响应，导致对75％的用ova表达性黑素瘤细胞系(b16-ova)激惹的小鼠的完全保护。

对用于治疗癌症的、具有提高的有效性、具有较少或不具有副作用的其他方法，存在未满足的需求。

技术实现要素：

本发明涉及用于治疗泌尿生殖系统癌症的特定类型的大肠杆菌细菌。在一些实施方式中，本发明提供用于治疗癌症的源于泌尿系统病原性大肠杆菌的溶血素缺陷型突变的细菌菌株和包含所述细菌菌株的组合物。在一些实施方式中，本发明进一步提供用于治疗癌症的失活泌尿系统病原性大肠杆菌。具体来说，本文公开的细菌可用于减弱或抑制肿瘤生长，以及甚至诱导肿瘤消退。本发明进一步提供治疗癌症的方法，其包括直接向肿瘤部位施用突变的或失活的病原性大肠杆菌。

本发明部分地基于以下出乎意料的发现：用溶血素突变的大肠杆菌菌株治疗携带膀胱肿瘤的小鼠显著提高小鼠的存活。此外，通过甲醛失活的病原性大肠杆菌细菌菌株显示出高度强力抗膀胱癌活性。此外，当相较于牛分枝杆菌卡介苗(bcg)和幽门螺杆菌(helicobacterpylori)时，大肠杆菌的细菌菌株在直接向膀胱中施用时显示极其优越的抗癌活性。现在公开的是根据本发明的原理用细菌进行治疗显著降低携带膀胱癌的小鼠中的肿瘤负荷。出乎意料的是，尽管在小鼠已具有可见肿瘤之后开始治疗，但肿瘤消退，并且值得注意的是，大多数肿瘤在数周内被消除。

在不受任何特定理论或作用机理束缚下，溶血素缺陷型细菌的抗癌作用可归因于对nk细胞的细胞毒性降低。泌尿系统病原性大肠杆菌在被接种至膀胱中时，使天然杀伤细胞募集至膀胱，粘附于nk细胞，并且将它们杀死。当被施用至膀胱中时，本发明的溶血素缺陷型细菌使nk(和t细胞)募集至膀胱，但不杀死，或以较小效率杀死nk细胞。现在首次公开溶血素基因hlya中的突变足以引发具有所述突变的尿路病原性大肠杆菌(upec)的提高的抗癌活性。

本发明进一步公开通过甲醛失活的尿路病原性大肠杆菌(upec)和肠病原性大肠杆菌(epec)的菌株表现出高度强力抗膀胱癌活性。出乎意料的是，经甲醛失活的upec和epec对携带可见和大型肿瘤的小鼠具有高度高效的抗癌作用。这些小鼠的存活率显著较高。

本发明进一步提供治疗癌症的有利方法，其包括囊内施用细菌。当直接向膀胱癌小鼠模型的膀胱中施用时，细菌的治疗活性是高度强力的。

根据一个方面，本发明提供一种用于治疗生殖泌尿系统的癌症的源于病原性大肠杆菌菌株的溶血素缺陷型突变细菌菌株或其组分。

根据一些实施方式，溶血素缺陷型细菌菌株是泌尿系统或肠病原性突变的大肠杆菌菌株。根据某些实施方式，突变的细菌菌株源于尿路病原性大肠杆菌(upec)。根据其它实施方式，突变的细菌菌株源于肠病原性大肠杆菌(epec)。

根据一些实施方式，溶血素缺陷型突变大肠杆菌细菌菌株或其组分用于通过囊内施用来治疗泌尿生殖系统癌症。根据示例性实施方式，溶血素缺陷型细菌菌株或其组分用于在癌症部位或在癌症部位附近局部施用。

根据一些实施方式，突变的细菌菌株在hly基因中具有突变。

根据一些实施方式，hly基因选自：hlya、hlyc和hlyd。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。

根据一些实施方式，相较于野生型，溶血素缺陷型突变细菌菌株具有的溶血素的量降低至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。

根据一些实施方式，相较于野生型，溶血素缺陷型突变细菌菌株具有活性降低至少25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的溶血素。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。

根据一些实施方式，溶血素缺陷型突变细菌菌株是减毒的。

根据额外方面，本发明提供一种用于治疗生殖泌尿系统的癌症的失活尿路病原性大肠杆菌菌株cft073或其组分。根据一些实施方式，治疗包括囊内施用。

根据额外方面，本发明提供一种用于通过囊内施用来治疗泌尿生殖系统癌症的失活病原性大肠杆菌细菌菌株或其组分。根据示例性实施方式，失活病原性细菌菌株或其组分用于在癌症部位或在癌症部位附近局部施用。

根据一些实施方式，失活病原性细菌菌株是尿路病原性大肠杆菌(upec)。根据其它实施方式，失活病原性细菌菌株是肠病原性大肠杆菌(epec)。

根据额外方面，本发明提供一种用于治疗生殖泌尿系统的癌症的大肠杆菌细菌菌株，其中所述细菌菌株具有i型菌毛，所述细菌菌株选自：(i)源于病原性大肠杆菌菌株的溶血素缺陷型突变细菌菌株；(ii)失活upec；和(iii)失活epec。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。

根据一些实施方式，upec菌株是cft073。

根据额外方面，本发明提供一种用于治疗生殖泌尿系统的癌症的大肠杆菌细菌菌株，其中所述细菌菌株过度表达i型菌毛。

根据一些实施方式，生殖泌尿系统的癌症选自：膀胱癌、前列腺癌、肾癌和尿道癌。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。根据某些实施方式，生殖泌尿系统的癌症是膀胱癌。根据额外示例性实施方式，癌症是非肌肉侵袭性膀胱尿道上皮癌。

根据一些实施方式，细菌组分选自蛋白质、膜和细胞壁级分(fraction)。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。根据某些实施方式，组分是1型菌毛。根据其它实施方式，组分包括脂多糖(lps)。

根据一些实施方式，细菌菌株具有i型菌毛。

根据一些实施方式，细菌菌株或其组分用于与抗癌剂组合使用。

根据一些实施方式，细菌菌株或其组分与另一类型的病原性细菌菌株组合用于治疗生殖泌尿系统的癌症。

细菌菌株可本身或以包含细菌的组合物形式施用。根据一些实施方式，细菌菌株用于每周施用。根据某些实施方式，细菌菌株用于以包含10⁷至10¹²个细菌细胞的单位剂型每周施用。根据某些实施方式，细菌菌株用于以包含10⁷至10¹²个细菌细胞的单位剂型每周施用，持续至少2周的时期。

本发明进一步提供一种源于尿路病原性大肠杆菌(upec)的溶血素缺陷型突变细菌菌株，其是大肠杆菌cft073的突变体，其中所述突变体在溶血素毒素基因中具有插入，并且其中所述突变体选自：在hlya基因中具有插入的c93、在hlyc中具有插入的e49和在hyld中具有插入的d57。根据一些实施方式，突变细菌菌株是在hlya基因中具有插入的c93。

根据额外方面，本发明提供一种包含细菌菌株和药用可接受的载体的药物组合物。

根据一些实施方式，药物组合物被配制成供囊内施用。

本发明进一步提供一种治疗生殖泌尿系统的癌症的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用源于大肠杆菌细菌菌株的病原性菌株的溶血素缺陷型突变细菌菌株或其组分。

本发明进一步提供一种治疗生殖泌尿系统的癌症的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用失活大肠杆菌尿路病原性菌株或其组分。根据一些实施方式，失活菌株是cft073。根据特定实施方式，失活通过甲醛来进行。

本发明进一步提供一种治疗膀胱癌的方法，所述方法包括向有此需要的受试者囊内施用失活病原性大肠杆菌。根据一些实施方式，施用的失活大肠杆菌具有i型菌毛。

本发明的其它目标、特征和优势将根据以下描述、实施例和附图而变得明晰。

附图说明

图1a-1d显示溶血素缺陷型upecc93对膀胱癌小鼠模型的存活的影响。

图1a是在有或无抗nk抗体nk1.1下，c93细胞治疗与牛分枝杆菌卡介苗(bcg)细胞治疗之间的比较。示出了在实验期间的小鼠存活百分比。pbs用作对照。

图1b-1d显示溶血素缺陷型upecc93对肿瘤尺寸的影响。使用用荧光素酶(luc)基因稳定转染的mb49膀胱癌肿瘤细胞(mb49-luc)在c57bl小鼠中诱导膀胱癌。在肿瘤接种后第3、10、17和24天，用bcg、upec溶血素失活c93突变体或用pbs(阴性对照)治疗小鼠。通过对荧光素酶表达的实时成像来测定在第14(图1b)、21(图1c)和27(图1d)天经麻醉动物中的肿瘤体积和扩散。箭头指示可见肿瘤。

图2显示经甲醛失活的野生型upec(cft073)对膀胱癌小鼠模型的存活的影响。使用mb49膀胱癌肿瘤细胞，在c57bl小鼠中诱导膀胱癌。10天后，用10⁸个用甲醛失活的野生型upeccft073细胞治疗小鼠。每周治疗持续30天(箭头指示治疗日)。pbs用作阴性对照。

图3a-3b显示经甲醛失活的c93或upec治疗对膀胱癌小鼠模型中膀胱形态的影响。使用mb49膀胱癌肿瘤细胞，在c57bl小鼠中诱导膀胱癌。用pbs(阴性对照)，用经甲醛失活的c93upec突变体(图3a)，或用经甲醛失活的野生型upec(cft073)治疗小鼠(图3b)。在肿瘤接种后第56天，从存活小鼠收集膀胱并且拍照。

图4显示经甲醛失活的upec(cft073fa)、肠病原性大肠杆菌(epecfa)或幽门螺杆菌(hpfa)治疗对膀胱癌小鼠模型的存活的影响。pbs用作阴性对照。

图5显示经甲醛失活的upec和幽门螺杆菌对局部免疫细胞募集的影响。将10⁸个经甲醛失活的upec或幽门螺杆菌接种至小鼠的膀胱中。2天后，处死小鼠，并且通过流式细胞计量术来定量nk细胞和t细胞。

图6显示用不同细菌菌株治疗的膀胱癌小鼠模型的膀胱中的相对细胞因子/趋化因子量。将1x10⁸个经甲醛失活的(fa)upeccft073、大肠杆菌xl1蓝(实验室大肠杆菌菌株)、幽门螺杆菌或bcg细胞接种至各小鼠的膀胱中。使用标准商业阵列来定量相对细胞因子/趋化因子量。

图7显示经甲醛失活的upec(cft073fa)、经甲醛失活的c93(c93fa)、热失活upec(cft073hi)或热失活c93(c93hi)治疗对膀胱癌小鼠模型的存活的影响。示出了在移行细胞癌(tcc)诱导之后的存活率百分比。pbs用作阴性对照。

图8显示施用途径对免疫细胞募集的影响。用10⁸个经甲醛失活的upeccft073囊内或皮下接种小鼠(n＝每组5只小鼠)。在48小时之后，收集膀胱，并且从膀胱提取外周血淋巴细胞(pbl)并使用细胞计量术进行分析。

发明详述

本发明提供失活病原性细菌菌株及其用于治疗泌尿生殖系统癌症的用途。本发明进一步公开使用溶血素缺陷型突变的细菌菌株治疗生殖泌尿系统的癌症的方法。此外，提供治疗癌症的方法，其包括直接向癌症部位施用突变的或失活的病原性细菌菌株的步骤。

相比于先前已知的使用细菌的方法，本发明的方法是有利的，因为它们阻抑免疫系统的细胞的能力被降低或中和。本发明的细菌充当募集针对癌细胞的免疫系统的强力和有效药剂。本发明的细菌可充当用于膀胱癌患者的通用疗法。疗法不取决于要求早期暴露于细菌的适应性免疫系统。在不希望受关于作用机理的任何理论束缚下，本发明的细菌局部性地起作用，并且使免疫细胞和/或免疫相关蛋白质募集至癌症部位中。此外，本发明的细菌在向小鼠囊内施用时不必活化全身性免疫应答，因此具有最小副作用。此外，当使细菌失活时，本发明的细菌被证明是高效的。总之，本文公开的细菌菌株似乎非常有希望作为一种用于治疗多种癌症而不引起不希望的副作用的有效药物。

本申请的发明人已显示泌尿系统病原性大肠杆菌主要通过它们的i型菌毛来粘附于人和鼠类天然杀伤(nk)细胞，并且通过它们的溶血素a毒素来杀死nk细胞。制备三种在溶血素a操纵子中被突变并且被称为‘c93’(在hlya中被突变)、‘e49’(在hlyc中被突变)和‘d57’(在hlyd中被突变)的泌尿系统病原性大肠杆菌菌株。发现c93突变的大肠杆菌菌株提高膀胱癌小鼠模型的存活。hlya基因编码溶血素a毒素结构蛋白。在一些实施方式中，hlya登记号是ae014075.1。hlyc编码溶血素活化性赖氨酸酰基转移酶，并且在一些实施方式中，hlyc基因id：1789689。hlyd编码溶血素易位蛋白。根据一些实施方式，溶血素是溶血素a毒素。

术语“溶血素缺陷型”是指细菌完全缺乏溶血素，或相较于野生型细菌菌株，细菌具有的溶血素的量降低至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。术语“溶血素缺陷型”进一步是指突变或功能非活性形式的溶血素，其中相较于野生型形式，所述突变形式具有的活性降低至少25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。细菌菌株的野生型形式具有活性溶血素。

术语“病原性细菌菌株”是指可引起感染的任何细菌菌株。

术语“泌尿系统病原性”和“尿路病原性”在本文中可互换使用。

术语“细菌菌株组分”是指能够以与细菌菌株类似的方式表现出抗癌活性的细菌菌株组分。组分的非限制性实例是蛋白质、膜和细胞壁级分。根据一些实施方式，细菌组分是免疫刺激性组分。

根据某些实施方式，组分是i型菌毛。1型菌毛是由许多革兰氏阴性细菌表达的粘附细胞器。它们促进粘附于粘膜表面(特别是粘附于膀胱表面)和炎性细胞，并且促成大肠杆菌在泌尿道中的发病机理。

术语“具有i型菌毛”是指细菌菌株具有活性或功能性i型菌毛。

根据一些实施方式，细菌菌株是过度表达i型菌毛的突变菌株。如本文所用，术语“过度表达”是指细菌被遗传修饰成以大于在未修饰细菌中产生的量的量产生i型菌毛。可通过使蛋白质突变以产生更具活性的形式或对抑制具有抗性的形式，通过移除抑制剂，或添加活化剂等来实现过度表达。也可通过移除阻遏物，向细胞添加多个拷贝的基因，或上调内源性基因等来实现过度表达。i型菌毛过度表达可如chelsealane等(journalofbacteriology,2007,第189卷,第15期.第5523–5533页)中所述来产生。

根据某一实施方式，组分包括脂多糖(lps)。脂多糖，也称为脂聚糖和内毒素，是由通过共价键接合的脂质和多糖组成的大分子，所述多糖由o-抗原、外部核心和内部核心组成。

术语“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳动物中通常以不受调控的细胞生长为特征的生理状况。

术语“泌尿生殖系统癌症”和“生殖泌尿系统的癌症”在本文中可互换使用，并且是指生殖或泌尿系统的任何癌症。非限制性实例包括膀胱癌、肾癌、尿道癌和前列腺癌。

如本文所用，术语“受试者”是指任何动物，诸如哺乳动物，如狗、猫、家畜，并且优选是人。

如本文所用，术语“治疗”受试者的疾病意图涵盖治愈以及改善所述疾病的至少一种症状。

术语“囊内”或“膀胱内滴注”在本文中可互换使用，并且是指其中优选通过导管来直接向膀胱中插入药物的治疗方法。

如本文所用，术语“突变体”是指已在例如hly基因或参与溶血素合成或表达路径的任何其它基因中的一者或多者中被突变一次或多次的本发明的细菌。

根据一些实施方式，细菌菌株是减毒的或失活的。

根据一些实施方式，本发明提供减毒病原性细菌。如本文所用，术语“减毒”描述细菌在动物整体中引起疾病的能力减弱，例如如由细菌的ld50所度量的。更具体来说，相较于野生型细菌，减毒细菌菌株的病原性特征已被减小，但减毒细菌能够在培养物中生长和维持。因此，本发明的减毒细菌菌株是不杀死它所施用的动物的菌株，或是仅当施用的细菌的数目远远大于杀死相同动物所需的野生型非减毒细菌的数目时杀死所述动物的菌株。

根据其它实施方式，本发明的细菌是失活的。术语失活细菌菌株指定“非活体”或“杀死的”细菌。

根据一些实施方式，通过暴露于固定化合物使细菌菌株失活。根据一些实施方式，通过选自以下的化合物使细菌菌株失活：甲醛、多聚甲醛、戊二醛及其衍生物。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。

在不受任何理论或机理束缚下，推测在保持i型菌毛功能方面甲醛失活优于其它失活方法。推测i型菌毛使得细菌菌株能够附着于膀胱壁并且不被洗掉。

可通过如本领域中已知的任何方法来产生溶血素缺陷型细菌。本文描述了用于产生这种细菌的各种各样的不同机理。根据一些实施方式，使溶血素合成中涉及的基因突变。根据示例性实施方式，使基因突变以便降低或消除它们的表达。根据额外实施方式，通过提供抑制剂来改变溶血素功能。

根据一些实施方式，溶血素缺陷型细菌菌株是突变的细菌菌株。如本文所用，术语“突变体”是指不同于野生型序列的氨基酸、dna或rna序列。本发明的突变体包括细菌菌株的dna中的核苷酸插入、缺失和/或取代，前提是突变体影响溶血素的表达和/或活性。术语“突变体”也指影响溶血素的表达和/或活性的任何dna或蛋白质修饰。

术语“插入突变”是指向dna序列中添加一个或多个核苷酸碱基对。

根据一些实施方式，细菌菌株具有缺失突变。优选的是，上述基因中的突变以缺失形式被引入，因为这将排除逆转突变，并且增强含有它们的菌株的安全性。优选的是使用无痕突变(scar-lessmutation)，这是指留有最少外源性序列(“疤痕(scar)”)的突变。具体来说，重要的是除去用于缺失的抗性标记。

根据一些实施方式，溶血素缺陷型细菌菌株是稳定的溶血素-a缺失(δhlya)的upec突变体。

根据某些实施方式，溶血素缺陷型细菌仅具有如上所述的单一类型的hly突变。在其它实施方式中，细菌具有两种或更多种特定的hly突变。

溶血素缺陷型细菌菌株可具有提高它们用于人类治疗的安全性和适合性的减毒性突变。aro基因是芳族氨基酸和代谢中间体分支酸(chorismate)的生物合成中所需要的。aro基因中的突变具有减毒性，因为突变体不能合成分支酸，分支酸是继而合成叶酸(不由哺乳动物产生)所需要的，叶酸是许多生物合成反应中的主要甲基供体。分支酸也是合成肠菌素(enterobactin)所需要的，肠菌素是在铁的体内获取中涉及的一种蛋白质。ompf和ompc是大肠杆菌中介导渗透调节的外膜孔蛋白(porin)。通过缺失编码aroc、ompc和ompf的基因和肠毒素即热不稳定肠毒素(lt)、热稳定肠毒素(st)和热稳定肠毒素1(east)的基因而被减毒的活的肠毒素产生性大肠杆菌(etec)被用作可商购获得的称为acam2017(acambisplc,cambridge,uk)的口服疫苗，其最近被显示即使在hiv感染的人中也能安全使用。因此，通过使上述基因突变而使细菌减毒可能是有用的。根据一些实施方式，溶血素缺陷型细菌菌株进一步在至少一种选自aroc、ompc和ompf基因的基因中被突变。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。

根据额外方面，本发明提供一种用于治疗泌尿系统的癌症的参与膀胱感染的溶血素缺陷型突变的细菌菌株或其组分。

根据额外方面，本发明提供一种用于治疗泌尿系统的癌症或前列腺癌的溶血素缺陷型大肠杆菌菌株或其组分。根据一些实施方式，溶血素缺陷型大肠杆菌菌株或其组分用于治疗膀胱癌。

根据额外方面，本发明提供一种用于治疗泌尿生殖系统的癌症的失活尿路病原性大肠杆菌(upec)。

根据额外方面，本发明提供一种用于治疗泌尿生殖系统的癌症的失活肠病原性大肠杆菌。

根据另一方面，本发明提供一种治疗有此需要的受试者的泌尿生殖系统的癌症的方法，其包括直接向所述受试者的膀胱施用溶血素缺陷型突变细菌菌株或其组分。根据一些实施方式，细菌菌株是大肠杆菌。根据某些实施方式，细菌菌株是upec。根据其它实施方式，细菌菌株是epec。

根据一些实施方式，细菌菌株表现出至少一种选自以下的生物活性：刺激淋巴细胞和/或nk细胞的抗肿瘤的细胞裂解活性；募集t细胞和嗜中性白细胞；刺激nk细胞的增殖；以及诱导已建立的肿瘤和/或原发性实体肿瘤的消退。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。

根据额外方面，本发明提供一种治疗膀胱癌的方法，所述方法包括直接向有此需要的受试者的膀胱施用失活大肠杆菌菌株cft073或其组分。根据一些实施方式，所述方法包括在癌症部位或在癌症部位附近局部施用。

根据额外方面，本发明提供一种治疗有此需要的受试者的泌尿生殖系统的癌症的方法，其包括施用大肠杆菌细菌菌株，所述细菌菌株过度表达i型菌毛。

根据额外方面，本发明提供一种用于治疗生殖泌尿系统的癌症的病原性大肠杆菌细菌菌株，其中所述细菌菌株过度表达i型菌毛。

根据额外方面，本发明提供一种用于治疗膀胱癌的病原性大肠杆菌细菌菌株，其中所述细菌菌株过度表达i型菌毛。

根据一些实施方式，细菌菌株是失活的。根据某些实施方式，通过甲醛使细菌菌株失活。

施用

可使用任何已知的做法来施用本发明的细菌。在一些实施方式中,向患者胃肠外施用细菌菌株。根据一些实施方式，胃肠外施用是囊内、静脉内、肌内、腹膜内、真皮内、经颊、经皮、真皮内、玻璃体内或皮下施用。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。

根据示例性实施方式，囊内施用本发明的细菌菌株。在某些实施方式中，直接向癌症部位或在癌症部位附近施用细菌菌株。

药物组合物

在一些实施方式中，本发明提供了包含细菌菌株或其组分和药用可接受的载体、赋形剂或稀释剂的药物组合物。

如本文所用，术语“药物组合物”是指包含至少一种药用活性成分的任何组合物，其被配制成使得它促进活性成分可接近靶器官。

本发明的组合物可包括完整细菌，或可包括表现出本发明的抗癌活性的提取物和/或组分诸如细胞壁或细胞膜提取物。

本发明的组合物可单独或以与其它化合物组合的形式，并在佐剂、缓冲剂或载体存在下进行施用。缓冲剂或载体包括但不限于注射用水或生理盐水。

根据一些实施方式，细菌菌株或其组分用于与抗癌剂组合使用。

根据一些实施方式，组合物被配制成供囊内施用。根据某些实施方式，以某一剂型提供细菌菌株或包含细菌菌株的组合物。根据一些实施方式，以选自1ng/kg至1g/kg，10ng/kg至0.1g/kg，50ng/kg至10mg/kg，0.1μg/kg至1mg/kg，以及0.2μg/kg至0.2mg/kg体重的量施用所述剂型。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。可能适当的是，在一整天中在适当的间隔下将所需剂量作为两个、三个、四个或更多个分剂量进行施用。

根据一些实施方式，治疗时期是至少1周、至少2周、至少4周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少6个月或至少1年。在一些实施方式中，治疗时期是1天至1周、1周至4周、1个月至3个月、3个月至6个月、6个月至1年，或持续超过一年。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。

根据一些实施方式，可以以给定剂型向患者施用总计10⁶至10¹²个微生物。根据某些实施方式，可以以给定剂型向患者施用总计10⁷至10¹⁰个微生物。根据额外实施方式，可以以0.5ml至40ml的每ml具有10⁶至10¹¹个细菌的细菌组合物的量提供有效量。

本文所述的任何制剂都可以作为单次治疗或作为多次治疗进行施用，诸如一周一次持续数周，或可根据设定的时间表间歇施用组合物，例如每周一次，每月一次，或当患者由原发性疾病复发时。

实施例

实施例1-溶血素缺陷型upecc93对膀胱癌小鼠模型的存活的影响

溶血素缺陷型突变体：

构建upeccft073(以700928^tm保藏)转座子文库：根据制造商说明书从pmodkan质粒纯化ez::tnkan转座体(gur等,cellhostmicrobe.2013年12月11日；14(6):664-74)，并且将其电穿孔至具有gfp表达性pcm18质粒的upeccft073细菌中。通过使突变体与nk细胞一起在37℃下孵育3小时来筛选文库以鉴定在nk细胞杀灭中涉及的基因。筛选到超过1000个突变的克隆。鉴定到3个具有完整粘附能力，但杀灭活性受损的突变体。为确定转座子位置，从所选克隆纯化基因组dna(genelute,sigma)，并且用不在插入的转座子内切割的hpai、mfei和ndei(newenglandbiolabs)进行限制性酶消化。接着使所得片段自我连接(takara)，并且作为反向pcr(herculaseii,agilent)的模板用于扩增转座子的侧接序列。使产生的序列相对于cft073基因组进行比对以确定插入突变的位置。鉴定了3个突变体的被破坏的基因，并且发现其存在于编码溶血素a毒素的hlya操纵子中：‘c93’(在hlya中被突变)、‘e49’(在hlyc中被突变)和‘d57’(在hlyd中被突变)(gur等,cellhostmicrobe.2013年12月11日；14(6):664-74)。

移行细胞癌(tcc)：

使用由günther等人(cancerresearch,2834-2837,591999年6月1日)所述的方案，将源于c57/b16小鼠的mb49膀胱癌细胞系膀胱内注射/植入至雌性小鼠中。简单来说，用氯胺酮/甲苯噻嗪(xalazine)使8-10周龄的雌性小鼠(每组10-12只小鼠)麻醉。将动物背部上约1cm²的区域剃毛，接着将小鼠放置在电烙装置的底板上。用25规格的特氟龙(teflon)导管对膀胱进行导管插入，并且插入24规格(0.7x19mm)的软质尖头导线直至它触碰膀胱壁。使导线连接于电烙装置，并且在最低功率设置下施加单极凝固电流持续5秒。在将线移除之后，滴注50μldmemmb49肿瘤细胞混悬液(每只小鼠30000个肿瘤细胞)。接着，在使小鼠麻醉的同时将导管夹紧并且在膀胱中留置2-3小时。使用用荧光素酶稳定转染的mb49-luc，从而使得能够用cccd照相机监测肿瘤。

膀胱内治疗：

在实施肿瘤细胞之后2天，将小鼠随机分入6个组中，并且一周一次通过膀胱内滴注来接受各种治疗。通过被插入到膀胱中的导管来注射细菌或pbs。

组1：用pbs治疗。首次膀胱内滴注是在tcc接种之后3天，接着每周进行(总计5次注射)。

组2：用pbs(如对组1所描述的)和抗nk1.1抗体(mabpk136，通过腹膜内注射)一周两次(在第1天，在第4天，接着每周进行持续6周)治疗。

组3：用含有10⁹个/mlc93细菌的50μl治疗。首次膀胱内滴注是在tcc接种之后3天，接着每周进行(总计5次注射)。

组4：用含有10⁹个/mlc93细菌的50μl(如对组3所描述的)和抗nk1.1抗体(mabpk136)一周两次(在第1天，在第4天，接着每周进行持续6周)治疗。

组5：用bcg菌株(每小瓶2-8x10⁸cfu)治疗。在3ml标准盐水中使该小瓶复溶，并且每只小鼠注射0.05ml。首次膀胱内滴注是在tcc接种之后3天，接着每周进行(总计5次注射)。

组6：用bcg菌株(如上所述)与抗nk1.1抗体(mabpk136)的组合一周两次(在第1天，在第4天，接着每周进行持续6周)治疗。

在第一周每日，接着一周3次检查小鼠。使用cccd成像，每周监测肿瘤进展。对于体内荧光素酶测定/cccd成像，用异氟烷使小鼠麻醉。以125μg/g体重的量ip注射荧光素(luciferin)，并且在5-10分钟内进行成像。

在实施肿瘤之后第62天，使用氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉，随后进行颈部脱位来处死所有小鼠。

实验程序：

第-1天：检验mb49肿瘤细胞系的荧光素酶以及用于第2、4和6组小鼠的nk1.1注射液(每只小鼠100微克)。

第0天：实施肿瘤。

第3天：用如上所述的pbs、c93或bcg和用于第2、4和6组小鼠的nk1.1注射液(每只小鼠100微克)治疗。

对于在肿瘤植入之后的其余5.5周：

-用pbs、c93或bcg一周一次治疗。

-一周一次进行cccd成像

结果：

为考查溶血素缺陷型细菌对癌症的影响，在小鼠中诱导膀胱癌，并且测量用c93细胞治疗的小鼠的存活率和肿瘤尺寸。用mb49膀胱癌细胞对c57bl小鼠(每组10只小鼠)进行膀胱内接种。如上所述，与或不与nk1.1mab(贫化nk细胞的抗体)一起用pbs、c93或bcg治疗小鼠。

如图1a中所示，当相较于bcg治疗或对照时，用c93治疗膀胱癌使存活率增加。惊人的是，c93治疗几乎不受nk细胞贫化影响，具有非常强的抗癌活性。相比之下，bcg治疗受nk细胞贫化高度影响。值得注意的是，所有c93治疗小鼠都在研究中存活。此外，c93治疗诱导肿瘤消退。在肿瘤细胞植入之后第14天，大多数小鼠具有大型和可见的肿瘤。值得注意的是，在27天之后，在用c93细胞治疗的小鼠中未观察到可见肿瘤。相比之下，用pbs治疗的小鼠和若干bcg治疗小鼠具有可见肿瘤(图1b-1d)。在肿瘤接种后第56天，从存活小鼠收集膀胱并且拍照。图3a显示用c93治疗的小鼠的膀胱看起来是正常的。相比之下，用pbs治疗的小鼠的膀胱被扩大并且变畸形。

实施例2-失活upec对膀胱癌小鼠模型的存活的影响

使upeccft073过夜暴露于甲醛(4％于pbs中)，洗涤三次，并且使其达到od＝1(约10⁹个细胞/毫升)。

为测试是否所有细菌都由于甲醛处理而被杀死，将100μlod＝1混悬液以1:1、1:10和1:100稀释度进行涂铺，并且在37℃下孵育过夜。未检测到生长，从而确认细菌失活。

使用甲醛vacuettes试剂盒(目录号k-4605d)chemetrics(va.usa)测量细菌制剂中的残余甲醛的量，并且发现其是0-5ppm(0.0005％)(n＝3)。

接着，考查经甲醛失活的细菌对膀胱癌小鼠模型的存活率的影响。将mb49膀胱癌细胞接种至c57bl小鼠的膀胱中。在癌接种之后10天开始治疗。用pbs(阴性对照)，或用10⁸个用甲醛失活的野生型upec菌株cft073细胞每周治疗小鼠(用箭头标记的那些天；图2)。图2显示用经甲醛失活的upec治疗能够高度有效地对抗膀胱癌。用失活upec菌株cft073治疗的小鼠的存活率得以显著增加。在肿瘤接种后第56天，从存活小鼠收集膀胱并且拍照。图3b显示用cft073治疗的小鼠的膀胱看起来是正常的。相比之下，用pbs治疗的小鼠的膀胱被扩大并且变畸形。

实施例3-失活肠病原性大肠杆菌(epec)对膀胱癌小鼠模型的存活的影响

为进一步考查甲醛失活的影响，考查用通过甲醛失活的upec或epec治疗的膀胱癌小鼠模型的存活率。将mb49膀胱癌细胞接种至c57bl小鼠的膀胱中。在tcc接种之后第10天开始，用3x10⁸个细胞/小鼠的upec(cft073fa)、epec(epecfa)和幽门螺杆菌每周治疗小鼠。

如图4中所示，相较于幽门螺杆菌治疗和对照(pbs)，用upec和epec治疗的携带膀胱癌的小鼠表现出显著更高的存活率。

实施例4–失活野生型upec而非幽门螺杆菌将t细胞和nk细胞吸引至膀胱

考查upec细菌募集免疫细胞的能力。将1x10⁸个经甲醛失活的upeccft073或幽门螺杆菌接种至小鼠的膀胱中。2天后，处死小鼠，并且通过流式细胞计量术来定量nk细胞和t细胞。如图5中所示，相较于用幽门螺杆菌接种的膀胱(下部图版；对于nk细胞和t细胞分别是0.9％和4％)，upec接种的小鼠膀胱中的nk细胞和t细胞的数目(上部图版；分别是6.9％和22％)显著更高。

接着，考查在细菌接种之后的细胞因子/趋化因子应答概况。将1x10⁸个经甲醛失活的(fa)upeccft073、大肠杆菌xl1蓝(实验室大肠杆菌菌株)、幽门螺杆菌或bcg接种至各小鼠的膀胱中。在2天之后，处死小鼠，并且使用细胞因子阵列定量膀胱细胞因子/趋化因子。值得注意的是，当相较于用其它类型的细菌接种时，在用经甲醛失活的(fa)upec接种的膀胱中，若干细胞因子和其它免疫相关分子诸如il-1ra和sicam-1的量显著更高(图6)。

总之，这些结果表明失活upec诱导局部免疫应答。

实施例5–经甲醛失活的大肠杆菌菌株相较于热激杀死的细菌具有优越的抗癌活性

接着，在甲醛失活与热激失活之间进行比较。用经甲醛失活的upec菌株cft073或c93突变体和通过加热杀死的cft073或c93菌株每周治疗携带mb49膀胱癌细胞的小鼠。进行如实施例1中所述的程序。对照小鼠接受pbs。

图7显示用经甲醛失活的细菌治疗优于用热失活的细菌治疗，表明存活率提高。

实施例6–施用途径对免疫细胞募集的影响

为考查施用途径的影响，用10⁸个经甲醛失活的upeccft073囊内或皮下接种小鼠(n＝每组5只小鼠)。在48小时之后，收集膀胱，并且从膀胱提取外周血淋巴细胞(pbl)并使用细胞计量术进行分析。

如图8中所示，在囊内接种的小鼠的膀胱中，pbl数目显著更高(以总计数计，150,000对1,400)，其中17％是t细胞(cd3阳性)，并且17％是gfp表达性nk细胞。

实施例7–细菌膜和细菌膜蛋白提取对膀胱癌小鼠模型的存活的影响

细菌膜和膜蛋白提取：

使细菌细胞生长过夜，并且于pbs中洗涤并再混悬于补充有3mmpmsf(sigma-aldrich,germany)的pbs中。french压碎器(8,000psix3次)用于破坏细胞，并且通过在4℃下在10,000×g下沉降10分钟来移除未破损细胞。

或者，使用玻璃珠来破坏细胞。将细胞混悬液放置在含有600μl玻璃珠(106μm，sigma)的2ml微量离心管中。接着使用fastprep细胞破坏器(bio101，savantinstruments,inc.,ny,usa)在6m/s的速度下持续45s将细胞破坏2至4次，其中在各次破坏之间进行冰冷却。在10,000×g下将裂解产物离心5分钟。

收集上清液并经受高速离心(150,000xg，在4℃下，持续1小时)，并且将所得到的含有细胞壁的集结块洗涤两次，再混悬于磷酸钠缓冲液中并保持在-80℃下直至使用。为测定蛋白质量和完整性，将各集结的膜的样品于sds-page样品缓冲液中煮沸10分钟，并且使用sds-page(12％和4％)分级以显现蛋白质条带。

外膜囊泡制备：

通过在4℃下在10,000×g下离心20分钟来收集稳定期培养物。收集培养上清液，并且经0.2μm过滤器(whatmanschleicher&schuell)过滤。在100,000×g下将无细胞上清液离心2小时。丢弃上清液，并且通过在100,000×g下离心用tris缓冲盐水(tbs，0.05mtris-hcl[ph7.8]，0.1mnacl)将含有囊泡的集结块洗涤两次。将集结块储存在-20℃下直至进一步使用。

细菌裂解产物：

使细菌细胞生长过夜，于pbs中洗涤并再混悬于补充有3mmpmsf(sigma-aldrich,germany)的pbs中。

将细胞混悬液放置在含有600μl玻璃珠(106μm，sigma)的2ml微量离心管中。使用fastprep细胞破坏器(bio101，savantinstruments,inc.,ny,usa)在6m/s的速度下持续45s将细胞破坏2至4次，其中在各次破坏之间进行冰冷却。在10,000×g下将裂解产物离心5分钟，并且收集上清液。

如先前实施例中所述向膀胱癌小鼠模型施用细菌裂解产物细菌蛋白质提取物和膜级分。考查存活率和肿瘤尺寸。

实施例8–根据任何以上实施方式的细菌菌株的临床试验

设计用于评估细菌菌株对膀胱癌患者的作用的临床研究。主要目标在于评估经甲醛失活的尿路病原性大肠杆菌cft073的功效和安全性，所述经甲醛失活的尿路病原性大肠杆菌cft073作为6次膀胱内滴注给予，每次滴注10¹⁰失活cfu(或细胞)。主要功效目标在于确定在6次每周膀胱内滴注测试产品之后，所述治疗用于预防肿瘤复发的能力。在开始治疗之后8-10周评估复发。主要安全性目标在于确定由测试产品诱导的不良作用。次要目标包括确定在8-10周之后未复发的无肿瘤患者中的长期(一年)癌症复发免除率和达到肿瘤复发的时间。

研究设计：

受试者招募-通过以色列哈达萨医疗中心(hadassahmedicalcenter,israel)的泌尿肿瘤学门诊部来招募患者。

受试者纳入准则-患者经受全面经尿道切除复发性、中度至高度复发风险的非肌肉侵袭性膀胱癌(nmibc)，并且在这个复发之前具有至少一个辅助免疫疗法或化学疗法膀胱内治疗过程的历史。

受试者排除准则：

i.妊娠或哺乳期妇女

ii.t1高级膀胱尿道上皮癌

iii.伴有上尿道尿道上皮癌

iv.膀胱憩室或尿道前列腺部tcc

v.肌肉侵袭性uc

vi.转移性uc

vii.卡诺夫斯库氏表现状况(karnofsky’sperformancestatus)<60

viii.已知免疫缺陷状况

ix.活动性泌尿道感染

x.其它活动性恶性肿瘤

同意参与研究的患者在经尿道切除膀胱肿瘤(turbt)之后4-5周内开始治疗。用每周膀胱内滴注经甲醛失活的upec治疗患者6周。通过12frenchtiemann尿道导管来给予产品，并且患者被要求节制排尿2小时。

受试者追踪：

在末次膀胱内治疗之后2个月以及此后每4个月持续2年来进行尿培养、尿分析、膀胱镜检查和尿细胞学测试。

表1.治疗、安全性和疾病评估的过程。

配制和制备：

使新鲜cft073菌落在lb培养基中生长过夜。通过在4℃、6000rpm下离心5分钟来集结10¹⁰cfu的细菌，并且用30mlpbs洗涤两次。将集结块再混悬于10ml4％甲醛中，接着将细菌在4℃下孵育过夜进行失活。通过在相同条件下离心来集结失活细菌，于30mlpbs中洗涤三次，再混悬于pbs中，并且使其达到10⁹个细胞/毫升的浓度(od＝1，600nm)。最终产物标记为cft-fa(经甲醛失活的upeccft073)。

对特定实施方式的上述描述如此充分地揭示了本发明的一般特性以致其他人可在不进行过度实验以及不脱离一般构思的情况下，通过应用当前知识而容易地对所述特定实施方式进行修改和/或改适以用于各种应用，并且因此，所述改适和修改应该并且意图被包括在所公开实施方式的等效物的含义和范围内。应了解，本文采用的措辞或术语是出于描述而非限制的目的。在不脱离本发明的情况下，用于执行各种所公开功能的手段、材料和步骤可采用多种替代性形式。