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本申请要求2014年10月6日提交的美国临时申请号62/060,311的权益。上述申请的完整教导以引用的方式并入本文。
背景
囊性纤维化(cf)是一种在白种人间每2500个活产新生儿中约有1个受感染的致死的隐性遗传病。(cohen-cymberknoh,m等,am.j.respir.crit.caremed.1463-1471,2011；boat等,themetabolicbasisofinheriteddisease,第6版,第2649-2680页,mcgrawhill,ny(1989))。每25个人中约有1个是疾病的携带者。囊性纤维化的主要症状包括慢性肺疾病、胰腺外分泌机能不全以及升高的汗液电解质水平。所述症状与囊性纤维化一致，是一种外分泌病症。(hantash,f：美国专利申请号20060057593)。
cf基因编码camp/pka依赖性需要atp的膜氯离子通道，所述膜氯离子通道通常见于许多分泌上皮细胞中并且被称为cftr(囊性纤维化跨膜传导调节蛋白)目前存在超过1900种的影响cftr的已知突变，其中许多产生疾病表型。约75％的cf等位基因含有δf508突变，在δf508突变中，丢失了三联体密码子，从而导致蛋白质的508位处缺失苯丙氨酸。这种改变的蛋白质不能被运输至细胞中的正确位置并且通常被蛋白酶体破坏。能够到达正确位置的少量蛋白质功能较差。(cuthbertaw,britishjournalofpharmacology,163(1),173–183,2011)。
cftr基因中的突变导致调控跨越某些上皮细胞表面处的顶膜的离子转运的蛋白质的不存在或功能障碍。尽管cftr主要作为氯通道起作用，但是其具有许多其他作用，包括抑制钠转运通过上皮钠通道、调控外向整流氯通道、atp通道、细胞内囊泡转运，以及抑制内源性钙激活的氯通道。cftr还涉及碳酸氢盐-氯离子交换。碳酸氢盐分泌不足导致鲁米那粘蛋白的差溶解性和聚集。增稠的分泌物对胰腺内导管的堵塞导致胰腺组织的自溶作用，使胰腺体被脂肪所取代，从而导致胰腺功能不全和随后的营养不良。在肺中，cftr机能障碍导致气道表面液体(asl)耗尽并且使产生附着至气道表面的粘性粘液变稠。结果是粘液纤毛清除率(mcc)降低并且宿主防御能力受损。脱水增稠的分泌物导致有限特殊细菌谱(主要为金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)和铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa))的支气管感染和放大的炎症性应答，导致支气管扩张和渐进性阻塞性气道疾病的发展。肺部功能不全造成大多数的与cf相关的死亡。(cohen-cymberknoh,m等,am.j.respir.crit.caremed.1463-1471,2011)。
在过去的40年里cf治疗的预后已得到改善。这是通过改进胰酶补充剂、设计药物治疗肺部感染、减少炎症和增加粘液纤毛清除率来实现的。当前，治疗挑战是校正cf的生物化学缺陷并且鉴定用于慢性呼吸道感染的有效治疗。(frerichsc.等,expertopinpharmacother.10(7),1191-202,2009)。
概述
本发明涉及式i或ia的化合物和治疗cftr(囊性纤维化跨膜传导调节蛋白)介导的疾病(具体地囊性纤维化)的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的式i或ia的化合物或其药学上可接受的盐、酯或前药的步骤：
其中
每个n、m、p和q独立地选自0、1、2和3；
cy1选自杂芳基、取代的杂芳基、杂环基和取代的杂环基；
每个r1、r2、r3和r4选自氢、卤素、烷基、取代的烷基、杂烷基、取代的杂烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、脂肪族、取代的脂肪族、芳基和取代的芳基、-or100、-nr100r101、-c(o)r100、-c(o)or100、-c(o)nr100r101、-n(r100)c(o)r101、-s(o)2r100、-s(o)r100、-sr100、-s(o)2n(r100)r101、-cf3、-cn、-no2、-n3；另选地，两个r1和r2基团或两个r3和r4基团或r100和r101基团连同其所连接的原子与任何居间原子可一起形成另外任选取代的3、4、5、6或7元环；另选地，两个r3基团或两个r4基团可一起形成氧代基、乙烯基或取代的乙烯基；并且，
每个r100和r101选自氢、卤素、烷基、取代的烷基、杂烷基、取代的杂烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、脂肪族、取代的脂肪族、芳基和取代的芳基。
发明详述
本发明涉及式i或ia的化合物和治疗囊性纤维化的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的式i或ia的化合物或其药学上可接受的盐、酯或前药的步骤：
其中
每个n、m、p和q独立地选自0、1、2和3；
cy1选自杂芳基、取代的杂芳基、杂环基和取代的杂环基；
每个r1、r2、r3和r4选自氢、卤素、烷基、取代的烷基、杂烷基、取代的杂烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、脂肪族、取代的脂肪族、芳基和取代的芳基、-or100、-nr100r101、-c(o)r100、-c(o)or100、-c(o)nr100r101、-n(r100)c(o)r101、-s(o)2r100、-s(o)r100、-sr100、-s(o)2n(r100)r101、-cf3、-cn、-no2、-n3；另选地，两个r1和r2基团或两个r3和r4基团或r100和r101基团连同其所连接的原子与任何居间原子可一起形成另外任选取代的3、4、5、6或7元环；另选地，两个r1基团、两个r2基团、两个r3基团或两个r4基团可一起形成氧代基、乙烯基或取代的乙烯基；并且
每个r100和r101选自氢、卤素、烷基、取代的烷基、杂烷基、取代的杂烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、脂肪族、取代的脂肪族、芳基和取代的芳基。
在优选的实施方案中，本发明涉及式ii或iia的化合物和治疗囊性纤维化的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的式ii或iia的化合物或其药学上可接受的盐、酯或前药的步骤：
其中
每个n、m、p和q独立地选自0、1、2和3；
cy1选自杂芳基、取代的杂芳基、杂环基和取代的杂环基；
每个r1、r2和r3选自氢、卤素、烷基、取代的烷基、杂烷基、取代的杂烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、脂肪族、取代的脂肪族、芳基和取代的芳基、-or100、-nr100r101、-c(o)r100、-c(o)or100、-c(o)nr100r101、-n(r100)c(o)r101、-s(o)2r100、-s(o)r100、-sr100、-s(o)2n(r100)r101、-cf3、-cn、-no2、-n3；另选地，两个r1和r2基团或两个r3基团或r100和r101基团连同其所连接的原子与任何居间原子可一起形成另外任选取代的3、4、5、6或7元环；
每个r5和r6独立地选自氢、卤素、烷基、取代的烷基、杂烷基、取代的杂烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、脂肪族、取代的脂肪族、芳基和取代的芳基；另选地，r5和r6基团连同其所连接的原子与任何居间原子可一起形成另外任选取代的3、4、5、6或7元环；另选地，两个r1基团或两个r2基团可一起形成氧代基、乙烯基或取代的乙烯基；并且
每个r100和r101选自氢、卤素、烷基、取代的烷基、杂烷基、取代的杂烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、脂肪族、取代的脂肪族、芳基和取代的芳基。
在优选的实施方案中，本发明涉及式iii或iiia的化合物和治疗囊性纤维化的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的式iii或iiia的化合物或其药学上可接受的盐、酯或前药的步骤：
其中
每个n、m、p和q独立地选自0、1、2和3；
r为1、2或3；
cy1选自杂芳基、取代的杂芳基、杂环基和取代的杂环基；
cy2选自芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基和取代的杂环基、碳环基和取代的碳环基；
l1不存在或为连接子；优选为烷基或取代的烷基；
每个r1、r2和r3选自氢、卤素、烷基、取代的烷基、杂烷基、取代的杂烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、脂肪族、取代的脂肪族、芳基和取代的芳基、-or100、-nr100r101、-c(o)r100、-c(o)or100、-c(o)nr100r101、-n(r100)c(o)r101、-s(o)2r100、-s(o)r100、-sr100、-s(o)2n(r100)r101、-cf3、-cn、-no2、-n3；另选地，两个r1和r2基团或两个r3基团或r100和r101基团连同其所连接的原子与任何居间原子可一起形成另外任选取代的3、4、5、6或7元环；另选地，两个r1基团或两个r2基团可一起形成氧代基、乙烯基或取代的乙烯基；
r5选自氢、卤素、烷基、取代的烷基、杂烷基、取代的杂烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、脂肪族、取代的脂肪族、芳基和取代的芳基；
每个r100和r101选自氢、卤素、烷基、取代的烷基、杂烷基、取代的杂烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、脂肪族、取代的脂肪族、芳基和取代的芳基。
在优选的实施方案中，本发明涉及式iv或iva的化合物和治疗囊性纤维化的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的式iv或iva的化合物或其药学上可接受的盐、酯或前药的步骤：
其中
每个n、m、p和q独立地选自0、1、2和3；
r为1、2或3；
cy2选自芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基和取代的杂环基、碳环基和取代的碳环基；
l1不存在或为连接子；优选为烷基或取代的烷基；
每个r1、r2和r3选自氢、卤素、烷基、取代的烷基、杂烷基、取代的杂烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、脂肪族、取代的脂肪族、芳基和取代的芳基、-or100、-nr100r101、-c(o)r100、-c(o)or100、-c(o)nr100r101、-n(r100)c(o)r101、-s(o)2r100、-s(o)r100、-sr100、-s(o)2n(r100)r101、-cf3、-cn、-no2、-n3；另选地，两个r1和r2基团或两个r3基团或r100和r101基团连同其所连接的原子与任何居间原子可一起形成另外任选取代的3、4、5、6或7元环；另选地，两个r1基团或两个r2基团可一起形成氧代基、乙烯基或取代的乙烯基；
r5选自氢、卤素、烷基、取代的烷基、杂烷基、取代的杂烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、脂肪族、取代的脂肪族、芳基和取代的芳基；并且，
每个r100和r101选自氢、卤素、烷基、取代的烷基、杂烷基、取代的杂烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、脂肪族、取代的脂肪族、芳基和取代的芳基。
在优选的实施方案中，本发明涉及式v或va的化合物和治疗囊性纤维化的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的式v或va的化合物或其药学上可接受的盐、酯或前药的步骤：
其中
每个n、m、p和q独立地选自0、1、2和3；
r为1、2或3；
cy2选自芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂环基和取代的杂环基、碳环基和取代的碳环基；
l1不存在或为连接子；优选为烷基或取代的烷基；
每个r2和r3选自氢、卤素、烷基、取代的烷基、杂烷基、取代的杂烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、脂肪族、取代的脂肪族、芳基和取代的芳基、-or100、-nr100r101、-c(o)r100、-c(o)or100、-c(o)nr100r101、-n(r100)c(o)r101、-s(o)2r100、-s(o)r100、-sr100、-s(o)2n(r100)r101、-cf3、-cn、-no2、-n3；另选地，两个r2基团或两个r3基团或r100和r101基团连同其所连接的原子与任何居间原子可一起形成另外任选取代的3、4、5、6或7元环；另选地，两个r1基团或两个r2基团可一起形成氧代基、乙烯基或取代的乙烯基；
r5选自氢、卤素、烷基、取代的烷基、杂烷基、取代的杂烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、脂肪族、取代的脂肪族、芳基和取代的芳基；并且，
每个r100和r101选自氢、卤素、烷基、取代的烷基、杂烷基、取代的杂烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、脂肪族、取代的脂肪族、芳基和取代的芳基。
在优选的实施方案中，本发明涉及式vi或via的化合物和治疗囊性纤维化的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的式vi或via的化合物或其药学上可接受的盐、酯或前药的步骤：
其中
每个z、n、m、p和q独立地选自0、1、2和3；
cy3选自杂芳基、取代的杂芳基、杂环基和取代的杂环基、碳环基和取代的碳环基；
r1、r2、r3和r7各自选自氢、卤素、烷基、取代的烷基、杂烷基、取代的杂烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、脂肪族、取代的脂肪族、芳基和取代的芳基、-or100、-nr100r101、-c(o)r100、-c(o)or100、-c(o)nr100r101、-n(r100)c(o)r101、-s(o)2r100、-s(o)r100、-sr100、-s(o)2n(r100)r101、-cf3、-cn、-no2、-n3；另选地，两个r1和r2基团或两个r3，或两个r7基团或r100和r101基团连同其所连接的原子与任何居间原子可一起形成另外任选取代的3、4、5、6或7元环；另选地，两个r1基团或两个r2基团或两个r7基团可一起形成氧代基、乙烯基或取代的乙烯基；并且
每个r100和r101选自氢、卤素、烷基、取代的烷基、杂烷基、取代的杂烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、脂肪族、取代的脂肪族、芳基和取代的芳基；优选地r100为苯基或取代的苯基。
在优选的实施方案中，本发明涉及其中cy1选自以下的化合物：
其中每个x独立地为–c(r103)(r104)-、-n(r103)-、-s-或-o-；
其中每个r103和r104独立地选自不存在、氢、卤素、烷基、取代的烷基、杂烷基、取代的杂烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、脂肪族、取代的脂肪族、芳基和取代的芳基。
在优选的实施方案中，本发明涉及其中cy2选自以下的化合物：
其中t为1、2、3、4或5；
k为1、2、3、4或5；
每个x独立地为–c(r103)(r104)-、-n(r103)-、-s-或-o-；
其中每个r103和r104独立地选自不存在、氢、卤素、烷基、取代的烷基、杂烷基、取代的杂烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、脂肪族、取代的脂肪族、芳基和取代的芳基；
每个r105和r106独立地选自不存在、氢、卤素、烷基、取代的烷基、杂烷基、取代的杂烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、脂肪族、取代的脂肪族、芳基和取代的芳基；另选地，两个r105基团或两个r106基团可一起形成氧代基、乙烯基或取代的乙烯基。
在优选的实施方案中，l1选自：
其中
g为在约1与约1000之间，优选在1与100之间，优选在1与10之间的整数；
e和f独立地选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30；
d为1、2、3、5、6或7；
每个r10、r11、r12、r13、r14、r15和r16独立地选自不存在、氢、卤素、-or20、-sr20、-nr20r21、-c(o)r20、-c(o)or20、-c(o)nr20r21、-n(r20)c(o)r21、-cf3、-cn、-no2、-n3、酰基、任选取代的烷氧基、任选取代的烷氨基、任选取代的二烷氨基、任选取代的烷硫基、任选取代的烷基磺酰基、任选取代的脂肪族、任选取代的芳基或任选取代的杂环基；另选地，两个r10、r11、r12、r13、r14、r15和r16连同其所连接的原子一起形成任选取代的3、4、5、6或7元环；并且，
每个r20和r21选自氢、卤素、脂肪族、取代的脂肪族、芳基或取代的芳基。
在更优选的实施方案中，式i的化合物选自表a或其药学上可接受的盐。
表a：
缩写表：
所有温度为摄氏度
cf-囊性纤维化
cftr-囊性纤维化跨膜传导调节蛋白
dipea-n,n-二异丙基乙胺
dmf-二甲基甲酰胺
dmso-二甲亚砜
enac-上皮钠通道
et2o-乙醚
et3n-三乙胺
etoac-乙酸乙酯
h-小时
h2o-水
hatu-(1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1h-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶3-氧
化六氟磷酸盐)
hbs-hepes缓冲盐水
hcl-盐酸
hoac-乙酸
hplc-高压液相色谱
hr-小时
hts-高通量筛选
mdc-二氯甲烷
na2so4-硫酸钠
nah-氢化钠
nahco3-碳酸氢钠
nauc-曲线下的标准化区域
nh4cl-氯化铵
nmr-核磁共振
pbs-磷酸盐缓冲盐水
pocl3-三氯氧磷
rt-室温
tea-三乙胺
tfa-三氟乙酸
tetrakis-三苯基膦)钯(0)
thf-四氢呋喃
yfp-黄色荧光蛋白
本发明化合物可通过本领域中已知方法制备。下文示出用于制备本发明化合物的示例性合成路线:
方案i:
方案ii:
方案iii:
方案iv:
方案v:
本发明化合物可用作cftr的调节剂和治疗由cftr介导的疾病或病症,诸如用于治疗以下疾病、病症或病状：诸如囊性纤维化、便秘、哮喘、胰腺炎、胃肠病症、不孕症、遗传性肺气肿、遗传性血色素沉着、凝血-纤维蛋白溶解缺陷(c蛋白缺陷)、1型遗传性血管水肿、脂质加工缺陷(诸如家族性家族性高胆固醇血症)、1型乳糜微粒血症、无β脂蛋白血症、溶酶体贮存疾病(诸如i-细胞疾病/假性胡尔勒(hurler))、粘多糖贮积症、桑霍夫氏/泰-萨氏症(sandhof/tay-sachs)、ii型克里格勒-纳贾尔症(crigler-najjar)、多内分泌病/高胰岛素血症(hyperinsulemia)、糖尿病、拉伦(laron)侏儒症、髓过氧化物酶缺陷、原发性甲状旁腺机能减退(由前促甲状旁腺激素引起)、黑素瘤、1型聚糖病cdg、遗传性肺气肿、先天性甲状腺机能亢进、成骨不全、遗传性低纤维蛋白原血症、act缺陷、尿崩症(di)、神经原性di、肾原性di、夏-马-图三氏综合征(charcot-marietoothsyndrome)、佩-梅病(perlizaeus-merzbacherdisease)、神经变性疾病(诸如阿尔茨海默病、帕金森氏病、肌萎缩性侧索硬化症、进行性核上性麻痹、皮克氏病)、若干聚谷氨酰胺神经性病症(诸如亨廷顿病、i型脊髓小脑性共济失调、脊髓延髓肌肉萎缩症、齿状核红核苍白球路易体萎缩症(dentatorubalpallidoluysian)和肌强直性营养不良，以及海绵状脑病诸如遗传性克-雅病(hereditarycreutzfeldt-jakobdisease)(由朊病毒蛋白加工缺陷导致)、法布里氏病(fabrydisease)以及斯脱司勒-史茵克综合征(straussler-scheinkersyndrome)。
本发明化合物可与抗生素、抗炎药物、支气管扩张剂(bronchodialator)或、减薄粘粘液的药物组合施用。具体地，用于处理细菌粘液样假单胞菌的抗生素可与本发明化合物组合使用。吸入性抗生素诸如妥布霉素、粘菌素和氨曲南可与使用本发明化合物的治疗组合使用。抗炎药物也可与本发明化合物组合使用来治疗cftr相关疾病。支气管扩张剂可与本发明化合物组合使用来治疗cftr相关疾病。
在一个实施方案中，本发明涉及组合疗法，其包含本发明化合物和可用于治疗cf的其他药剂。在优选的实施方案中，可使用氨基糖苷庆大霉素。在优选的实施方案中，ataluren、依伐卡托(ivacaftor)(kalydeco)或vx-809可与本发明化合物组合使用。
在一个实施方案中，本发明涉及药物组合物，其包含本发明化合物和药学上可接受载体。组合物可包含本发明化合物和任选的药学上可接受的载体、佐剂或媒介物。在某些实施方案中，这些组合物任选还包含可用于治疗cftr介导的疾病或病症的一种或多种另外的治疗剂。
药物组合物
本发明药物组合物包含与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂一起配制的治疗有效量的本发明化合物。
如本文所使用的术语“药学上可接受的载体或赋形剂”是指无毒、惰性固体、半固体、凝胶或液体填料、稀释剂、封装材料或任何类型的配制助剂。可充当药学上可接受的载体的材料的一些实例是糖诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；环糊精诸如α-、β-和γ-环糊精；淀粉诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素和其衍生物诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；粉状黄芪胶；麦芽；明胶；滑石粉；赋形剂诸如椰子油和栓剂蜡；油诸如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和通过大豆油；二醇诸如丙二醇；酯诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂诸如氢氧化镁和氢氧化铝；褐藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇，和磷酸盐缓冲溶液，以及其他无毒相容润滑剂诸如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂、释放剂、涂层剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可根据配方设计师的判断而存在于组合物中。
本发明的药物组合物可通过口服、胃肠外、吸入喷雾、局部、直肠、鼻、口腔、阴道或通过植入式储积器方式施用。在优选的实施方案中，施用为通过注射进行的胃肠外施用。
本发明的药物组合物可含有任何常规无毒的药学上可接受的载体、佐剂或媒介物。在一些情况下，可用药学上可接受的酸、碱或缓冲液调节制剂的ph以增强所配制的化合物或其递送形式的稳定性。如本文所用的术语胃肠外包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内以及颅内注射或输注技术。
口服施用的液体剂型包括药学上可接受的乳液、微乳液、溶液、混悬液、糖浆和酏剂。除了活性化合物以外，液体剂型可含有在本领域中通常使用的惰性稀释剂，诸如例如水或其它溶剂、溶解剂和乳化剂诸如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、etoac、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(尤其棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和山梨醇酐的脂肪酸酯和其混合物。除了惰性稀释剂以外，口服组合物可还包含佐剂诸如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂和芳香剂。
可注射制剂，例如无菌可注射水性或油性混悬液可根据已知技术使用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂配制。无菌可注射制剂也可为在无毒胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射混悬液或乳液诸如
可注射制剂可例如通过滤过细菌滞留过滤器或通过并入灭菌剂来灭菌，呈在使用之前可溶解或分散于无菌水或其它无菌可注射介质中的无菌固体组合物形式。
直肠或阴道施用的组合物优选是可通过使本发明化合物与合适的非刺激性赋形剂或载体混合来制备的栓剂，所述赋形剂或载体诸如椰子油、聚乙二醇或在环境温度下是固体但是在体温下是液体并且因此在直肠或阴道腔中融化并释放活性化合物的栓剂蜡。
用于口服的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、粉剂和颗粒剂。在此类固体剂型中，活性化合物与至少一种惰性、药学上可接受的赋形剂或载体诸如柠檬酸钠或磷酸氢钙和/或以下物质混合：a)填充剂或增量剂诸如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；b)粘合剂诸如例如羧甲基纤维素、褐藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯树胶；c)保湿剂诸如甘油；d)崩解剂诸如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、褐藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；e)溶液延缓剂诸如烷烃；f)吸收加速剂诸如季铵化合物；g)润湿剂诸如例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；h)吸收剂诸如高岭土和膨润土，和i)润滑剂诸如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠及其混合物。在胶囊剂、片剂和丸剂的情况下，剂型还可包含缓冲剂。
在使用此类赋形剂如乳糖(lactose)或乳糖(milksugar)以及高分子量聚乙二醇等的软填充和硬填充的明胶胶囊剂中还可采用类似类型的固体组合物作为填充剂。
可用包衣和壳诸如药物配制领域中熟知的肠包衣和其它包衣制备片剂、糖衣丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂的固体剂型。它们可任选地含有乳浊剂并且还可具有使得其仅在或优先在肠道的某一部分，任选地以延迟方式释放活性成分的组成。可使用的包埋组合物的实例包括聚合物和蜡。
本发明化合物的局部或经皮施用的剂型包括：软膏剂、糊剂、霜剂、洗剂、凝胶剂、粉剂、溶液剂、喷雾剂、吸入剂或贴片剂。在无菌条件下，将活性组分与药学上可接受的载体以及任何所需的防腐剂或可能需要的缓冲剂加以混合。眼用制剂、滴耳剂、眼膏、粉剂和溶液剂也涵盖在本发明的范围内。
除本发明的活性组合物之外，所述软膏剂、糊剂、乳膏剂和凝胶剂可包含赋形剂，诸如动物和植物脂肪、油、蜡、石蜡、淀粉、黄芪胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、硅酸、滑石以及氧化锌、或其混合物。
除本发明组合物之外，粉末和喷雾剂可包含赋形剂诸如乳糖、滑石、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙以及聚酰胺粉末、或这些物质的混合物。另外，喷雾剂可含有定制的推进剂诸如氯氟烃。
经皮贴片剂具有能受控递送化合物至身体的附加优点。此种剂型可以通过将化合物溶解或分散于适当的介质中来制造。吸收促进剂也可以用于增加化合物穿过皮肤的通量。速率可以通过提供速率控制膜或通过将化合物分散于聚合物基质或凝胶中而得以控制。
对于肺部递送，本发明的治疗性组合物被配制为固体或液体微粒形式并且通过直接施用例如吸入到呼吸系统中来施用至患者。实践本发明所制备的活性化合物的固体或液体微粒形式包括可吸入大小的颗粒：即，小至在吸收后足以穿过口和喉并且进入细支气管和肺的肺泡中的粒度。雾化的治疗剂的递送在本领域中是已知的(参见例如，授予vandevanter等的美国专利号5,767,068、授予smith等的美国专利号5,508,269以及montgomery的wo98/43650)。
本文所述的组合物可以配制为单位剂型。术语“单位剂型”指合适作为对受试者进行治疗的单位剂量的物理离散单位，其中各单位含有经计算任选地与合适的药物载体结合产生所需治疗效果的预定量的活性材料。单位剂型可针对单一日剂量或多个日剂量中的一各(例如，约1至4次或更多次每天)。在使用多个日剂量时，针对各剂量，单位剂型可以是相同的或不同的。单位剂型中活性化合物的量将根据例如所治疗的宿主和具体施用方式变化。在一个实施方案中，单位剂型可具有作为活性成分的一种本发明化合物，其量为约10mg、20mg、30mg、40mg、50mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、750mg、800mg、900mg、1000mg或1,250mg。
在一些实施方案中，本发明化合物可以至少约10mg/天至至少约1500mg/天的剂量施用。在一些实施方案中，本发明化合物以至少约300mg(例如至少约450mg、至少约500mg、至少约750mg、至少约1,000mg、至少约1250mg或至少约1500mg)的剂量施用。
可针对患有轻度(child-pugha级)、中度或重度肝损伤的患者进行剂量调整。此外，可针对服用一种或多种细胞色素p450抑制剂和诱导剂，具体地cyp3a4、cyp2d6、cyp2c9、cyp2c19和cyp2b6抑制剂和诱导剂的患者进行剂量调整。还可针对患有受损的细胞色素p450功能的患者诸如慢代谢者、中间代谢者、快代谢者和超快代谢者进行剂量调整。
定义
下文列出了用于描述本发明的各种术语的定义。除非另外限定于具体的实例，否则无论单独的还是作为更大基团的一部分，这些定义适用于整个说明书中使用的术语。
术语“脂肪族基团”或“脂肪族”是指可为饱和的(例如单键)或可含有一个或多个不饱和单元(例如双键和/或三键)的非芳香族部分。脂肪族基可为直链的、分支的或环状的，包含碳、氢或任选地一个或多个杂原子，并且可为取代的或未取代的。除了脂肪族烃基外，脂肪族基包括例如多烷氧基烷基(诸如聚亚烷基二醇)、多胺以及聚亚胺。此类脂肪族基可被进一步取代。应理解脂肪族基可包括如本文所描述的烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基以及取代或未取代的环烷基。
术语“酰基”是指被氢、烷基、部分饱和或完全饱和的环烷基、部分饱和或完全饱和的杂环、芳基或杂芳基取代的羰基。例如，酰基包括诸如以下项的基团：(c1-c6)烷酰基(例如甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊酰基、己酰基、叔丁基乙酰基等)、(c3-c6)环烷基羰基(例如环丙基羰基、环丁基羰基、环戊基羰基、环己基羰基等)、杂环羰基(例如吡咯烷基羰基、吡咯烷-2-酮-5-羰基、哌啶基羰基、哌嗪基羰基、四氢呋喃基羰基等)、芳酰基(例如苯甲酰基)和杂芳酰基(例如噻吩基-2-羰基、噻吩基-3-羰基、呋喃基-2-羰基、、呋喃基-3-羰基、1h-吡咯基-2-羰基、1h-吡咯基-3-羰基、苯并[b]噻吩基-2-羰基等)。此外，酰基的烷基、环烷基、杂环、芳基和杂芳基部分可以是各自定义中描述的任何一个基团。当指明为“任选取代的”时，酰基可以是未取代的或被一个或多个独立地选自在下文“取代的”定义中所列的取代基(通常为1至3个取代基)所取代，或者酰基的烷基、环烷基、杂环、芳基和杂芳基部分可分别被上文在优选和更优选的取代基列表中所述的取代基所取代。
术语“烷基”旨在包括具有指定数的碳原子的支链和直链、取代或未取代的饱和脂肪族烃基/基团。优选的烷基具有约1至约24个碳原子(“c1-c24”)。其他优选的烷基具有约1至约8个碳原子(“c1-c8”)，诸如约1至约6个碳原子(“c1-c6”)，或诸如约1至约3个碳原子(“c1-c3”)。c1-c6烷基的实例包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、正戊基、新戊基和正己基。
术语“烯基”是指具有至少一个碳-碳双键的直链或支链基团。此类基团优选含有约2至约24个碳原子(“c2-c24”)。其他优选的烯基是具有2至约10个碳原子(“c2-c10”)的“低级烯基”，诸如乙烯基、烯丙基、丙烯基、丁烯基和4-甲基丁烯基。优选的低级烯基具有2至约6个碳原子(“c2-c6”)。术语“烯基”和“低级烯基”涵盖具有“顺式”和“反式”取向，或者“e”和“z”取向的基团。
术语“炔基”是指具有至少一个碳-碳三键的直链或支链基团。此类基团优选含有约2至约24个碳原子(“c2-c24”)。其他优选的炔基是具有2至约10个碳原子的“低级炔基”，诸如炔丙基、1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔、2-丁炔基和1-戊炔基。优选的低级炔基具有2至约6个碳原子(“c2-c6”)。
术语“环烷基”是指具有3至约12个碳原子(“c3-c12”)的饱和碳环基。术语“环烷基”涵盖具有3至约12个碳原子的饱和碳环基。此类基团的实例包括环丙基、环丁基、环戊基和环己基。
术语“环烯基”是指具有3至12个碳原子的部分未饱和的碳环基。为含有两个双键(其可以是或可以不是共轭的)的部分未饱和的碳环基的环烯基可以称为“环烷基二烯基”。更优选的环烯基是具有4至约8个碳原子的“低级环烯基”。此类基团的实例包括环丁烯基、环戊烯基和环己烯基。
如本文所用，术语“亚烷基”是指衍生自具有指定数的碳原子的直链或支链饱和烃链的二价基团。亚烷基的实例包括但不限于亚乙基、亚丙基、亚丁基、3-甲基-亚戊基和5-乙基-亚己基。
如本文所用，术语“亚烯基”代表衍生自含有指定数目的碳原子、具有至少一个碳-碳双键的直链或支链烃部分的二价基团。亚烯基包括但不限于例如亚乙烯基、2-亚丙烯基、2-亚丁烯基、1-甲基-2-丁烯-1-亚基等。
如本文所用，术语“亚炔基”指示衍生自含有指定数目的碳原子、具有至少一个碳-碳三键的直链或支链烃部分的二价基团。代表性亚炔基包括但不限于例如亚丙炔基、1-亚丁炔基、2-甲基-3-亚己炔基等。
术语“烷氧基”是指直链或支链的含氧基团，各自具有1至约24个碳原子或优选1至约12个碳原子的烷基部分。更优选的烷氧基是具有1至约10个碳原子并且更优选具有1至约8个碳原子的“低级烷氧基”。此类基团的实例包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基和叔丁氧基。
术语“烷氧基烷基”是指具有连接至烷基的一个或多个烷氧基，即以形成单烷氧基烷基和二烷氧基烷基的烷基。
单独的或组合中的术语“烷基”意指含有一个、两个或三个环的芳香族体系，其中这些环可被以侧悬的方式连接到一起或可为稠合的。术语“芳基”涵盖芳香族基诸如苯基、萘基、四氢萘基、二氢化茚、呋喃基、喹唑啉基、吡啶基和联苯基。
术语“杂环基”、“杂环(heterocycle)”、“杂环的”或“杂环(heterocyclo)”是指饱和的、部分不饱和的以及不饱和的含杂原子的环形基团，其也可相应地称为“杂环基”、“杂环烯基”和“杂芳基”，其中杂原子可选自氮、硫和氧。饱和的杂环基的实例包括含有1至4个氮原子的饱和的3至6元杂单环基(例如吡咯烷基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基等)；含有1至2个氧原子和1至3个氮原子的饱和的3至6元杂单环基(例如吗啉基等)；含有1至2个硫原子和1至3个氮原子的饱和的3至6元杂单环基团(例如噻唑烷基等)。部分不饱和的杂环基的实例包括二氢噻吩、二氢吡喃、二氢呋喃和二氢噻唑。杂环基可包含五价氮，诸如在四唑鎓和吡啶鎓基中。术语“杂环”还涵盖杂环基与芳基或环烷基稠合的基团。此类稠合的二环基的实例包括苯并呋喃、苯并噻吩等。
术语“杂芳基”是指不饱和的芳香族杂环基。杂芳基的实例包括含有1至4个氮原子的不饱和的3至6元杂环基，例如吡咯基、吡咯啉基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、三唑基(例如4h-1,2,4-三唑基、1h-1,2,3-三唑基、2h-1,2,3-三唑基等)、四唑基(1h-四唑基、2h-四唑基等)等；含有1至5个氮原子的不饱和的稠合的杂环基，例如吲哚基、异吲哚基、吲哚嗪基、苯并咪唑基、喹啉基、异喹啉基、吲唑基、苯并三唑基、四唑并哒嗪基(例如四唑并[1,5-b]哒嗪基等)等；含有氧原子的不饱和的3至6元杂环基，例如吡喃基、呋喃基等；含有硫原子的不饱和的3至6元杂环基，例如噻吩基等；含有1至2个氧原子和1至3个氮原子的不饱和的3至6元杂环基，例如噁唑基、异噁唑基、噁二唑基(例如1,2,4-噁二唑基、1,3,4-噁二唑基、1,2,5-噁二唑基等)等；含有1至2个氧原子和1至3个氮原子的不饱和的稠合的杂环基(例如苯并噁唑基、苯并噁二唑基等)；含有1至2个硫原子和1至3个氮原子的不饱和的3至6元杂环基，例如噻唑基、噻二唑基(例如1,2,4-噻二唑基、1,3,4-噻二唑基、1,2,5-噻二唑基等)等；含有1至2个硫原子和1至3个氮原子的不饱和的稠合的杂环基(例如苯并噻唑基、苯并噻二唑基等)等。
术语“杂环烷基”是指杂环取代的烷基。更优选的杂环烷基是在杂环基中具有1至6个碳原子的“低级杂环烷基”。
术语“烷硫基”是指含有与二价硫原子连接的1至约10个碳原子的直链或支链烷基的基团。优选的烷硫基具有1至约24个碳原子或优选地1至约12个碳原子的烷基。更优选的烷硫基具有为具有1至约10个碳原子的“低级烷硫基”的烷基。最优选的是具有1至约8个碳原子的低级烷基的烷硫基。此类低级烷硫基的实例包括甲硫基、乙硫基、丙硫基、丁硫基和己硫基。
术语“芳烷基”或“芳基烷基”是指芳基取代的烷基诸如苄基、二苯甲基、三苯甲基、苯乙基和二苯乙基。
术语“芳氧基”是指通过氧原子连接至其他基团的芳基。
术语“芳烷氧基”或“芳基烷氧基”是指通过氧原子连接至其他基团的芳烷基。
术语“氨基烷基”是指被氨基取代的烷基。优选的氨基烷基具有含有约1至约24个碳原子或优选地1至约12个碳原子的烷基。更优选的氨基烷基是具有1至约10个碳原子的“低级氨基烷基”。最优选的是具有含有1至8个碳原子的低级烷基的氨基烷基。此类基团的实例包括氨基甲基、氨基乙基等。
术语“烷基氨基”代表被一个或两个烷基取代的氨基。优选的烷基氨基具有含有约1至约20个碳原子或优选地1至约12个碳原子的烷基。更优选的烷基氨基是具有1至约10个碳原子的“低级烷基氨基”。最优选的是具有含有1至约8个碳原子的低级烷基的烷基氨基。合适的低级烷基氨基可以为单取代的n-烷基氨基或二取代的n,n-烷基氨基，诸如n-甲基氨基、n-乙基氨基、n,n-二甲基氨基、n,n-二乙基氨基等。
术语“取代的”指将在给定结构中的一个或多个氢基替换为指定的取代基，其包括但不限于：卤素、烷基、烯基、炔基、芳基、杂环基、硫醇、烷硫基、芳硫基、烷硫基烷基、芳硫基烷基、烷基磺酰基、烷基磺酰烷基、芳基磺酰烷基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、氨基羰基、烷基氨基羰基、芳基氨基羰基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、卤代烷基、氨基、三氟甲基、氰基、硝基、烷基氨基、芳基氨基、烷基氨基烷基、芳基氨基、氨基烷基氨基、羟基、烷氧基烷基、羧基烷基、烷氧基羰基烷基、氨基羰基烷基、酰基、芳烷氧基羰基、羧酸、磺酸、磺酰基、膦酸、芳基、杂芳基、杂环基以及脂肪族基。应理解，取代基可被进一步取代。
本发明包括所有药学上可接受的同位素增浓化合物。化合物包含一个或多个原子，所述一个或多个原子被具有相同原子序数，但原子质量或质量数不同于通常在自然界中所见的原子质量或质量数的原子置换。
适合包含在本发明化合物中的同位素的实例包括以下原子的同位素：氢，诸如2h和3h；碳，诸如11c、13c和14c；氮，诸如13n和15n；氧，诸如15o、17o和18o；氯，诸如36cl；氟，诸如18f；碘，123i和125i；磷，诸如32p；以及硫，诸如35s。
为简单起见，从头至尾定义且称作的化学部分可为单价的化学部分(例如烷基、芳基等)或本领域技术人员清楚的在适当的构造环境下的多价部分。例如，“烷基”部分可被称为单价基团(例如ch3-ch2-)，或在其他情况下，二价连接部分可为“烷基”，在所述情况下本领域技术人员将理解烷基是二价基团(例如，-ch2-ch2-)，其等同与术语“亚烷基”。类似地，在其中二价部分被要求且陈述为“烷氧基”、“烷基氨基”、“芳氧基”、“烷硫基”、“芳基”、“杂芳基”、“杂环基”、“烷基”、“烯基”、“炔基”、“脂肪族基”、或“环烷基”的情况下，本领域的技术人员将理解术语“烷氧基”、“烷基氨基”、“芳氧基”、“烷硫基”、“芳基”、“杂芳基”、“杂环基”、“烷基”、“烯基”、“炔基”、“脂肪族基”、或“环烷基”是指对应的二价部分。
如本文所用，术语“卤素”或“卤代”是指选自氟、氯、溴和碘的原子。
如本文所用，术语“化合物”、“药”和“前药”全部包括具有如本文所阐述的式的化合物、药和前药的药学上可接受的盐、共晶体、溶剂化物、水合物、多晶型物、对映异构体、非对映异构体、外消旋体等等。
指明为通过不同连接点连接的取代基可连接至环结构上的任何可利用的位置。
如本文所用，关于主题治疗方法的术语“主题化合物的有效量”是指当用作所需剂量方案的一部分时，根据临床上可接受的标准产生对疾病或病症的控制的主题化合物的量。
“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是指用于在患者中获得有益的或所期望的临床结果的方法。对于本发明的目的而言，有益的或所期望的临床结果包括但不限于以下项中的一种或多种：减轻症状、减弱疾病程度、稳定化疾病状态(即未恶化)、防止疾病传播(即转移)、防止疾病发生或复发性、延迟或减缓疾病进展、改善疾病状态以及以及缓解(无论部分或全部的)。
实施例
6-氯吡啶-3-磺酰氯：
在0℃下经60min将亚硫酰氯(60ml，823mmol)添加至水(360ml)，使得温度维持在0℃与7℃之间。在15℃下将混合物搅拌17h之后，添加cucl(0.218g，1.9mmol)并且使所得溶液冷却至0℃。在单独的烧瓶中，使6-氯代-3-氨基吡啶(25g，195mmol)的浓hcl(195ml)溶液冷却至-5℃并且用亚硝酸钠(14.4g，208mmol)于水(58ml)中的溶液逐滴处理，同时将温度维持在-5℃与0℃之间。当添加完成时，在0℃下将该溶液添加至预先冷却的亚硫酰氯的水溶液并且搅拌1h。通过过滤收集固体，用水洗涤且干燥，得到6-氯吡啶-3-磺酰氯(26.0g)；1hnmr(dmso)δ：7.48-7.50(d,j＝9.2hz,1h),7.96-7.98(m,1h),8.55-8.56(d,j＝3.2hz,1h)。
6-氯代-n,n-二乙基吡啶-3-磺酰胺：
将6-氯吡啶-3-磺酰氯(3.0g，14mmol)添加至0℃的二乙胺(1.24g，16.9mmol)和三乙胺(5.23ml，42.3mmol)在dcm(20ml)中的溶液中。在rt下搅拌16h之后，用水(50ml)稀释反应物并用dcm(2x25ml)萃取。将合并的有机层用盐水(50ml)洗涤，用na2so4干燥并且进行浓缩，得到6-氯代-n,n-二乙基吡啶-3-磺酰胺(3.0g)；(esi+ve，249.1[m+h])；1hnmr(dmso)δ：1.05-1.08(t,6h),3.19-3.24(q,4h),7.77(dj＝8.4hz,1h),8.25-8.28(q,1h),8.83(d,j＝2.4hz1h)。
n,n-二乙基-6-肼基吡啶-3-磺酰胺：
将6-氯代-n,n-二乙基吡啶-3-磺酰胺(3.0g，12mmol)溶解在etoh(30ml)中，并且用水合肼(2.44g，48mmol)处理。将反应物加热至回流，持续16h，然后冷却至rt并且在真空中除去etoh。将固体用et2o研磨，得到n,n-二乙基-6-肼基吡啶-3-磺酰胺(2.7g)；(esi+ve，245.1[m+h])；1hnmr(dmso)δ：1.02-1.05(t,6h),3.07-3.12(q,4h),5.03(s,2h),6.77(d,j＝8hz,1h),7.70-7.73(q,1h),8.29(d,j＝2hz,1h),8.46(s,1h)。
n,n-二乙基-3-氧代基-2,3-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-磺酰胺：
将n,n-二乙基-6-肼基吡啶-3-磺酰胺(2.0g，8.18mmol)溶解在thf(20ml)中，用cdi(1.99g，1.22mmol)处理并且加热至回流，持续16h。将反应物用水(100ml)稀释，然后用etoac(2x200ml)萃取。将合并的有机物用水(2x200ml)洗涤，用na2so4干燥并且进行浓缩，得到n,n-二乙基-3-氧代基-2,3-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-磺酰胺(1.8g)；(esi+ve，249.11[m+h])；1hnmr(dmso)δ：1.23-1.25(t,6h),3.16-3.25(q,4h),7.30-7.36(m,2h),8.07-8.07(t,1h),12.79(s,1h)。
3-氯代-n,n-二乙基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-磺酰胺：
将n,n-乙基-3-氧代基-2,3-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-磺酰胺(0.20g，0.73mmol)和pocl3(6ml)加热至110℃，持续16h。使反应物冷却，倾倒在碎冰上并用饱和nahco3溶液中和。将混合物用etoac(2x15ml)萃取，并且将合并的有机物用盐水(10ml)洗涤，用na2so4干燥并且进行浓缩，得到3-氯代-n,n-二乙基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-磺酰胺(0.16g)；(esi+ve，289.14[m+h])；1hnmr(dmso)δ：1.09-1.12(t,6h),3.26-3.31(q,4h),7.66-7.68(q,1h),7.98-8.00(m,1h),8.57-8.58(m,1h)。
实施例1：3-(苄氨基)-n,n-二乙基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-磺酰胺:
将3-氯代-n,n-二乙基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-磺酰胺(0.15g，0.52mmol)和bnnh2(1ml)加热至140℃过夜。将反应物用水(20ml)稀释并且用etoac(2x15ml)萃取。将合并的有机层用盐水(10ml)洗涤，用na2so4干燥并且进行浓缩，得到3-(苄氨基)-n,n-二乙基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-磺酰胺(0.05g,27％)；(esi+ve，361.23[m+h])；1hnmr(dmso)δ：1.02-1.05(t,6h),3.15-3.20(q,4h),4.46-4.47(d,j＝62h),7.19-7.28(q,1h),7.30-7.35(m,4h),7.49-7.56(m,2h),7.70-7.73(t,1h),8.96(s,1h)。
使用适当的胺以类似于实施例1(方案1)的方式制备本发明的代表性化合物。
n-乙基吡啶-3-胺：
将3-氨基吡啶(2.0g，21.2mmol)、乙腈(4.36g，106mmol)和10％pd/c(0.2g)的meoh(20ml)溶液在25℃下在h2气氛下搅拌16h。将反应物经硅藻土过滤且浓缩滤液。将粗产物通过柱色谱法(硅胶，5-10％meoh/dcm)纯化，得到n-乙基吡啶-3-胺(0.7g)。
6-氯代-n-乙基-n-(吡啶-3-基)吡啶-3-磺酰胺：
将6-氯吡啶-3-磺酰氯(1.0g，4.7mmol)添加至0℃的n-乙基吡啶-3-胺(0.7g，5.66mmol)和三乙胺(1.95ml，14mmol)在dmc(30ml)中的溶液中。在rt下搅拌16h之后，用水(15ml)稀释反应物并用dcm(2x15ml)萃取。将合并的有机层用盐水(15ml)洗涤，用na2so4干燥并且进行浓缩，得到6-氯代-n-乙基-n-(吡啶-3-基)吡啶-3-磺酰胺(1.0g)。
n-乙基-6-肼基-n-(吡啶-3-基)吡啶-3-磺酰胺：
将6-氯代-n-乙基-n-(吡啶-3-基)吡啶-3-磺酰胺(0.3g，1.0mmol)溶解在etoh(5ml)中，并且用水合肼(0.2ml，4.0mmol)处理。将反应物加热至80℃，持续16h，然后冷却至rt并且在真空中除去etoh。将固体用et2o研磨，得到n-乙基-6-肼基-n-(吡啶-3-基)吡啶-3-磺酰胺(0.3g)。
(r)-2-(5-(n-乙基-n-(吡啶-3-基)氨磺酰基)吡啶-2-基)-n-(1-苯乙基)肼-1-硫代甲酰胺：
将n-乙基-6-肼基-n-(吡啶-3-基)吡啶-3-磺酰胺(0.3g，1.0mmol)溶解在thf(15ml)中，然后用三乙胺(0.35ml，2.55mmol)和(r)-(1-异硫氰基乙基)苯(0.250g，1.53mmol)处理。在rt下搅拌16h之后，用水(40ml)稀释反应物并用dcm(2x40ml)萃取。将合并的有机层用na2so4干燥并进行浓缩。将粗产物通过色谱法(硅胶，5-10％meoh/dcm)纯化，得到(r)-2-(5-(n-乙基-n-(吡啶-3-基)氨磺酰基)吡啶-2-基)-n-(1-苯乙基)肼-1-硫代甲酰胺(0.34g)。
实施例58：(r)-n-乙基-3-((1-苯乙基)氨基)-n-(吡啶-3-基)-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-磺酰胺：
将(r)-2-(5-(n-乙基-n-(吡啶-3-基)氨磺酰基)吡啶-2-基)-n-(1-苯乙基)肼-1-硫代甲酰胺(0.34g，0.74mmol)溶解在thf(5ml)中，并且用三乙胺(0.24ml，1.78mmol)和2-氯代-1-甲基碘化吡啶(0.22g，0.89mmol)处理。在rt下搅拌30min之后，用水(40ml)稀释反应物并在etoac(2x40ml)中萃取。将合并的有机层用na2so4干燥并进行浓缩。将粗产物通过色谱法(硅胶，5-10％meoh/dcm)纯化，得到(r)-n-乙基-3-((1-苯乙基)氨基)-n-(吡啶-3-基)-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-磺酰胺(0.035g，11％)；ms：esi+ve422.95[m+h]；1hnmr：(400mhz,dmso-d6)δ：0.99(t,3h),1.5(d,j＝6,3h),3.69(q,2h),4.9(t,1h),6.9(dd,j＝9和1,1h),7.2(t,1h),7.3(t,2h),7.4(m,3h),7.5(d,j＝8,1h),7.5(d,j＝7,1h),7.6(d,j＝8,1h),8.4(d,j＝2,1h),8.5(dd,j＝4和1,1h),8.8(s,1h)。
6-溴代-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-3(2h)-酮
在rt下将在thf(20ml)中的5-溴代-2-肼基吡啶(2.00g，10.6mmol)用cdi(2.59g，15.9mmol)处理，然后在回流下搅拌过夜。将反应物用水(50ml)稀释并且在etoac(2x50ml)中萃取。将合并的有机层用盐水(50ml)洗涤，用na2so4干燥并且进行浓缩，得到6-溴代-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-3(2h)-酮(1.50g，67％)；esi+ve213.85[m+1]。
6-溴代-3-氯代-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶
将在pocl3(15ml)中的6-溴代-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-3(2h)-酮(1.50g，7.0mmol)加热至110℃过夜。使反应物冷却，倾倒在碎冰上并用饱和nahco3(250ml)中和。将混合物用etoac(2x100ml)萃取，并且将合并的有机物用盐水(50ml)洗涤，用na2so4干燥并且进行浓缩，得到6-溴代-3-氯代-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶(1.11g，68％)；esi+ve234.10[m+1]。
n-苄基-6-溴代-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-3-胺
在140℃下将在苄胺(5ml)中的6-溴代-3-氯代-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶(1.11g，4.79mmol)加热过夜。将反应物用水(100ml)稀释并且用etoac(2x50ml)萃取。将合并的有机层用盐水(50ml)洗涤，用na2so4干燥并进行浓缩。将粗材料进行色谱分离(20-25％etoac/己烷)，得到n-苄基-6-溴代-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-3-胺(0.43g，29％)；esi+ve303.17[m+1]。
n3-苄基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-3,6-二胺
在rt下将在dmso(2ml)中的n-苄基-6-溴代-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-3-胺(0.10g，0.33mmol)用k2co3(0.038g，0.49mmol)、l-脯氨酸(0.015g，0.13mmol)和cui(0.012g，0.07mmol)处理并且搅拌15min。将nh4oh(25％)(0.03ml，0.49mmol)添加至反应混合物，并在90℃下加热。将反应物用水(50ml)稀释并且用etoac(2x25ml)萃取。将合并的有机层用盐水(50ml)洗涤，用na2so4干燥并且进行浓缩，得到n3-苄基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-3,6-二胺(0.06g，77％)；esi+ve240.30[m+1]。
实施例59：n-(3-(苄氨基)-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)-4-甲氧基苯磺酰胺
在0℃下将在吡啶(2ml)中的n3-苄基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-3,6-二胺(0.20g，0.84mmol)用4-甲氧基-苯磺酰氯(0.17g，0.84mmol)处理，然后在rt下搅拌过夜。将反应物用水(100ml)稀释并且用etoac(2x100ml)萃取。将合并的有机层用盐水(50ml)洗涤，用na2so4干燥并进行浓缩。将粗产物进行色谱分离(35-40％etoac/己烷)，得到n-(3-(苄氨基)-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基)-4-甲氧基苯磺酰胺(0.02g，6％)；esi+ve410.29[m+1]；1hnmr：(400mhz,dmso-d6)δ：3.80(s,3h),4.40-4.42(d,j＝5.6hz,2h),7.05-7.10(t,3h),7.21-7.22(d,j＝6.4hz,2h),7.27-7.34(m,5h),7.62-7.64(d,j＝8.4hz,2h),8.15(s,1h),10.0(s,1h)。
2-氯吡啶-4-磺酰氯
在0℃下将4-氨基-2-氯吡啶(1.29g，10mmol)、tfa(10ml)和浓hcl(5ml)用在水(7.5ml)中的nano2(2.07g，30mmol)处理，然后在0℃下搅拌1h。将溶液在-5℃下过滤并且在0℃下添加至cucl(0.10g，0.7mmol)、cucl2(0.67g，3.9mmol)的含溶解的so2的hoac(60ml)溶液(通过在rt下使so2气体鼓泡通过hoac2h所制备的)。在0℃下将反应混合物搅拌1.5h并且用dcm(50ml)稀释。将反应物用冰水(2x50ml)、饱和nahco3(2x50ml)和盐水(50ml)洗涤。将有机层用na2so4干燥并且进行浓缩，得到2-氯吡啶-4-磺酰氯(1.05g，49％)；1hnmr：(400mhz,dmso-d6)δ：7.82-7.84(m,1h),7.93(s,1h),8.78-8.80(m,1h)。
2-氯代-n,n-二乙基吡啶-4-磺酰胺
将在dcm(10ml)中的二乙胺(0.51ml，4.90mmol)和tea(2.06ml，14.8mmol)在0℃下搅拌30min。在0℃下，添加2-氯吡啶-4-磺酰氯(1.05g，4.90mmol)，并在rt下将反应物搅拌过夜。将反应物用水(50ml)稀释并且用dmc(2x25ml)萃取。将合并的有机层用盐水(50ml)洗涤，用na2so4干燥并进行浓缩。将粗产物通过色谱法(15-20％etoac/己烷)纯化，得到2-氯代-n,n-二乙基吡啶-4-磺酰胺(0.70g，57％)；esi+ve249.15[m+1]。
n,n-二乙基-2-肼基吡啶-4-磺酰胺
在0℃下将在etoh(5ml)中的2-氯代-n,n-二乙基吡啶-4-磺酰胺(0.70g，2.8mmol)用肼(0.70g，14mmol)处理，然后回流过夜。将反应物冷却至rt。蒸馏etoh并且将固体用et2o研磨，得到n,n-二乙基-2-肼基吡啶-4-磺酰胺(0.32g，46％)；esi+ve245.25[m+1]。
n,n-二乙基-3-氧代基-2,3-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-7-磺酰胺
在rt下将在thf(5ml)中的n,n-二乙基-2-肼基吡啶-4-磺酰胺(0.32g，1.3mmol)用cdi(0.318g，1.9mmol)处理，然后在回流下搅拌过夜。将反应物用水(50ml)稀释并且在etoac(2x50ml)中萃取。将合并的有机层用盐水(50ml)洗涤，用na2so4干燥并进行浓缩。将粗产物通过色谱法(40-45％etoac/己烷)纯化，得到n,n-二乙基-3-氧代基-2,3-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-7-磺酰胺(0.125g,35％)；esi+ve271.26[m+1]。
3-氯代-n,n-二乙基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-7-磺酰胺
将在pocl3(1ml)中的n,n-二乙基-3-氧代基-2,3-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-7-磺酰胺(0.125g，0.40mmol)加热至100℃过夜。使反应物冷却，倾倒在碎冰上并用饱和nahco3中和。将混合物用etoac(2x15ml)萃取，并且将合并的有机物用盐水(50ml)洗涤，用na2so4干燥并且进行浓缩，得到3-氯代-n,n-二乙基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-7-磺酰胺(0.04g,30％)；esi+ve288.76[m+1]。
实施例60：n,n-二乙基-3-(新戊基氨基)-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-7-磺酰胺
在120℃下将在新戊基胺(1ml)中的3-氯代-n,n-二乙基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-7-磺酰胺(0.10g，0.30mmol)加热过夜。将反应物冷却，用水(50ml)稀释并且用etoac(2x25ml)萃取。将有机物用盐水(50ml)洗涤，用na2so4干燥并且进行浓缩，得到n,n-二乙基-3-(新戊基氨基)-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-7-磺酰胺(0.009g，8％)；esi+ve340.43[m+1]；1hnmr：(400mhz,dmso-d6)δ：0.92(s,9h),1.05-1.09(t,j＝7.2hz,6h)3.11-3.12(d,j＝6.4hz,2h),3.219-3.26(q,j＝7hz,4h),6.97-7.02(m,1h),7.13-7.15(m,1h),7.71(s,1h),8.75-8.77(d,j＝6.8hz,1h)。
6-氯代-2-甲基吡啶-3-磺酰氯
经1h将亚硫酰氯(4ml，29.6mmol)添加至水(24ml)，同时将温度维持为0-7℃，然后在15℃下将溶液搅拌过夜。添加cucl(0.010g，0.07mmol)并将其冷却至-3℃。在另一烧瓶中，在-5℃下将3-氨基-6-氯代-2-甲基吡啶(1.00g，7.01mmol)在浓hcl(6.0ml)中的溶液逐滴添加至亚硝酸钠(0.50g，7.5mmol)在水(2ml)中的溶液，同时将温度维持为-5℃至0℃。当添加完成时，然后将该溶液添加至预冷的亚硫酰氯溶液并且在-2℃下搅拌10min，然后在0℃下搅拌75min。将固体过滤，用水洗涤且干燥，得到6-氯代-2-甲基吡啶-3-磺酰氯(0.80g，51％)；1hnmr：(400mhz,dmso-d6)δ：2.67(s,3h),7.28-7.30(dd,j＝0.4,8.0hz,1h),8.00-8.02(dj＝8.0,1h)。
6-氯代-n,n-二乙基-2-甲基吡啶-3-磺酰胺
将在dmc(10ml)中的二乙胺(0.31g，4.24mmol)和tea(1.47ml，10.6mmol)冷却至0℃并且用6-氯代-2-甲基吡啶-3-磺酰氯(0.80g，3.53mmol)分批处理并且在rt下搅拌过夜。将反应物用水(50ml)稀释并且用dmc(2x25ml)萃取。将合并的有机层用盐水(50ml)洗涤，用na2so4干燥并且进行浓缩，得到6-氯代-n,n-二乙基-2-甲基吡啶-3-磺酰胺(0.90g，98％)；esi+ve，263.31[m+h]。
n,n-二乙基-6-肼基-2-甲基吡啶-3-磺酰胺
将在etoh(10ml)中的6-氯代-n,n-二乙基-2-甲基吡啶-3-磺酰胺(0.9g，3.80mmol)用肼(0.76g，15.2mmol)处理并且加热至回流过夜。在冷却后，蒸馏乙醇并且将所得固体用et2o研磨，得到n,n-二乙基-6-肼基-2-甲基吡啶-3-磺酰胺(0.8g，91％)；esi+ve，259.36[m+h]。
n,n-二乙基-5-甲基-3-氧代基-2,3-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-磺酰胺
将在thf(10ml)中的n,n-二乙基-6-肼基-2-甲基吡啶-3-磺酰胺(0.8g，3.10mmol)用cdi(0.75g4.65mmol)处理并且回流过夜。将反应物用水(100ml)稀释并且用etoac(200ml)萃取。将有机物用水(2x100ml)洗涤，用na2so4干燥并进行浓缩。将粗产物通过柱色谱法(0-10％meoh/dcm)纯化，得到n,n-二乙基-5-甲基-3-氧代基-2,3-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-磺酰胺(0.70g，79％)；esi+ve，285.32[m+h]。
3-氯代-n,n-二乙基-5-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-磺酰胺
将在pocl3(7ml)中的n,n-二乙基-5-甲基-3-氧代基-2,3-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-磺酰胺(0.7g)加热至110℃过夜。使反应物冷却，倾倒在碎冰上并用饱和nahco3(250ml)中和。将混合物用etoac(2x20ml)萃取，并且将合并的有机物用盐水(50ml)洗涤，用na2so4干燥并且进行浓缩。将粗产物通过柱色谱法(0-2％meoh/dcm)纯化，得到3-氯代-n,n-二乙基-5-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-磺酰胺(0.3g，40％)；esi+ve，303.32[m+h]。
实施例61：3-(苄氨基)-n,n-二乙基-5-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-磺酰胺
在140℃下将在苄胺(1ml)中的3-氯代-n,n-二乙基-5-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-磺酰胺(0.3g，0.99mmol)加热过夜。将反应混合物冷却，用水(20ml)稀释并用etoac(2x15ml)萃取。将有机物用盐水(10ml)洗涤，用na2so4干燥并进行浓缩。将粗产物通过柱色谱法(35-40％etoac/己烷)纯化，得到3-(苄氨基)-n,n-二乙基-5-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-磺酰胺(0.075g,37％)；esi+ve,374.93[m+h]；1hnmr：(400mhz,dmso-d6)δ：1.04-1.07(t,6h),2.90(s,3h),3.21-3.26(q,4h),4.49-4.51(d,j＝6.4,2h),7.20-7.29(m,3h),7.36-7.39(m,3h),7.59-7.62(t,1h),7.76-7.78(d,j＝9.2,1h)。
2-氯代-5-(苯硫基)吡啶
在rt下将naome溶液(0.37m，在meoh中)(40ml，15mmol)用2-氯代-5-碘代吡啶(3.0g，12.5mmol)、苯硫酚(1.65g，15mmol)和铜(0.318g，5.0mmol)处理，然后加热至回流过夜。在冷却至rt后，将反应物用1nnaoh(50ml)稀释，蒸馏meoh并且将水层用etoac(2x100ml)萃取。将有机物用盐水(50ml)洗涤，用na2so4干燥并且进行浓缩，得到2-氯代-5-(苯硫基)吡啶(4.2g)；esi+ve222.1[m+1]。
2-氯代-5-(苯磺酰基)吡啶
将在dcm(50ml)中的2-氯代-5-(苯硫基)吡啶(4.0g，18.1mmol)用在dcm(50ml)中的mcpba(50％)(13.0g，45.3mmol)处理并且在0-10℃下搅拌1h。将沉淀物过滤，并将滤液用dcm稀释，用1nnaoh(2x25ml)和盐水(50ml)洗涤，用na2so4干燥并且进行浓缩，得到2-氯代-5-(苯磺酰基)吡啶(2.3g，50％)；1hnmr：(400mhz,dmso)δ：7.00-7.02(m,2h),7.63-7.65(m,2h),7.99-8.00(d,j＝7.6,2h),8.40-8.42(m,1h),9.02-9.03(s,1h)。
2-肼基-5-(苯磺酰基)吡啶
在0℃下将在etoh(40ml)中的2-氯代-5-(苯磺酰基)吡啶(2.3g，9.09mmol)用肼(99％)(1.81g，36.4mmol)处理，然后加热至回流过夜。在冷却至rt后，将反应物浓缩并且将残余物用et2o研磨，得到2-肼基-5-(苯磺酰基)吡啶(1.2g，53％)；esi+ve250.1[m+1]。
6-(苯磺酰基)-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-3(2h)-酮
在rt下将在二氯乙烷(15ml)中的2-肼基-5-(苯磺酰基)吡啶(0.5g，2.0mmol)用cdi(0.49g，3.0mmol)处理，然后加热至回流过夜。浓缩反应物并且将残余物用水(50ml)处理。将沉淀物过滤并干燥，得到6-(苯磺酰基)-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-3(2h)-酮(0.40g，72％)；esi+ve276.1[m+1]。
3-氯代-6-(苯磺酰基)-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶
在110℃下将在pocl3(4ml)中的6-(苯磺酰基)-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-3(2h)-酮(0.40g，1.45mmol)加热过夜。冷却至rt后，将反应物倾倒在冰上，用饱和nahco3中和，并且用etoac(2x25ml)萃取。将有机物用盐水洗涤，用na2so4干燥并且进行浓缩，得到3-氯代-6-(苯磺酰基)-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶(0.140g,32mmol)；esi+ve294.0[m+1]。
实施例62：(r)-n-(1-苯乙基)-6-(苯磺酰基)-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-3-胺
在140℃下将在(r)-1-苯乙基-1-胺(0.2ml)中的3-氯代-6-(苯磺酰基)-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶(0.13g，0.44mmol)加热过夜。将反应物冷却，用水(50ml)稀释并且用etoac(2x30ml)萃取。将有机物用盐水(25ml)洗涤，用na2so4干燥并进行浓缩。将粗产物进行色谱分离(25％etoac/己烷)，得到(r)-n-(1-苯乙基)-6-(苯磺酰基)-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-3-胺(0.075g，44％)；esi+ve379.1[m+1]；1hnmr：(400mhz,dmso-d6)δ：1.45-1.46(d,j＝6.8,3h),4.87-4.91(m,1h),7.16-7.20(t,1h),7.27-7.30(t,2h),7.38-7.40(d,j＝7.6,2h),7.46-7.49(dd,j＝9.2,1h),7.60-7.63(t,2h),7.67-7.72(m,2h),7.75-7.77(dd,j＝2,9.2,1h),8.03-8.05(m,1h),9.25(s,1h)。
使用适当的胺以类似于实施例62的方式制备本发明的代表性化合物。
2-氯代-5-(苯硫基)吡啶：在25℃下将na金属(8.06g，350mmol)添加至甲醇的搅拌溶液(700ml)。一旦na金属溶解，添加2-氯代-5-碘代吡啶(70.0g，292.34mmol)、苯硫酚(38.64g，350.7mmol)和铜(7.42g，116.758mmol)并且将混合物在80℃下加热16h。将反应物冷却至25℃，添加1nnaoh(500ml)并且蒸发甲醇。将反应混合物用水(500ml)稀释，并且将产物在乙酸乙酯(2x500ml)中萃取。将有机层用盐水(500ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥并蒸馏出，获得为液体的粗2-氯代-5-(苯硫基)吡啶(80.0g，(221.90[m+1]))，将其用于下一步而无需纯化。
2-氯代-5-(苯磺酰基)吡啶：在0-10℃下将60％mcpba(260.0g，904.9mmol)在mdc(500ml)中的溶液逐滴添加至2-氯代-5-(苯硫基)吡啶(80.0g，361.9mmol)在mdc(500ml)中的搅拌溶液。在25℃下将反应物搅拌2h。将沉淀物过滤掉，并且将滤液用1nnaoh(500ml*2)和盐水(500ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥并蒸馏出。将粗产物通过柱色谱法(在己烷中的20％乙酸乙酯)纯化，获得2-氯代-5-(苯磺酰基)吡啶(65g)。
5-(苯磺酰基)吡啶-2-胺：在100℃下将2-氯代-5-(苯磺酰基)吡啶(65.0g，256.9mmol)在氨水(650ml)中的溶液在高压釜中搅拌16h。将反应混合物冷却至25℃并且用水(1000ml)稀释。将固体过滤并且在真空下干燥，获得5-(苯磺酰基)吡啶-2-胺(52.0g,235[m+1])。1hnmr：(400mhz,dmso)δ：6.476-6.498(d,j＝8.8,1h),7.108(s,2h),7.576-7.616(m,2h),7.636-7.675(m,1h),7.754-7.783(m,1h),7.887-7.909(m,2h),8.430-8.436(d,j＝2.4,1h)。
乙基1-(甲酰胺)-3-(5-(苯磺酰基)吡啶-2-yl)硫脲：在25℃下在氮气气氛下将乙氧羰基异硫氰酸酯(29.12g，222.0mmol)添加至5-(苯磺酰基)吡啶-2-胺(52.0g，222.0mmol)在二噁烷(500ml)中的搅拌溶液并且将所得反应混合物在25℃下搅拌16h。将溶剂蒸馏出，添加水(1000ml)，并且将混合物搅拌1h。将固体过滤并且在真空下干燥，获得硫脲衍生物(74.0g,365.9[m+1])。
6-(苯磺酰基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-胺：在25℃下将dipea(112.29ml，608mmol)逐滴添加至盐酸羟胺(70.44g，1013mmol)在甲醇(600ml)和乙醇(600ml)中的搅拌溶液。接下来，在25℃下一次性添加硫脲衍生物(74.0g，202.7mmol)，并且将反应物在25℃下搅拌2h，然后在60℃下搅拌16h。将溶剂蒸馏出，将反应物料用水(1000ml)稀释，并且将所得混合物搅拌1h。将固体过滤并且在真空下干燥，获得6-(苯磺酰基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-胺(52.0g,274.9[m+])。1hnmr：(400mhz,dmso)δ：6.539(s,2h),7.460-7.484(d,j＝9.6,1h),7.619-7.656(t,2h),7.693-7.729(m,1h),7.757-7.785(d,j＝9.21h),8.043-8.067(d,j＝8.8,2h),9.250-9.253(d,j＝1.2,1h)。
2-氯代-6-(苯磺酰基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶：在25℃下将氯化铜(ii)二水合物(8.39g，49.24mmol)添加至6-(苯磺酰基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-胺(52.0g，189.4mmol)在浓hcl(625ml)中的搅拌溶液。将反应混合物冷却至0-5℃并且在0-5℃下经30min逐滴添加在水(293ml)中的亚硝酸钠(15.68g，227.0mmol)，并且将反应物在25℃下搅拌16h。将反应物料用水(3000ml)稀释并且搅拌1h。将固体过滤并且在真空下进行干燥以得到粗产物，将所述粗产物通过柱色谱法(在mdc中的2％甲醇)纯化，获得2-氯代-6-(苯磺酰基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶(44.0g)1hnmr：(400mhz,dmso)δ：7.638-7.686(m,2h),7.726-7.769(m,1h),7.967-8.006(m,1h),8.092-8.125(m,3h),9.741(s,1h)。
实施例80：n-(2,3-二氢-1h-茚-2-基)-6-(苯磺酰基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-胺：在140℃下将2-氯代-6-(苯磺酰基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶(0.15g，0.51mmol)在2,3-二氢-1h-茚-2-胺(0.15ml)中的搅拌溶液加热16h。将反应混合物冷却，用甲醇稀释并过滤。将粗固体产物通过柱色谱法(在己烷中的30％乙酸乙酯)纯化，获得n-(2,3-二氢-1h-茚-2-基)-6-(苯磺酰基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-胺(0.140g，391.4[m+1]。1hnmr：(400mhz,dmso)(13525)δ：2.906-2.962(m,2h),3.248-3.306(m,2h),4.431-4.483(m,1h),7.137-7.169(m,2h),7.204-7.234(m,2h),7.460-7.476(d,6.4hz,1h),7.517-7.540(d,9.2hz,1h),7.626-7.663(m,2h),7.697-7.737(m,1h),7.794-7.822(m,1h),8.064-8.085(m,2h),9.347-9.350(d,1.2hz,1h)。
由2-氯代-6-(苯磺酰基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶和适当的胺以类似于实施例80的方式制备本发明的代表性化合物。
(n-(4-溴苄基)-6-(苯磺酰基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-胺：在140℃下将2-氯代-6-(苯磺酰基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶(40.0g，136.1mmol)在(4-溴苯基)甲胺(40g，214.9mmol)中的搅拌溶液加热16h。将反应混合物冷却，用甲醇稀释并搅拌1h。将固体过滤并且在真空下干燥，获得(n-(4-溴苄基)-6-(苯磺酰基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-胺(38.0g，444.9[m+1])1hnmr：(400mhz,dmso)δ：4.437-4.453(d,j＝6.4,2h),7.286-7.307(d,j＝8.4,2h),7.482-7.520(m,3h),7.611-7.649(t,2h),7.688-7.738(q,2h),7.783-7.811(d,j＝9.2,1h),8.042-8.063(d,j＝8.4,2h),9.287-9.290(d,j＝1.2,1h)。
实施例94：6-(苯磺酰基)-n-(4-(吡啶-2-基)苄基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-胺：将氧化铜(ii)(1.68g)添加至n-(4-溴苄基)-6-(苯磺酰基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-胺(42.0g，94.74mmol)(420ml)和2-(三丁基甲锡烷基)吡啶(48.8g，132.6mmol)在dmf中的搅拌溶液并且将溶液用氩气脱气30min。添加tetrakis(10.92g，9.47mmol)并且将反应物在100℃下搅拌16h。将反应混合物冷却并且通过硅藻土过滤，并且用乙酸乙酯(2x500ml)洗涤。将滤液用水(2x500ml)洗涤，用盐水(500ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥，并且将溶剂蒸馏出以获得粗产物，所述粗产物通过柱色谱法(mdc中的40％乙酸乙酯)纯化，获得6-(苯磺酰基)-n-(4-(吡啶-2-基)苄基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-胺(14.3g，442[m+1])。1hnmr：(400mhz,dmso)δ：4.537-4.553(d,j＝6.4,2h),7.345-7.347(m,1h),7.441-7.462(d,j＝8.4,2h),7.505-7.506(d,j＝0.4,1h),7.607-7.645(t,2h),7.684-7.702(t,1h),7.752-7.791(q,2h),7.858-7.862(d,j＝1.6,1h),8.014-8.034(d,j＝8,1h),8.044-8.056(m,4h),8.636-8.650(m,1h),9.306-9.311(t,1h)。
由n-(4-溴苄基)-6-(苯磺酰基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-胺和适当的甲锡烷基试剂以类似于实施例94的方式制备本发明的代表性化合物。
2-(4-溴苯基)吡啶：在25℃下将k2co3(6.91g)添加至2-溴吡啶(5.0g，31.64mmol)在thf:h2o(50:25ml)中的搅拌溶液。将反应混合物用氩气脱气30分钟。然后添加tetrakis(462mg)并且将反应物再次用氩气脱气15分钟。添加(4-溴苯基)硼酸(7.62g，37.97mmol)并将反应物用氩气脱气15分钟，并且在80℃下加热24h。将反应混合物冷却至25℃。将反应混合物用水(500ml)稀释且在etoac(250mlx2)中萃取。将有机层用盐水(20ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥并且蒸馏出以得到粗产物，所述粗产物通过快速色谱法纯化，获得为淡黄色液体的纯2-(4-溴苯基)吡啶(4.1g，234.1[m+h])1hnmr：(400mhz,cdcl3)(31678)δ：7.50-7.55(m,1h),7.57-7.61(m,2h),7.68-7.78(m,2h),7.80-7.90(m,2h),8.70-8.71(m,1h)。
实施例97：6-(苯磺酰基)-n-(4-(吡啶-2-基)苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-胺：制备6-(苯磺酰基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-胺(300mg，1.09mmol)、2-(4-溴苯基)吡啶(304mg，1.31mmol)、davephos(68mg，0.17mmol)和cs2co3(708mg，2.18mmol)在无水1,4二噁烷(15ml)中的溶液。将反应物在氮气和真空下脱气10分钟。添加pd(oac)2(39mg，0.17mmol)并且然后将反应混合物加热至90℃，持续16h。将反应混合物冷却，用水(50ml)稀释并用etoac(50mlx2)萃取。将有机层用盐水(30ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥，并且蒸干以获得粗产物，所述粗产物通过快速色谱法(甲醇中的0-5％mdc)纯化，获得纯的6-(苯磺酰基)-n-(4-(吡啶-2-基)苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-胺(10mg，428.09[m+h])。1hnmr：(400mhz,dmso)(3716)δ：7.27-7.30(m,1h),7.66-7.68(m,2h),7.71-7.75(m,3h),7.81-7.86(m,2h),7.91-7.95(m,2h),8.06-8.12(m,4h),8.62-8.63(d,1h),9.545-9.548(d,j＝1.2hz,1h),10.197(s,1h)。
由6-(苯磺酰基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-胺和适当的芳基溴以类似于实施例97的方式制备本发明的代表性化合物。
5-苯基吡啶-2-胺：在25℃下将苯基硼酸(1.26g10.40mmol)和na2co3(2.45g，23.14mmol)添加至5-溴吡啶-2-胺(2.0g，11.55mmol)在二噁烷:h2o(20:4ml)中的搅拌溶液。将反应混合物用氩气脱气30分钟。添加tetrakis(668.5mg，0.578mmol)。将反应混合物在80℃下加热16h。然后将反应混合物冷却，用水(50ml)稀释并且在etoac(150mlx2)中萃取将有机层用盐水(20ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥并且蒸馏出以得到粗产物，所述粗产物通过快速色谱法纯化，获得纯的5-苯基吡啶-2-胺(1.8g)。1hnmr：(400mhz,dmso)(31196)δ：6.07(s,2h),6.51-6.53(m,2h),7.24-7.28(m,2h),7.38-7.42(m,2h),7.55-7.57(m,2h),7.62-7.71(m,1h),8.24-8.25(d,j＝2.0hz,1h)。
6-苯基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-胺：在25℃下将乙硫基羰基异硫氰酯(1.18ml，10.57mmol)逐滴添加至5-苯基吡啶-2-胺(1.8g，10.57mmol)在1,4-二噁烷(20.0ml)中的搅拌溶液。在25℃下将反应物搅拌16h。将所得混合物用水(200ml)稀释并且在etoac(100mlx2)中萃取。将有机层用盐水(20ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥并且蒸馏出，得到为淡黄色固体的硫脲衍生物(3.8g)，其不经纯化直接使用。将dipea(6.5ml，37.82mmol)逐滴添加至羟胺hcl(4.38g，63.04mmol)在meoh:etoh(20:20ml)中的溶液，然后添加硫脲衍生物(3.8g，12.60mmol)。将反应混合物在25℃下搅拌16h，然后进行浓缩。将粗产物用水(300ml)稀释并且在etoac(300mlx2)中萃取。将有机层用盐水(20ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥并且蒸馏出，得到为淡褐色固体的6-苯基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-胺(2.0g，211.24[m+h])。
实施例100：6-苯基-n-(4-(吡啶-2-基)苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-胺：制备6-苯基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-胺(500mg，2.13mmol)、2-(4-溴苯基)吡啶(538mg，2.56mmol)、davephos(142mg，0.36mmol)和cs2co3(1.39g，4.27mmol)在无水1,4二噁烷(15ml)中的搅拌溶液。将反应物用氮气和真空脱气10分钟。添加pd(oac)2(81.4g，0.36mmol)并且将反应混合物在90℃下加热16h。将粗反应物冷却至25℃，用水(200ml)稀释并且在etoac(50mlx2)中萃取。将有机层用盐水(20ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥，并且蒸馏出以获得粗产物，所述粗产物通过快速色谱法纯化，获得纯的6-苯基-n-(4-(吡啶-2-基)苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-胺(29mg，363.42[m+h])。1hnmr：(400mhz,dmso)(32904)δ：7.26-7.29(m,1h),7.42-7.44(m,1h),7.51-7.53(m,1h),7.68-7.70(m,1h),7.81-7.86(m,5h),7.91-7.93(m,1h),7.95-7.98(m,1h),8.06-8.08(m,2h),8.62-8.63(m,1h),9.20-9.22(m,1h),9.94(s,1h)。
6-氯吡啶-3-磺酰氯：在0℃下经60min将亚硫酰氯(60ml，822.9mmol)添加至水(361ml)，同时将温度维持在0℃至7℃之间。在15℃下将溶液搅拌16h。接下来，添加cu(i)cl(0.218g，1.94mmol)并且将反应物冷却至-3℃。在单独的烧瓶中，将6-氯吡啶-3-胺(25.0g,194.5mmol)在浓hcl(195ml)中的搅拌溶液冷却至-5℃并且经45min逐滴添加亚硝酸钠(14.4g，208.1mmol)在水(58ml)中的溶液，同时将温度维持在-5℃至0℃之间。将所得浆液冷却至-2℃，搅拌10min并且随后经95分钟添加至第一烧瓶，同时将温度维持在-3℃至0℃之间。一旦添加完成，就将反应混合物在0℃下搅拌75min。将所得固体沉淀物过滤，用水洗涤且真空干燥，获得6-氯吡啶-3-磺酰氯(26.0g)。1hnmr：(400mhz,dmso)(35756)δ：7.484-7.507(dd,j＝1.6,8.41h),7.956-7.983(dd,j＝2.4,8.41h),8.551-8.559(dd,j＝0.8,2.41h)。
2-氯代-5-(哌啶-1-基磺酰基)吡啶：将tea(19.84ml，141.4mmol)添加至哌啶(5.3ml，51.8mmol)在二氯甲烷(80ml)中的搅拌溶液并且在25℃下将溶液搅拌30min。在0℃下添加6-氯吡啶-3-磺酰氯(10g，47.1mmol)在二氯甲烷(50ml)中的溶液并且在25℃下将混合物搅拌1h。将反应混合物用水(500ml)稀释并且在二氯甲烷(250mlx2)中萃取。将有机层用盐水(250ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥并且进行蒸发，得到2-氯代-5-(哌啶-1-基磺酰基)吡啶(12g)。
5-(哌啶-1-基磺酰基)吡啶-2-胺：制备2-氯代-5-(哌啶-1-基磺酰基)吡啶(3.7g，14.19mmol)在氨水(40ml)中的搅拌溶液，并且将所述搅拌溶液在100℃下加热72h。将反应混合物冷却至25℃，用水(100ml)稀释并且在etoac(150mlx2)中萃取。将有机层用盐水(100ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥并且蒸馏出，得到5-(哌啶-1-基磺酰基)吡啶-2-胺(3.0g)。1hnmr：(400mhz,dmso)(6742)δ：1.366-1.394(m,2h),1.513-1.554(m,4h),2.814-2.841(m,4h),6.508-6.531(d,9.2hz,1h),6.964(s,2h),7.586-7.614(m,1h),8.184(s,1h)。
在25℃下在氮气气氛下将乙氧羰基异硫氰酸酯(isothiocynate)(1.5ml，12.43mmol添加至5-(哌啶-1-基磺酰基)吡啶-2-胺(3.0g，12.43mmol)在二噁烷(30ml)中的搅拌溶液并且将所得反应混合物在25℃下搅拌16h。将溶剂蒸发出以获得粗产物，将所述粗产物通过柱色谱法(在己烷中的20％乙酸乙酯)纯化，获得为灰白色固体的硫脲衍生物(3.8g)。
6-(哌啶-1-基磺酰氯)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-胺：在25℃下将dipea(5.23ml，30.60mmol)逐滴添加至盐酸羟胺(3.54g，51.01mmol)在甲醇(20ml)和乙醇(20ml)中的搅拌溶液。然后在25℃下一次性添加硫脲衍生物(3.8g，10.20mmol)，并且将所得反应混合物在25℃下搅拌2h，然后在60℃下搅拌16h。将溶剂蒸馏出，并且将粗反应物料用水(100ml)稀释并且搅拌10分钟。将所得固体过滤，获得6-(哌啶-1-基磺酰氯)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-胺(2.6g，281.79[m+])。1hnmr：(400mhz,dmso)(7947)δ：1.378-1.389(m,2h),1.551(s,4h),2.959-2.985(m,4h),6.475(s,2h),7.494-7.517(d,9.2hz,1h),7.608-7.635(m,1h),8.931(s,1h)。
2-氯代-6-(哌啶-1-基磺酰基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶：在25℃下将氯化铜(ii)脱水物(0.032g，0.18mmol)添加至6-(哌啶-1-基磺酰氯)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-胺(0.2g，0.71mmol)在hcl(4ml)中的搅拌溶液。将所得反应混合物冷却至5℃并且添加硝酸钠(0.059g，0.85mmol)在水(2ml)中的溶液将所得反应混合物在5℃下搅拌30分钟，然后在25℃下搅拌16h。将粗反应物料用水(100ml)稀释并且搅拌10分钟。将所得固体过滤，获得2-氯代-6-(哌啶-1-基磺酰基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶(0.15g，301.3[m+1])。1hnmr：(400mhz,dmso)(9016)δ：1.377-1.391(d,5.6hz,2h),1.529-1.584(m,4h),3.018-3.045(t,5.6hz,4h),7.937-7.965(m,1h),8.008-8.034(m,1h),9.443-9.449(m,1h)。
实施例101：n-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基甲基)-6-(哌啶-1-基磺酰基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-胺：在140℃下将2-氯代-6-(哌啶-1-基磺酰基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶(0.1g，0.33mmol)在苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基甲胺(0.1ml)中的搅拌溶液加热16h。将反应混合物冷却，用水(50ml)稀释并且在二氯甲烷(25mlx2)中萃取。将有机层用盐水(20ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥，并且蒸馏出以获得粗产物，所述粗产物通过制备hplc纯化，获得为灰白色固体的纯的n-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基甲基)-6-(哌啶-1-基磺酰基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-胺(60mg，415.75[m+h])。1hnmr：(400mhz,dmso)(15874)δ：1.37-1.38(m,2h),1.53-1.54(m,4h),2.95-2.97(m,4h),4.38-4.39(d,j＝6.4hz,2h),5.96(s,2h),6.81-6.86(m,2h),6.92(s,1h),7.52-7.58(m,2h),7.62-7.65(m,1h),8.97-8.98(d,j＝1.2hz,1h)。
由2-氯代-6-(哌啶-1-基磺酰基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶和适当的胺以类似于实施例101的方式制备本发明的代表性化合物。
用检测和测定化合物对df508-cftr通道的影响的测定
cfrt-yfp高通量测定：
纠正剂测定：
下述方案被设计来在htsyfp流量测定中针对f508delcftr纠正剂活性选择性筛选小分子化合物。在这个方案中，将细胞与测试化合物一起孵育24小时，用pbs洗涤，用佛司可林(forskolin)和标准增强剂刺激，并且在384孔hts读取器(诸如hamamatsufddd-6000)上读取。
在向测定细胞注射碘化物缓冲液之前和之后高速获取yfp荧光强度。碘化物通过质膜中的活性cftr通道进入细胞，并且使yfp荧光淬灭。荧光淬灭的速率与细胞膜的总cftr活性成正相关。df508-cftr纠正剂通过增加测试细胞质膜中的cftr分子数加速yfp淬灭。
这种方法最迟被开发用于台式板读取器(galietta,2001)，并且适于hts形式(sui,2010)。
将稳定表达人δf508-cftr和卤化物敏感性黄色荧光蛋白(yfp-h148q/i152l25,22)(galietta,2001)的fisher大鼠甲状腺(frt)细胞在补充有fbs10％、l-谷氨酰胺2mm、青霉素100u/ml和链霉素100μg/ml的coon’s改良ham’sf12培养基中的塑料表面上培养。使用g418(0.75-1.0mg/ml)和博来霉素(3.2μg/ml)用于选择表达δf508-cftr和yfp的frt细胞。对于初级筛选，将frt细胞以20,000-40,000个/孔的细胞密度接种到384孔黑壁、透明底部微量滴定板(costar；corninginc.)中。以不同的浓度以2倍或3倍的稀释系列将测试化合物施加至细胞，所述浓度在2nm-40nm的范围内。将细胞在细胞培养箱中在37℃和5％co2下孵育24-26h。用dpbs培养基(thermo,目录号sh30028.02)洗涤测定板以去除未结合的细胞和化合物。将含有于hamsf-12coon’s改良培养基中的20μm佛司可林和30μmp3[6-(乙基-苯基-磺酰基)-4-氧代基-1,4-二氢-喹啉-3-羧酸2-甲氧基-苄基酰胺]的刺激培养基(25μl)添加至板孔并且在室温下孵育60-120min。然后添加25μlhepes-pbs-i缓冲液(10mmhepes，1mmmgcl2，3mmkcl，1mmcacl2，150mmnai)并且立即在fdss-6000板读取器(hamamatsu)上记录荧光淬灭曲线(500nm激发/540nm发射；曝光136ms)。淬灭速率衍生自数据的最小平方拟合(sui,2010)。
增强剂测定：
下述方案被设计来在htsyfp流量测定中针对f508delcftr增强剂活性选择性筛选小分子化合物。在这个方案中，将细胞在通过低温均匀增强细胞膜中df508-cftr表达的情况下在27℃下孵育24小时，用pbs洗涤，用佛司可林刺激，并且在384孔hts板读取器(诸如hamamatsufddd-6000)上读取。
在向测定细胞注射碘化物缓冲液之前和之后高速获取yfp荧光强度。碘化物通过质膜中的活性cftr通道进入细胞，并且使yfp荧光淬灭。荧光淬灭的速率与细胞膜的总cftr活性成正相关。df508del-cftr增强剂通过增加测试细胞质膜中的cftr活性加速yfp淬灭。
这种方法最迟被开发用于台式板读取器(galietta,2001)，并且适于hts形式(sui,2010)。
将稳定表达人δf508-cftr和卤化物敏感性黄色荧光蛋白(yfp-h148q/i152l25,22)(galietta,2001)的fisher大鼠甲状腺(frt)细胞在补充有fbs10％、l-谷氨酰胺2mm、青霉素100u/ml和链霉素100μg/ml的coon’s改良ham’sf12培养基中的塑料表面上培养。使用g418(0.75-1.0mg/ml)和博来霉素(3.2μg/ml)用于选择表达δf508-cftr和yfp的frt细胞。对于初级筛选，将frt细胞以20，000-40，000个/孔的细胞密度接种到384孔黑壁、透明底部微量滴定板(costar；corninginc.)中。将细胞在细胞培养箱中在37℃和5％co2下孵育24-26h。用dpbs培养基(thermo，目录号sh30028.02)洗涤测定板以去除未结合的细胞。以不同的浓度以在dpbs中的2倍或3倍的稀释系列将测试化合物施加至细胞，所述浓度在2nm-40nm的范围内，并且用在hamsf-12coon’s改良培养基中的20μm佛司可林(最终浓度)刺激。将板在室温下孵育60-120min。然后添加25μlhepes-pbs-i缓冲液(10mmhepes，1mmmgcl2，3mmkcl，1mmcacl2，150mmnai)并且立即在fdss-6000板读取器(hamamatsu)上记录荧光淬灭曲线(500nm激发/540nm发射；曝光136ms)。淬灭速率衍生自数据的最小平方拟合(sui，2010)。
参考文献：
galietta，l.v.，jayaraman，s.，andverkman，a.s.cell-basedassayforhigh-throughputquantitativescreeningofcftrchloridetransportagonists.am.j.physiol.cellphysiol.281(5)，c173442，2001.
suij.，cotards.，andersenj.，zhup.，stauntonj.，leem.，lins.(2010)optimizationofayellowfluorescentprotein-basediodideinfluxhigh-throughputscreeningassayforcysticfibrosistransmembraneconductanceregulator(cftr)modulators.assaydrugdev.
technol.2010dec；8(6)：656-68.
细胞培养：
原生cf气道上皮细胞从unc囊性纤维化组织采购和细胞培养中心(cysticfibrosistissueprocurementandcellculturecore)获得。使用生长培养基(begm，fischer)使细胞在37℃下在150i培养箱中生长。将细胞转移至分化培养基(ali，unc)在涂布的costarsnapwells上维持至少4周。在进行尤斯(ussing)测定前两天，在与200μl分化培养基培养至少三十(30)分钟后吸取细胞顶表面上的粘液。在进行尤斯测定前一天，以溶解在dmso中的各种测试浓度将测试化合物添加至细胞基底外侧表面。将相同浓度的纠正剂添加至3或4个孔，从而得到n＝3或n＝4方案。
尤斯测定：
尤斯室和相关电压钳从physiologicinstruments,(sandiego,ca)获得。在37℃下进行尤斯测定。在顶室和基底外侧室中使用hepes缓冲的生理盐水(hb-ps)，在基底外侧溶液中加入葡萄糖。在室中平衡上皮细胞15分钟，同时在施加电压钳之前稳定并调节水浴温度和跨膜电压。
按照以下顺序添加化合物：
每10秒钟记录各个室的短路电流和电阻(通常>300ω-cm2)，并使用acquireandanalyze(physiologicinstruments)存储在pc上。
分析：
使用佛司可林应答的平均值和测试化合物cftr-172应答除以佛司可林应答的平均值和阳性对照引发的cftr-172来比较测试化合物的效力。将针对对所有化合物和浓度的均一化评分制表。
表i：cftr-yfp高通量测定；使用以下含义：
效力％被报道为归一化到阳性对照的emax。“+++”是指emax>80％，“++”是指范围在80％-40％，“+”是指范围在40％-10％。
ec50：“+++”是指ec50<1μm，“++”是指ec50范围在1-10μm之间，“+”是指ec50>10μm。
结合下列实施例将更好的理解本发明的化合物和方法，所述实施例旨在仅作为例证而不是对本发明范围的限制。对所公开的实施方案进行的各种变化和修改对于本领域技术人员是显而易见的，并且此类变化和修改，包括但是不局限于涉及本发明化学结构、取代基、衍生物、制剂和/或方法的变化和修改，在不脱离本发明精神和所附权利要求书范围的情况下是可以进行的。
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