包含一种或多种群体表位基共序列抗原的HIV疫苗的制作方法

相关申请的交叉引用本申请要求于2014年10月3日提交的美国临时专利申请序列no.62/059,497和2014年10月3日提交的美国临时专利申请序列no.62/059,506的优先权，其中的每一个通过引用将其全部内容并入本发明。对通过电子方式提交的序列表的引用与本申请一起提交的ascii文本文件(名称：3525.010pc02seqlisting_st25.txt；大小：3,634,253字节；以及创建日期：2015年10月5日)中的通过电子方式提交的序列表的内容其整体通过引用并入本文。本主题总体上涉及艾滋病毒(hiv)，尤其涉及hiv疫苗。
背景技术：
：2013年，新发的人类免疫缺陷病毒(hiv)感染者约有230万，超过3500万hiv感染者，以及160万人获得性免疫缺陷综合征(aids)死亡。尽管hiv/aids治疗已取得了很大进展，但所有hiv感染者在其余生中必须接受抗逆转录病毒治疗法(art)治疗，因为药物治疗无法清除以约1/106细胞的频率存在于静息的cd4+t细胞中的潜伏病毒库。参见eriksson,s.2013.plospathog9:e1003174。清除潜伏hiv库的主要策略通常目的在于使用组蛋白-脱乙酰酶(hdac)抑制剂重新激活潜伏病毒，然而对hdac抑制剂的临床研究并没有持续减少潜伏的库。对于这一点，一个可能的原因在于hiv特异性cd8+t细胞无法消除静息的cd4+t细胞。只有少数病例已经被记录，其中hiv1已经从患有预先存在的感染的个体中清除。直到形成有效治疗法，估计有3500万hiv感染者将保持依赖于抗病毒药物，以抑制已经抵制一切消除努力的病毒库。aids的治疗方法是难以捉摸的，但最近的工作表明，严格的免疫控制随着时间的推移能够清除hiv。具体而言，发现以基于巨细胞病毒(cmv)的表达猿猴免疫缺陷病毒(siv)抗原的载体接种的恒河猴(rm)最初被感染，但siv在感染后一至两年内不能通过几种严格的标准检测到。鉴于这些研究中使用的高毒性sivmac239菌株阻止了以前的所有疫苗尝试这一事实，这一结果甚至更加显著。这些结果将目前的范例从专注于预防性hiv疫苗的情形扩大到使得对hiv/aids的免疫治疗最终将成为治疗这一流行病的重要组成部分的情形。因此，除了预防性疫苗之外，仍然需要有效的治疗法来治疗hiv-1感染者。具体而言，仍然需要设计、制造和测试预防和治疗性hiv疫苗，以准备临床测试。技术实现要素：本文提供了包含一种或多种epigraph抗原序列的hiv/siv多肽，该epigraph抗原序列包含对应于hiv/sivgag、nef、pol、env、或其任何组合的氨基酸序列，其包括全长序列、其部分。本文还提供了包含一种或多种群体表位基共序列抗原序列(populationepisensusantigensequences)的hiv/siv多肽，所述群体表位基共序列抗原序列包含对应于hiv/sivgag、nef、pol、env或其组合的氨基酸序列。本文还提供了包含hiv/siv多肽的一种或多种运载体(carrier)，所述hiv/siv多肽包含一种或多种群体表位基共序列抗原序列。本文还提供了包含一种或多种定制抗原序列的hiv/siv多肽，所述定制抗原序列包含对应于hiv/sivgag、nef、pol、env或其组合的氨基酸序列。本公开的hiv/siv多肽可以包含一种或多种hiv-1定制抗原，其中所述多肽包含选自seqidno：692-696和seqidno：754-789中的氨基酸序列。本文还提供了一种或多种运载体，其包含包含一个或多个定制抗原序列的hiv/siv多肽。在本文中提供了具有seqidno：691-789的epigraph抗原序列。本文提供了包含一种或多种运载体和一种或多种群体表位基共序列抗原的hiv-1疫苗。本文还提供了包含能够表达群体表位基共序列抗原和一种或多种定制抗原的载体的hiv-1疫苗。在一些实施方案中，hiv-1群体表位基共序列抗原包含来自gag、pol、nef、env、tat、rev、vpr、vif或vpu的表位。在一些实施方案中，hiv-1群体表位基共序列抗原是包含两种或更多种hiv-1群体表位基共序列抗原的融合抗原。在一些实施方案中，hiv-1群体表位基共序列抗原是美国hiv-1b进化枝流行病的核心。在一些实施方案中，hiv-1群体表位基共序列抗原是南非hiv-1c进化枝流行病的核心。在一些实施方案中，hiv-1群体表位基共序列抗原是泰国hiv-12进化枝区域流行病的核心。在一些实施方案中，hiv-1群体表位基共序列抗原是hiv-1m组全球集合的核心。在一些实施方案中，hiv-1群体表位基共序列抗原包含来自gag的表位。在一些实施方案中，hiv-1群体表位基共序列抗原包含来自hiv-1的保守区的表位。在一些实施方案中，hiv-1群体表位基共序列抗原包含来自gag、pol或nef的保守区的表位。在一些实施方案中，来自gag的保守区的表位是来自gag的p24衣壳蛋白的表位。在一些实施方案中，hiv-1定制抗原包含来自gag、pol、nef、env、tat、rev、vpr、vif或vpu的表位。在一些实施方案中，hiv-1定制抗原是hiv-1m组全球集合的核心。在一些实施方案中，hiv-1定制抗原是南非hiv-1c进化枝流行病的核心。在一些实施方案中，hiv-1定制抗原是美国hiv-1b进化枝流行病的核心。还提供了预防或治疗感染hiv-1的受试者的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的所描述的hiv-1疫苗。还提供了设计和生产用于受试者的hiv-1疫苗的方法，所述方法包括对个体中的hiv-1病毒测序，选择被设计为最佳地覆盖地理区域内的多样性的疫苗抗原，以及将疫苗抗原插入载体中。本文还提供了治疗感染hiv-1的受试者的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的所公开的疫苗。本文还提供了包含一种或多种运载体和使用epigraph方法测定的群体表位基共序列抗原的hiv-1疫苗。本文还提供了使用使用抗原氨基酸序列选择的epigraph方法产生的疫苗抗原氨基酸序列来设计疫苗抗原以最佳地覆盖地理区域内的多样性并生产所设计的所述疫苗抗原的方法。本文还提供了设计和产生用于受试者的hiv-1疫苗的方法，所述方法包括通过测序确定个体中的hiv-1病毒的氨基酸序列，选择被设计使用使用抗原氨基酸序列选择的epigraph方法产生的疫苗抗原氨基酸序列最佳地覆盖地理区域内的多样性的疫苗抗原，并将疫苗抗原插入载体中。本文还提供了诱导效应子记忆t细胞应答的方法，其包括确定一种或多种epigraph氨基酸序列，产生包含一种或多种epigraph抗原氨基酸序列和一种或多种运载体的疫苗，并将疫苗施用于有需要的受试者。还提供了治疗感染hiv-1的受试者的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的所描述的hiv-1疫苗。本文还提供了保护受试者不被hiv-1感染的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的所描述的hiv-1疫苗。附图说明图1a显示了nef蛋白的crf01-ae进化枝的全图。矩形是图1b所示的插图。图1b表示图1a的插图。节点是灰色点，并且表示每个k聚体变体，其中k＝9。边缘是连接表位的水平线，表位的序列重叠k-1个氨基酸，如在上左针对前两个表位(ea＝vtssnmnna[seqidno:790],eb＝tssnmnnad[seqidno:791])所示的。尽管图形的拓扑特性不依赖于节点位置，但该图形使用竖直轴来指示对于每个节点的在目标序列集内的表位频率，y＝f(e)。水平位置x(e)＝1+maxe’∈ρ(e)x(e’)(其中ρ(e)是e的前趋集)给出了该图所有有向边缘从左到右连接的属性。通过该图的理想路径尽可能地保持最大的y值。插图显示通过节点的两条路径。实黑线是最优路径，并对应于序列tssnmnnadsvwlraqeee[seqidno:792]，而虚线对应于tssnmnnadcvwlraqeee[seqidno:793]。虚线在4个节点上实现较高的f(e)值，但实线对于5个节点具有较高的f(e)，并且σf(e)较高。注意，对于x的所有值，没有包含最高值节点的路径。图2示出了显示表位k-字符串的表位图的节点，以及使得在对齐序列集中在该位置观察到表位的频率(f)，以及在该节点中结束的一致路径的累积最佳得分s。节点排列成列，每列对应于与表位相关联的位置t。连接这些节点的线对应于一致的相邻表位。目的是通过该图找到一致的路径，使每个节点中频率值的总和最大化。粗线显示一条导致最佳总分的路径。图3示出了如图2所示的初始解(由q1＝archslm[seqidno：794]给出)的节点具有被设置为零的频率值，并且基于这些新的频率节点重新计算累积得分s(t；e)。这导致了这个补充覆盖问题的最佳解决方案：q2＝defgklm[seqidno：795]。粗线表示一条导致最佳总分的路径。图4a-b显示了与690个美国b进化枝gag蛋白质序列[seqidno.1-690]的集合相关联的表位图，每个对齐556个位置，水平轴是位置t，并且节点列表示每个位置的不同表位。节点被配置成在每个位置最频繁的位于每列的底部。全图如图4a所示；图4b中显示了相同图形的特写插图。图5a-c显示，排除稀有变体减少覆盖率，但对于gag(图5a)、nef(图5b)和pol(图5c)仅稍微减少。多价(m＝2)解决方案的覆盖率显示为最小计数fo(即，疫苗中最稀有表位的群体频率)的函数。虚线对应于直接序列算法给出的覆盖率；黑色实线是基于100次随机重新启动后的最佳解决方案。在所有三幅图中，竖直轴被限制在0.015的范围内。图6a-b显示双抗原疫苗覆盖率。比较说明在美国分离的当代b进化枝序列的每个序列的平均表位覆盖率，其被认为是治疗性疫苗的假想目标群体。为了用成对的自然内部进化枝序列作为疫苗抗原来说明潜在的t细胞表位(pte)覆盖率，将5000个随机选择的自然b进化枝序列(灰色)对作为潜在疫苗进行评估，并且189个当代b进化枝美国序列的平均覆盖率的分布以灰色直方图显示。这与由m组epigraph(m数据库)的2个抗原集合、全球b进化枝epigraph(b数据库)的两个抗原集合和美国b进化枝定制疫苗提供的平均覆盖率进行比较，其中来自用于制造的6个代表性的epigraph的集合的两个最佳匹配被选择作为针对189个自然的b进化枝美国序列中的每一个的“定制”匹配。图6a显示了全gag蛋白的比较。图6b仅显示了保守的p24区域的比较。图7显示跨越hiv蛋白质组的映射潜在表位覆盖率。图8通过不同疫苗抗原显示了hiv-1b进化枝美国序列的平均潜在的gag表位覆盖率。图8a通过单个疫苗抗原显示了平均gag表位覆盖率，图8b显示了通过疫苗抗原对的平均gag表位覆盖率。图9a-c显示了epigraph设计的合成hiv抗原被表达为全长蛋白。hela细胞用表达质粒转染，该表达质粒编码：用于hiv或siv的gag和nef的融合蛋白(hivm组epigraph1[seqidno：705]和hivm组epigraph2[seqidno：707]，sivmac239全长蛋白质，siv变体杂交蛋白[seqidno：713]和gag与nef的siv保守部分[seqidno：714])，如图9a所示；hiv或siv的聚合酶蛋白(sivmac239全长(fl)，siv变体杂交蛋白[seqidno：715]，(hivm组epigraph1[seqidno：709]和hivm组epigraph2[seqidno：711]，以及pol[seqidno：716]的siv保守部分)，如图9b所示的；以及用于hiv的gag和nef的融合蛋白(进化枝bepigraph1gag/nef[seqidno：701])和进化枝bepigraph2gag/nef[seqidno：702])和用于hiv的聚合酶蛋白(进化枝mepi1pol[seqidno：709])；进化枝bepigraph1pol[seqidno：703])；进化枝bepigraph2pol[seqidno：704])，如图9c所示。所有gag/nef构建体包括羧基末端v5标签(图9a)，并且所有pol构建体包括羧基末端ha标签(图9b和9c)。对于图9b，1和2表示每个构建体的多个克隆。在转染后48小时收获裂解液，并使用v5(图9a)或ha(图9b和9c)抗体进行免疫印迹。观察到的蛋白质的分子量与每个构建体的预测分子量一致。图10a-b显示epigraph设计的合成抗原由cmv载体表达。如图10a所示，表达sivmac239聚合酶全长(fl)的rhcmv菌株68-1、来自不同siv变体[seqidno：715]的siv聚合酶的杂交体、基于全球m组hivepigraph1[seqidno：709]合成聚合酶基因或全球m组hivepigraph2[seqidno：711]通过bac诱变构建并重组在调聚的恒河猴成纤维细胞中。如图10b所示，表达聚合酶构建体[seqidno：716]的sivmac239保守区的rhcmv菌株68-1通过bac诱变构建，并重构在调聚的恒河猴成纤维细胞中。在所有载体中，抗原表达由内源性病毒rh107启动子驱动。以全cpe收获细胞沉淀，并对每个蛋白质的羧基末端表达的ha标签进行免疫印迹。对于保守的pol，两个独立的克隆(2.1和2.2)如图10b所示。图11a-c示出了在nef(图11a)、gag(图11b)和pol(图11c)内的保守区。其基于潜在的t细胞表位(pte)覆盖率的潜力通过二价(即2个抗原)疫苗来定义。图12通过不同疫苗抗原示出了与蛋白的更可变部分相比的每个保守区的平均epigraph覆盖率。具体实施方式在整个说明书和权利要求书中使用了与该具体实施方式的方面有关的各种术语。除非另有说明，否则这些术语将被赋予本
技术领域：
的其普通的含义。其他具体定义的术语应以与本文提供的定义一致的方式来解释。如本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数指示物，除非另有明确规定所述的内容。因此，例如，对“一个(a)细胞”的引用包括两个或更多个细胞的组合等。当涉及诸如数量、时间持续期间等可测量值时，本文所用的术语“约”意在涵盖与指定值相差高达±20％的变化，因为这些变化是适于执行所公开的方法。除非另有说明，否则在说明书和权利要求书中使用的表示成分的数量、诸如分子量之类的性质、反应条件等的所有数字应被理解为在所有情况下被术语“约”修饰。因此，除非有相反指示，否则在以下说明书和所附权利要求中阐述的数值参数是可以根据寻求通过本发明获得的期望性质而变化的近似值。至少并非试图将等同原则的应用限制在权利要求书的范围内，每个数值参数至少应该根据报告的有效数字的数量并通过应用普通舍入技术来解释。尽管阐述本发明的广泛范围的数值范围和参数是近似值，但是具体实施例中列出的数值尽可能精确地报告。然而，任何数值固有地包含必然由在其各测试测量中存在的标准偏差导致的某些误差。如上文和整个披露中所使用的，术语“有效量”是指在有关治疗相关疾病、病症或副作用方面达到预期效果所需要的有效剂量和时间段的有效量。应当理解，本发明的组分的有效量将随着患者不同而不同，不仅在特定的疫苗、选择的组分或组合物、给药途径以及组分引起个体中的所需结果的能力方面不同，而且在诸如要缓解的疾病状态或疾病的严重程度、激素水平、年龄、性别、个体重量、患者状况以及所治疗的病理状况的严重程度等因素，特定患者同时服用的药物或特殊饮食，以及本领域技术人员将认识到的其他因素方面不同，适当的剂量由主治医师酌情决定。可以调整剂量方案以提供改善的治疗反应。有效量也是其中组分的任何有毒或不利影响超过治疗有益效果的量。术语“施用”是指直接施用本发明的化合物或组合物，或施用将在体内形成等量的活性化合物或物质的前药、衍生物或类似物。术语“受试者”、“个体”和“患者”在本文中可互换使用，并且是指使用根据本发明的药物组合物治疗(包括预防性治疗)的动物，例如人。本文所用的术语“受试者”是指人类和非人类动物。术语“非人类动物”和“非人类哺乳动物”在本文中可互换使用，并且包括所有脊椎动物，例如哺乳动物，例如非人灵长类动物(特别是高等灵长类动物)，绵羊，狗，啮齿动物，(例如，小鼠或大鼠)，豚鼠，山羊，猪，猫，兔，牛，马和非哺乳动物，如爬行动物，两栖动物，鸡和火鸡。术语“混合体(cocktail)”是指旨在组合递送给患者的抗原集合。术语“表位基共序列(episensus)”是指基于表位的共有序列。它是一种序列，其表位尽可能地匹配基准自然序列集合中的表位。术语“表位”和“潜在表位”是指k字符的序列(通常k在8-12的范围内)，该序列通常在长得多的自然或疫苗抗原序列的k-字符亚序列的上下文中。t细胞可以在免疫应答中识别这些肽。术语“epigraph”是指一种新的计算策略，该计算策略被开发以用于产生提供最佳表位基共序列的序列，或对多种病毒序列的群体提供最佳覆盖率的组合的序列集合。术语“epigraph序列”或“episensus抗体”是指基于epigraph算法设计的疫苗插入片段。术语“群体表位基共序列抗原(populationepisensusantigen)”是指用epigraph算法导出的序列，其是hiv序列的群体的“核心”。群体可以是特定的hiv进化枝、使用我们的定制的基于表位的聚类算法导出的序列簇、或全球流行病。“核心”是根据共享潜在的表位来定义的，因此它是计算来源的序列，其提供群体的最大平均表位覆盖率。epigraph序列可用作预防性的防治性疫苗的解决方案，或者可以作为用于设计治疗性疫苗的更复杂的策略的一部分，所述治疗性疫苗被定制成匹配个体感染。术语“定制疫苗集合”是指设计用于制造的疫苗抗原序列的集合，可以从该集合中选择子集抗原来最佳地匹配患者的病毒，以作为治疗性疫苗递送。术语“定制抗原”或“定制表位基共序列抗原”是指来自“定制疫苗集合”的一个或多个氨基酸序列，该定制疫苗集合是根据与患者感染的hiv-1菌株的最佳匹配而特定选择的，以作为治疗性疫苗递送给该患者。如本文所使用的术语“治疗”或“治疗法”(以及其不同形式，包括治愈或减缓)是指对被感染的人的治疗。如本文所用，术语“治疗”包括减轻或减少病况、疾病或病症的至少一种不利或负面影响或症状。这种病况、疾病或病症可以是hiv感染。如本文所用，术语“防治”或“预防”是指防止受试者感染例如hiv、siv或相关病毒，或降低受试者感染例如hiv、siv或相关病毒的风险，或停止例如hiv、siv或相关病毒的传播或降低例如hiv、siv或相关病毒的传播的风险。“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内适合与人类和动物的组织接触而不具有过度毒性、刺激性、过敏反应或者其他与合理利益/风险比相称的问题并发症的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。可以使用的载体包括但不限于质粒、细菌载体和病毒载体。病毒载体包括巨细胞病毒(cmv)载体。这些cmv载体用于治疗性疫苗递送的优点是它们产生新的cd8+t细胞表位范例，并诱导更有效和持久的反应。在动物模型中已经显示，基于这些病毒载体的疫苗可以清除病毒感染(hansen,s.g.2013.science340:1237874)，并且因此这些方法对于治疗性疫苗(一种设置，其中定制疫苗可能是有用的)是有希望的。其他病毒载体可包括：痘病毒(痘苗)，其包括痘苗ankara和金丝雀痘；腺病毒，其包括5型腺病毒(ad5)；风疹；仙台病毒；弹状病毒；甲病毒和腺相关病毒。替代地，epigraph疫苗抗原可以作为疫苗的dna、rna或蛋白质成分递送。由于这是抗原设计策略，因此epigraph设计的疫苗抗原将与基本上任何模式的疫苗抗原递送兼容。在某些实施方案中，使用epigraph氨基酸序列设计的疫苗具有单个抗原。在某些实施方案中，使用epigraph氨基酸序列设计的疫苗具有抗原集合。在某些实施方案中，epigraph抗原序列可用于预防性疫苗设置中。在某些实施方案中，epigraph策略可用于制备完全优化预防性疫苗的表位覆盖的序列。这可以是一个序列，或者被设计为彼此互补作为预防性疫苗的若干序列。epigraph疫苗可用于任何载体，包括但不限于质粒、细菌载体和病毒载体。在epigraph算法中，自然序列的特征在于大的节点图，每个节点对应于出现在自然序列中的表位。当相应的两个表位串“一致”时，定向边连接两个节点，这意味着第一字符串中的最后的k-1个字符与第二字符串中的开始的k-1个字符一致(例如，“eptappaeptap”[seqidno:796]和“ptappaeptapp”[seqidno:797]是一致的，k＝12聚体)。如果两个字符串一致，则长度为k+1的字符串(例如，“eptappaeptapp”)[seqidno:798]包含两个表位。更一般地，通过该图形的节点和边缘的路径对应于包含对应于图中每个节点的k聚体子串的单个字符串。每个节点根据基准集合中多少个序列显示对应于该节点的子串进行加权。epigraph算法使用动态编程方案来找到通过这个完整图形的路径，使得这些权重的总和最大化，因此提供了最大的覆盖率。所提供的某些实施方案包括hiv-1疫苗，其包含载体和群体表位基共序列抗原，或被设计为用作集合的优化的epigraph抗原的组合。存在可以用于疫苗的许多不同载体。例如，可以使用的一种类型的载体是病毒载体。这些病毒载体可以包括人巨细胞病毒(hcmv)、痘病毒、腺病毒、风疹、仙台病毒、弹状病毒、甲病毒或腺伴随病毒。疫苗也可以作为编码epigraph蛋白质的基因递送，其使用dna、rna进行或作为表达蛋白或蛋白的一部分被包含。在某些实施方案中，所公开的疫苗的epigraph抗原可以衍生自hiv-1gag蛋白。在另一实施方案中，hiv-1gag蛋白已经通过消除hiv-1gag蛋白的n末端中的肉豆蔻酰化序列而失活。在另一个实施方案中，epigraph抗原可以衍生自hiv-1pol或nef蛋白，或实际上衍生自任何其他hiv蛋白，其包括env、tat、rev、vif或vpu。在某些实施方案中，可以使用epigraph方法确定群体表位基共序列抗原。然后可以使用该群体表位基共序列抗原来产生疫苗。替代地，epigraph可以被设计为被设计成用作集合的序列的组合。hiv-1可以根据地理位置分为进化枝。在一个实施方案中，群体表位基共序列抗原是在所公开的疫苗中的美国hiv-1b进化枝流行病的核心。在另一实施方案中，群体表位基共序列抗原是在所公开的疫苗中的南非hiv-1c进化枝流行病的核心。在另一实施方案中，群体表位基共序列抗原是在所公开的疫苗中的泰国hiv-12进化枝区域流行病的核心。在另一实施方案中，所述群体表位基共序列抗原是所公开的疫苗中的hiv-1m-组全球集合的核心。在一些实施方案中，hiv-1群体表位基共序列抗原包含来自gag、pol、nef、env、tat、rev、vpr、vif或vpu的表位。在一些实施方案中，hiv-1群体表位基共序列抗原包含来自gag的表位，并且包含seqidno:691、seqidno:697、seqidno:698、seqidno:699、或seqidno:700的氨基酸序列。在一些实施方案中，hiv-1群体表位基共序列抗原包含来自hiv-1的保守区的表位。在一些实施方案中，hiv-1群体表位基共序列抗原包含来自gag、pol或nef的保守区的表位。在一些实施方案中，来自gag的保守区的表位是来自gag的p24衣壳蛋白的表位。在一些实施方案中，hiv-1群体表位基共序列抗原是包含两种或更多种hiv-1群体表位基共序列抗原的融合抗原。在一些实施方案中，融合抗原包含包含gag表位的hiv-1群体表位基共序列抗原和包含nef表位的hiv-1群体表位基共序列抗原。在一些实施方案中，融合抗原包含包含来自gag的保守区的表位的hiv-1群体表位基共序列抗原和包含来自nef的保守区的表位的hiv-1群体表达抗原。在一些实施方案中，来自gag的保守区的融合抗原的表位是来自gag的p24衣壳蛋白的表位。在一些实施方案中，hiv-1群体表位基共序列抗原是美国hiv-1b进化枝流行病的核心。在一些实施方案中，hiv-1b进化枝群体表位基共序列抗原包含gag表位并且包含seqidno：730、seqidno：732或seqidno：778的氨基酸序列。在一些实施方案中，hiv-1b进化枝群体表位基共序列抗原包含来自gag的p24衣壳蛋白的表位，并且包含seqidno：731、seqidno：733或seqidno：779的氨基酸序列。在一些实施方案中，hiv-1b进化枝群体表位基共序列抗原包含nef表位并且包含seqidno：734或seqidno：736的氨基酸序列。在一些实施方案中，hiv-1b进化枝群体表位基共序列抗原包含来自nef的保守区的表位，并且包含seqidno：735或seqidno：737的氨基酸序列。在一些实施方案中，hiv-1b进化枝群体表位基共序列抗原包含pol表位，并且包含seqidno：703、seqidno：704、seqidno：738或seqidno：740的氨基酸序列。在一些实施方案中，hiv-1b进化枝群体表位基共序列抗原包含来自pol的保守区的表位，并且包含seqidno：739或seqidno：741的氨基酸序列。在一些实施方案中，hiv-1b进化枝群体表位基共序列抗原是融合抗原，其包含(1)包含gag表位的hiv-1b进化枝群体表位基共序列抗原和(2)包含nef表位的hiv-1b进化枝群体表位基共序列抗原，其中所述融合抗原包含seqidno：701或seqidno：702的氨基酸序列。在一些实施方案中，hiv-1b进化枝群体表位基共序列抗原是融合抗原，其包含(1)包含来自gag的p24衣壳蛋白的表位的hiv-1b进化枝群体表位基共序列抗原和(2)包含来自nef的保守区的表位的hiv-1b进化枝群体表位基共序列抗原。在一些实施方案中，hiv-1群体表位基共序列抗原是南非hiv-1c进化枝流行病的核心。在一些实施方案中，hiv-1c进化枝群体表位基共序列抗原包含gag表位并且包含seqidno：742、seqidno：744或seqidno：766的氨基酸序列。在一些实施方案中，hiv-1c进化枝群体表位基共序列抗原包含来自gag的p24衣壳蛋白的表位，并且包含seqidno：743、seqidno：745或seqidno：767的氨基酸序列。在一些实施方案中，hiv-1c进化枝群体表位基共序列抗原包含nef表位，并且包含seqidno：746或seqidno：748的氨基酸序列。在一些实施方案中，hiv-1c进化枝群体表位基共序列抗原包含来自nef的保守区的表位，并且包含seqidno：747或seqidno：749的氨基酸序列。在一些实施方案中，hiv-1c进化枝群体表位基共序列抗原包含pol表位并且包含seqidno：750或seqidno：752的氨基酸序列。在一些实施方案中，hiv-1c进化枝群体表位基共序列抗原包含来自pol的保守区的表位并且包含seqidno：751或seqidno：753的氨基酸序列。在一些实施方案中，hiv-1c进化枝群体表位基共序列抗原是融合抗原，其包含(1)包含gag表位的hiv-1c进化枝群体表位基共序列抗原和(2)包含nef表位的hiv-1c进化枝群体表位基共序列抗原。在一些实施方案中，hiv-1c进化枝群体表位基共序列抗原是融合抗原，其包含(1)包含来自gag的p24衣壳蛋白的表位的hiv-1c进化枝群体表位基共序列抗原和(2)包含来自nef保守区的表位的hiv-1c进化枝群体表位基共序列抗原。在一些实施方案中，hiv-1群体表位基共序列抗原是泰国hiv-12进化枝区域流行病的核心。在一些实施方案中，hiv-12进化枝群体表位基共序列抗原包含gag表位。在一些实施方案中，hiv-12进化枝群体表位基共序列抗原包含来自gag的p24衣壳蛋白的表位。在一些实施方案中，hiv-12进化枝群体表位基共序列抗原包含nef表位。在一些实施方案中，hiv-12进化枝群体表位基共序列抗原包含来自nef的保守区的表位。在一些实施方案中，hiv-12进化枝群体表位基共序列抗原包含pol表位。在一些实施方案中，hiv-12进化枝群体表位基共序列抗原包含来自pol的保守区的表位。在一些实施方案中，hiv-12进化枝群体表位基共序列抗原是融合抗原，其包含(1)包含gag表位的hiv-12进化枝群体表位基共序列抗原和(2)包含nef表位的hiv-12进化枝群体表位基共序列抗原。在一些实施方案中，hiv-12进化枝群体表位基共序列抗原是融合抗原，其包含(1)包含来自gag的p24衣壳蛋白的表位的hiv-12进化枝群体表位基共序列抗原和(2)包含来自nef的保守区的表位的hiv-12进化枝群体表位基共序列抗原。在一些实施方案中，hiv-1群体表位基共序列抗原是hiv-1m组全球集合的核心。在一些实施方案中，hiv-1m组群体表位基共序列抗原包含gag表位并且包含seqidno：718、seqidno：720或seqidno：754的氨基酸序列。在一些实施方案中，hiv-1m组群体表位基共序列抗原包含来自gag的p24衣壳蛋白的表位，并且包含seqidno：719、seqidno：721或seqidno：755的氨基酸序列。在一些实施方案中，hiv-1m组群体表位基共序列抗原包含nef表位并且包含seqidno：722或seqidno：724的氨基酸序列。在一些实施方案中，hiv-1m组群体表位基共序列抗原包含来自nef的保守区的表位并且包含seqidno：723或seqidno：725的氨基酸序列。在一些实施方案中，hiv-1m组群体表位基共序列抗原是融合抗原，其包含(1)包含gag表位的hiv-1m组群体表位基共序列抗原和(2)包含nef表位的hiv-1m组群体表位基共序列抗原，其中所述融合抗原包含seqidno：705或seqidno：707的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述hiv-1m组群体表位基共序列抗原是融合抗原，其包含(1)包含来自gag的p24衣壳蛋白的表位的hiv-1m组群体表达抗原和(2)包含来自nef保守区的表位的hiv-1m组群体表达抗原，其中所述融合抗原包含seqidno:706或seqidno:708的氨基酸序列。在一些实施方案中，hiv-1m组群体表位基共序列抗原包含pol表位，并且包含seqidno：709、seqidno：711、seqidno：726或seqidno：728的氨基酸序列。在一些实施方案中，hiv-1m组群体表位基共序列抗原包含来自pol的保守区的表位，并且包含seqidno：710、seqidno：712、seqidno：727或seqidno：729的氨基酸序列。在某些实施方案中，所公开的疫苗可进一步包含hcmv载体，该hcmv载体包含hcmv主链和选定为最佳匹配的自然hiv-1菌株的定制抗原。在另一实施方案中，所公开的疫苗可进一步包含hcmv载体，该hcmv载体包含hcmv主链和被选择为最佳匹配的不同hiv-1菌株的定制抗原。在一些实施方案中，hiv-1定制抗原包含来自gag、pol、nef、env、tat、rev、vpr、vif或vpu的表位。在一些实施方案中，定制抗原包含选自seqidno.692-696；seqidno.756-765；seqidno.769-777；或seqidno.780-789中的序列。在一些实施方案中，hiv-1定制抗原包含来自gag的表位，并且包含seqidno:692、seqidno:693、seqidno:694、seqidno:695、或seqidno:696的氨基酸序列。在一些实施方案中，hiv-1定制抗原是hiv-1m组全球集合的核心。在一些实施方案中，hiv-1m组定制抗原包含gag表位并且包含选自seqidno：756-765中的氨基酸序列。在一些实施方案中，hiv-1m组定制抗原包含来自gag的p24衣壳蛋白的表位，并且包含seqidno：757、seqidno：759、seqidno：761、seqidno763、或seqidno：765中的氨基酸序列。在一些实施方案中，hiv-1定制抗原是南非hiv-1c进化枝流行病的核心。在一些实施方案中，hiv-1c进化枝定制抗原包含gag表位并且包含选自seqidno：768-777中的氨基酸序列。在一些实施方案中，hiv-1c进化枝定制抗原包含来自gag的p24衣壳蛋白的表位，并且包含seqidno：769、seqidno：771、seqidno：773、seqidno：775或seqidno：777中的氨基酸序列。在一些实施方案中，hiv-1定制抗原是美国hiv-1b进化枝流行病的核心。在一些实施方案中，hiv-1b进化枝定制抗原包含gag表位并且包含选自seqidno：780-789中的氨基酸序列。在一些实施方案中，hiv-1b进化枝定制抗原包含来自gag的p24衣壳蛋白的表位，并且包含seqidno：781、seqidno：783、seqidno：785、seqidno：787或seqidno：789的氨基酸序列。在某些实施方案中，提供了治疗受试者的hiv-1的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的所公开的疫苗中的一种。在另一个实施方案中，选择疫苗抗原以最佳地覆盖地理区域内的多样性使用使用抗原序列选择的epigraph方法产生的疫苗抗原序列。本发明的实施方案包括治疗受试者的hiv-1感染的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的这些公开的疫苗中的任一种。本发明的实施方案还包括诱导效应子记忆t细胞应答的方法，其包括：确定一个或多个epigraph序列，产生包含一个或多个epigraph氨基序列和载体的疫苗；并将该疫苗施用给有需要的受试者。在另一个实施方案中，提供了诱导效应子记忆t细胞应答的方法，其中所述一个或多个epigraph氨基酸序列包含seqidno：697、seqidno：698、seqidno：699或seqidno：700。该疫苗可以是预防或治疗性疫苗。hiv疫苗研究的最新突破包括效应子记忆t细胞(tem)诱导疫苗以预防hiv感染的构思。与传统疫苗方法诱导的中央记忆t细胞(tcm)不同，tem持续保留在淋巴组织和外淋巴效应子位点，并立即准备介导抗病毒效应子功能，从而在病毒进入端口和病毒再活化的位置处提供恒定的免疫屏障。诱导和无限期维持tem的最合格的载体系统来源于cmv。据推测，由于在持续感染的细胞中的连续的、低水平的再活化和/或基因表达，cmv维持对于tem维护而不会触发t细胞耗尽所需的适当量的持续的、低水平的免疫刺激。在某些实施方案中，定制抗原混合体可用于治疗性疫苗设置。例如，定制疫苗可以使用k-均值(k-means)聚类策略来定义6-10个序列的集合，该集合在感染了高度可变的病原体(例如hiv)的人群中提供非常好的表位覆盖。可以对感染受试者的病毒进行测序，并且将递送最多可以覆盖感染病毒的2或3个定制疫苗。表位覆盖将被优化，而疫苗和感染菌株之间的表位错配将被最小化。所提供的某些实施方案包括包含hcmv主链载体的hiv-1疫苗和群体表位基共序列抗原，该hcmv主链载体缺少某些cmv基因区域。在某些实施方案中，hcmv主链可能缺少ul131a-128基因区域。某些实施方案还可以包括缺失外皮(tegument)蛋白pp71(ul82)基因。(美国专利申请公开no.2014-0141038；no.2008-0199493；no.2013-0142823和国际申请公开no.wo/2014/138209)。在某些实施方案中，本公开提供可包含第二定制抗原序列的疫苗。在某些实施方案中，疫苗可以包含第二定制抗原序列、第三定制抗原序列或更多定制抗原序列。该表位基共序列抗原可以包含seqidno：691的氨基酸序列。定制抗原可以包含seqidno：692、seqidno：693、seqidno：694、seqidno：695或seqidno：696的氨基酸序列。在一个实施方案中，第一定制抗原序列和第二定制抗原序列包含seqidno：692、seqidno：693、seqidno：694、seqidno：695或seqidno：696的氨基酸序列中的两个。在另一个实施方案中，第一定制抗原序列、第二定制抗原序列和第三定制抗原序列包含seqidno：692、seqidno：693、seqidno：694、seqidno：695或seqidno：696的氨基酸序列中的三个。还提供了定制抗原序列，其可以包含seqidno：692、seqidno：693、seqidno：694、seqidno：695或seqidno：696。在某些实施方案中，所公开的疫苗可以进一步包含hcmv载体，其包含hcmv主链和选定为与自然hiv-1菌株最佳匹配的定制抗原。在另一实施方案中，所公开的疫苗可以进一步包含hcmv载体，其包含hcmv主链和被选择为与不同(和远的)hiv-1毒株最佳匹配的定制抗原。在某些实施方案中，所公开的疫苗的表位基共序列抗原和定制抗原可以衍生自hiv-1gag蛋白。在另一实施方案中，hiv-1gag蛋白已经通过消除hiv-1gag蛋白的n末端中的肉豆蔻酰化序列而失活。在另一个实施方案中，可以从hiv-1pol或nef蛋白衍生出该表位基共序列抗原和定制抗原。在某些实施方案中，提供了治疗受试者中的hiv-1的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的所公开的疫苗中的一种。在另一个实施方案中，提供了设计和产生用于受试者的hiv-1疫苗的方法，其包括对个体中的hiv-1病毒进行测序，选择被设计为最佳地覆盖地理区域内的多样性的疫苗抗原，以及将疫苗抗原插入载体。某些实施方案包括治疗感染hiv-1的受试者的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的该公开疫苗中的任何一种。提供以下实施例以更详细地描述本文所述的实施方案。它们旨在说明而不是限制实施方案。本文引用的所有文献、专利和专利申请通过引用并入本文，并且可以用于本发明的实践中。实施例实施例1：对齐序列的最佳表位覆盖的图形模型。假定存在n个对齐序列的集合s＝{s1，s2，...，sn}。每个序列是字母字符串(对应于二十种氨基酸，可能另外还有对应于缺口、未知物等的几个特殊字符)。由于序列对齐，所有的序列都具有相同的长度t，位置t＝1...t从序列到序列被很好地定义；sn[t]将被写为第n个序列中的第t个字符。对于从位置t开始并在位置u结束的s的子序列，引入符号s[t：u]是有用的。潜在表位被定义为k个字符的短序列，通常为8至12个字符。所研究的表位是s中的序列的子序列。实际上，序列s可以被认为是表位的列表：e1，...，et-k+1，其中et＝s[t：t+k-1]。但是，注意，对于与序列相关的表位的列表，表位必须一致。具体而言，对于任何相邻对的et和et+1，要求et的最后k-1个字符与et+1的开始的k-1个字符一致；即：et[2：k]＝et+1[1：k-1]。对于每个表位e，频率f(e)可以相关联，其计数s序列中的表位出现的比例。对于一般的混合体问题，寻求人工序列的集合q＝{q1，...，qm}，其表位具有有用的性质。让eq成为出现在q中的所有表位的集合；即：eq＝{e|e＝qm[t:t+k-1]，针对m,t的一些选择}。特别地，这些表位被设计成尽可能多地覆盖序列集合s。目标是最大限度地提高覆盖得分σf(e)，其中和是针对e∈eq对于m<n，通常为m<<n，所有表位通常不能被覆盖。对于对齐的顺序问题，可以进行一些简化。在这种情况下，对齐中的每个位置都被视为不同的(但不是独立的)问题。频率函数现在取决于位置：f(t，e)是s中的序列数，其中e是在位置t开始的k聚体子序列；从而，f(t，e)＝σi(e＝sn[t：t+k-1])其中i是指标函数：其在变量(argument)为真的情况下是1，否则为0。集合eq也可以根据在序列q中的位置进行分区。从而：eq[t]＝{e|e＝qm[t:t+k-1]，针对某些m}。这使得能够为每个位置生成覆盖率度量c[t]＝σe∈eq[t]f(t，e)，由此通过c＝σtc[t]给出整体覆盖率。对于k＝1的微不足道的特殊情况，表位只是氨基酸字符。但即使这个问题是微不足道的而无需解决，但解决方案仍然有用。对于m＝1，最佳解决方案由共有序列给出，其中q1[t]被选择为在位置t的最常见的氨基酸。对于m＝2，可以通过将q2[t]作为位置t的第二最常见的氨基酸来优化覆盖。对于较大的m，依此类推。对于k>1，问题变得不平凡，因为表位重叠，因此每个c[t]不能再独立地优化。m＝1的情况被称为“episensus”问题，因为它类似共有，不同的是，其是被寻求的表位的共有。在一个示例中，共有序列和k＝3的episensus不同：共有序列在每个位置都使用最常用的字母。该episensus使用了最常用的“表位”，其中我们调用潜在表位3个字符的字符串。表1展开了该示例，以说明重叠的表位串。表1：所显示的是六个序列及其相关的k＝3的表位。底线显示共有序列(在每个位置由最常见的字符形成)和每个位置上最常见的表位。但是这些表位(特别是efg和chs)彼此不一致，因此它们不能被组合成单一的表位基共序列方案。在这种情况下，最佳表位基共序列得分通过以下序列(但不是唯一的)给出：archslm[seqidno：794]，其覆盖了序列中30个可能的表位中的1+1+2+2+3＝9。共有序列，arcgslm[seqidno：799]，覆盖1+1+1+1+3＝7。注意，可以从每个位置上最流行的表位的频率获得该得分的上限：在这种情况下，给出2+2+2+2+3＝11。解决表位基共序列问题。首先寻址m＝1的情况，其中寻求单个序列q，其表位最佳地覆盖未对齐序列表s中的表位。在适当假设下的epigraph算法达到最优解。在该比较中，共有算法也被考虑(非常简单和快速)，并且优化通过遗传算法(非常缓慢)进行，如(通过引用并入本发明的fisher,natmed.2007jan；13(1):100-6)中所描述的。epigraph算法如图1a和1b所示。之后，考虑了更普遍的疫苗混合体问题，其中m>1，并显示了这一更普遍的问题如何修改该表位基共序列算法。图2示出了表位图的节点(其中，每个节点包括表位k-字符串)，以及使得在对齐序列集合中在该位置观察到表位的频率(f)，以及在该节点结束的一致路径的累积最佳得分s。节点排布成列，每列对应于与表位相关联的位置t。连接这些节点的线对应于一致的相邻表位。目的是通过该图找到一致的路径，使每个节点中频率值的总和最大化。图2中的粗线显示一条导致最佳总分的路径。总是有至少一条这样的路径，但它可能不是唯一的。累积得分s(t，e)被定义为可得到的最高得分，其从t＝1开始并在位置t在表位e完成。观察到s(t＝1,e)＝f(e)，并且针对t>1的值可以递归计算：s(t,e)＝f(e)+maxe’s(t-1,e’),而e’∈e(t-1,e)其中e(t-1，e)是在位置t-1处的与在位置t的e一致的表位的集合。计算了所有表位的该累积得分后，针对最佳路径得分，总得分被发现为是最后一列的最大分数：smax＝maxes(t-k+1,e)。此外，它可以从最大值向后工作来找到最佳路径：e*t-k+1＝argmaxes(t-k+1,e)e*t-1＝argmaxe’s(t-1,e’)，而e’∈e(t-1,e*t)序列e*1,e*2,...,e*t-k定义了表位的最高得分一致序列。表位基共序列字符串q通过以下方式获得：从每个表位取第一个字符：q[t]＝et*[1]，并用最后的表位完成：q[t-k:t]＝e*t-k[1:k]。argmax运算符可能没有唯一的值；如果没有，那么对于表位基共序列问题来说，会有多种解决方案，所有这些问题在覆盖率方面都是最佳的。缺口(gap)。为了对齐序列，必须处理插入和缺失，并且这会将缺口引入到对齐的序列中。例如，序列arccdegh[seqidno:806]和arcdefgh[seqidno:807]在为arccde-gh[seqidno:808]和arc-defgh[seqidno:809]时被更好地对齐。开发占位符表位以处理epigraph算法中的这些缺口。占位符表位：k＝3的表位分别为arc、rcc、ccd、cde、deg、egh和abc、bcd、cde、def、efg、fgh；但是，当表位与第一列对齐时，需要将缺口引入在该列表中：abc、bcc、ccd、cde、deg、egh、-gh和abc、bcd、cde、-de、def、efg、fgh。字符串-gh和-de是占位符表位。占位符不计入覆盖函数；即：f(t；-xy)＝0，但它们仍然有用，因为它们可用于定义相邻表位的一致性。对于无缺口序列，如果第一表位的最后k-1个字符与第二表位的开始的k-1个字符一致，则认为两个相邻表位是一致的。因此，abc和bcd是一致的，但bcc和cde不一致。当引入缺口时，如果第二表位以缺口字符开始被考虑，并且剩余的k-1个字符与最后的表位的最后k-1个字符相匹配，则一对是一致的。因此，cde和-de是一致的。对于原位滴加(drop-in-place)算法，使用通常被认为是共有序列的“底物”序列。然后，取所有位置的所有表位并根据它们出现的频率进行排序(sort)。从最不频繁的表位开始，通过用表位中的字符替换底物中的在位置[t：t+k-1]的字符，将每个表位滴加到底物上。当最常发生的表位滴在底物上时，使用字符串作为表位基共序列解决方案q。由于最常见的表位覆盖了罕见的表位，因此获得了较高的表位覆盖率。并且由于始终更新单个序列q，所以最终解决方案将由一致的表位组成。该算法可能不是完全确定性的，因为一些表位可能具有相同的频率，并且如果它们的位置是重叠的，则最终结果可以取决于它们被滴加的顺序。在实现时，采取排序算法给出的顺序，但是有机会随机化这些顺序，并对该算法进行多次运算，一些运行可能会提供较高的分数。启发式“原位滴加”算法。在该算法中，“底物”序列被认为是共有序列，但是底物的选择很少有任何差异。取所有位置的所有表位，并根据出现的频率进行排序。从最不频繁的表位开始。通过用表位中的字符替换底物中的在位置[t：t+k-1]的字符，将每个表位“滴加”到底物上。当最常发生的表位最后滴加到底物上时，有用作表位基共序列解决方案q的字符串。由于最常见的表位覆盖了较罕见的表位，因此获得了较高的表位覆盖率。由于始终更新单个序列q，所以最终解决方案由一致的表位组成。该算法可能不是完全确定性的，因为一些表位可能具有相同的频率，并且如果它们的位置是重叠的，则最终结果可以取决于它们被滴加的顺序。在实现方案中，采取排序算法给出的顺序，但是有机会随机化这些顺序并且对该算法进行多次运算，一些运算可能给出更高的得分。这种随机多运算方法的效用尚未得到研究。解决方案仅取决于每个位置上最常见的表位，因此对于表1中的示例，它将是def、efg、chj、hjl、jlm的一致组合。如果它们以该顺序滴加(前四个具有频率2，最后一个具有频率3)，则得到dechjlm[seqidno：810]，其得分0+0+2+2+3＝7超过共有，但是不到最优。如果按照顺序hjl、chj、efg、def、jlm滴加，则得到defgjlm[seqidno：811]，其得分为2+2+1+1+3＝9，对于该示例，其为最佳得分。这两种解决方案如图3所示。对齐疫苗(m>1)混合体的问题。在使用遗传算法优化的原始镶嵌解决方案中，镶嵌序列的所有m同时被优化。顺序解决方案。将m＝1的表位基共序列解决方案扩展到m>1问题的一种方法是修改算法，从而优化总覆盖率以优化补充覆盖率。也就是说：给定表位基共序列解决方案q1，得到覆盖尽可能多的不被q1覆盖的其余表位的q2。顺序解决方案的迭代细化。给定初始解q1，q2，...，qm，可以重新计算q1的新估计值。这是通过以下方式完成的：从每个表位的原始频率值开始，但将由q2，...，qm覆盖的那些表位设置为零。这种补充覆盖问题的优化导致了新的q1。可以通过这种方式循环遍历所有的初始解决方案，每次优化补充覆盖。大小差一(off-by-one)打分。迄今为止的分析表明，仅当序列s中的表位与序列q中的表位完全匹配时才能得到覆盖。但是，特别是对于较长的表位，例如k＝12，序列中的表位如果是近似匹配的，则仍然可能是有效的。例如，在12个字符中的11个一致就可能构成满意的覆盖。结果。使用690个序列的数据集合比较这些算法。图4示出了对于这样大的数据集合所呈现的图形的样子。图4显示了与690个美国b进化枝gag蛋白序列(seqidno：1-690)的数据集合相关联的图形，每个对齐556个位置。结果如表2所示。水平轴线为位置t，并且节点列表示在各位置上的不同表位。这些节点被排布成使得最常见的位于底部。显示了节点和边缘(指示相邻节点的一致性)。(a)中显示了完整的图；(b)中显示了相同图形的特写插图。表2显示了覆盖率得分的比较；这是由疫苗序列q＝{q1，...，qm}中的表位覆盖(通过精确匹配)的在序列s中的表位(k＝12)的一部分。表2对于全球epigraph解决方案，基于m组、b进化枝和c进化枝数据库序列(包括高至约2015)以及对于gag、pol和nef的二价疫苗的互补的第二个epigraph序列，确定单个最佳epigraph序列。epigraph代码相对于镶嵌设计的新颖的优点是，其使得能故意排除稀有的表位，这是新序列设计中包含的功能，参见下图，例举了排除m组的罕见变体的影响。图5a-c显示了所使用的epigraph和定制疫苗的最终值。示例2：未对齐序列的最佳表位覆盖的图形模型取n个未对齐的蛋白序列的集合s＝{s1,s2,...,sn}以表征病毒在目标群体(例如，系统发生的进化枝，国家或全球)中的变异性。潜在的表位是k个氨基酸的子序列(通常k＝9)。每个潜在表位e被分配对应于其中出现e的s中的序列数的整数频率f(e)。单价问题是设计类似于自然蛋白质但最佳地覆盖了群体s中的潜在表位的单一人工序列q。将e(q)作为出现在q中的表位集合写入，我们对覆盖率的计量为覆盖率(q)＝∑e∈e(q)f(e)/∑e∈e(s)f(e)分子是出现在q中的表位的频率的总和，并且分母通过出现在s中的任何序列中的所有表位的和归一化。该方程式可以表示为有向图。图中的每个节点对应于不同的表位e，并且如果那些表位重叠k-1个字符，则有向边连接两个长度-k的表位(ea；eb)。通过该图的路径是节点e1,e2,…,el的序列，边缘从ei到ei+1，i＝1,…,l-1。这样的路径对应于作为人工抗原q的l+k-1个字符的序列。如果该有向图没有循环，则epigraph找到通过图的严格地最大化覆盖率的路径，从而提供最佳解决方案。此外，这种优化是通过仅与图形的尺寸(如在节点和边缘中测得的)线性地缩放的计算工作来完成的。实际上，从s创建的有向图可能不是非循环的，尽管通常非常接近非循环的，特别是对于较大的k值。在这种情况下，通过迭代地识别循环，然后移除低值边缘，直到没有剩余循环，从而使该图是“去循环”的。可以通过顺序运行epigraph并优化互补表位覆盖来创建m>1个抗原的多价“混合体”。这通过以下方式来实现：将包含在第一抗原中的表位e进行处理，如同其频率为零，然后在这些经修改的频率上运行epigraph。如果需要第一抗原中的任何表位来完成路径(并产生完整的蛋白)，那么它们仍将可用，但是它们将不受欢迎，因为它们不再对覆盖得分有贡献。可以使用迭代细化来改进该顺序解决方案。实施例3：定制的治疗疫苗。虽然不可能为每个受试者建立设计者疫苗，但可以对来自该受试者的病毒进行排序，以尝试从疫苗选项的小的基准集合中获得良好的匹配。要考虑的第一件事是基于美国b进化枝试验群体，其专注于gag蛋白质。设计了一种基于南非的基准疫苗集合和全球疫苗集合，以及更新的基于美国的b进化枝设计。p24是gag中最高度保守的亚蛋白，且可以从较大的gag蛋白中切除，以提供长度为约230个氨基酸的保守区。保守区方法也被认为是gag的替代方案，也许可以专注于gag和pol中的区域，其可能包括nef的保守区段以及任何其他感兴趣的蛋白。与尝试设计为预防性疫苗提供最佳群体覆盖率的集合不同，这是一个非常不同的优化问题。在预防性病例中，不知道疫苗接种者可能遇到哪些病毒。在治疗病例中，可以获得感染病毒序列并进行匹配。考虑到两件事情进行优化：首先，最大化来自受试者感染病毒的匹配，其次，最大限度地减少不匹配，使得疫苗应答尽可能地在相关表位上有针对性。hiv主要进化枝内的系统发育往往没有什么明确的结构。相反，它是具有非常长的外部进化枝的“星爆”，和在碱基附近的很短的定义不清楚的内部进化枝。这种结构的一部分可能是由于亚型内的重组。虽然这是难以量化的，但重组肯定会相对频繁地发生，并且通过类似于就亚型间重组而言所能明白的，其可能是广泛的。鉴于树的结构，只需在系统发育树上简单使用聚类来定义可能的疫苗的基准集合就不会那么有效，因为进化枝内关联从“表位角度”而言，其含义是有限的。相反，序列关系应通过相关措施来考虑，并且应根据自然菌株与推定的疫苗设计之间的潜在表位相似性来选择基准集合。考虑ii类表位来优化12聚体的，但代码可以使用任何长度的k聚体作为基准点，其中k是推定的潜在表位长度。还使用了9聚体。在以前使用镶嵌的工作中，9聚体的最佳解决方案对于其他附近的长度(8,10,11,12)来说已经非常接近最佳，并且预期将用这里描述的新算法进行转移。本文所公开的某些定制疫苗集合已使用9聚体。最优性是根据k聚体的覆盖率定义。这通过用“表位袋”替换每个序列来定义，表位袋即，出现在序列中的所有k聚体的无序的列表。可以通过制作出现在集合中的任何序列中的所有k聚体的列表来定义表位袋。给定的序列s比序列集合q＝{q1,q2,…,qn}的覆盖率由表位在s袋中的比例给出，其也在q序列的集合袋中，其中q可以是疫苗混合体中的多价组合。正是这种覆盖率被优化了。另一所研究的数量是不在s袋中的表位在q袋中的比例。虽然它不是(目前)直接用于优化，但是这些外来表位的较小比例是优选的，并且这些数字被计算以用于比较和实验设计。在为纳入定制疫苗分析代码(见下文)中的定制疫苗进行聚类时，评估了六种(6)找到“核心序列”的方法。epigraph解决方案被认为是最好的，并被用于最终的代码。还尝试了几种聚类策略。以下是被测试以确定基于氨基酸的核心序列聚类的策略：1)共有(consensus)法：共有法是共同的标准，该标准通过连接最常见的氨基酸对齐获得。潜在表位(k聚体)基：2)表位基共序列(episensus)法：这种方法解决了群体内或聚类内的单个核心序列。测试了两种算法来发现表位基共序列。第一种是原位滴加算法。这从作为“底物”的共有序列开始。排除非常罕见的k聚体(在群体中只发现1次的那些)，从罕见的低频变体开始，并用罕见的变种代替共有的k聚体，然后继续用变体替换，基于它们的频率通过所有的k聚体的列表，用更多和更频繁的变体替换和覆盖，直到整个k聚体的最常见的变体被保持“不变(standing)”；用较高频率重叠k聚体自然会倾向于覆盖用较低频率重叠的肽。第二种算法是epigraph，其在实施例1中被描述。与ga镶嵌相比，epigraph序列被更快速地计算，因此很容易地并入设计定制疫苗所需的聚类算法中。在具有包含gag蛋白(seqidno：1-690)的556个氨基酸的690个对齐序列的集合的实验中，epigraph解决方案非常接近共有，并且也非常接近单一最佳镶嵌，与其他两个质心只有一个氨基酸差异。3)顺序法(sequential)：该方法解决了n个疫苗选择序列的集合。在这里，首先为群体定义了该表位基共序列，并且这是q1。接下来，排除了已经被q1覆盖的所有k聚体，并且该方法通过相同的原位滴加进程来解决系列中的第二个序列，以产生q2。然后已经被q1和q2覆盖的所有k聚体都被排除在外，并且该方法解决了q3，依此类推等等，直到解决了n个序列的集合，每一个序列刚好包括潜在表位的稀有版本。4)迭代法：这是顺序算法的迭代版本。它还产生n个疫苗选择序列的集合，通常比顺序法具有更好的覆盖率，但没有顺序算法产生的优先排序。从顺序解决方案q1,q2,…,qn开始，识别数据序列集合中的所有表位，然后排除由q2,…,qn覆盖的表位。通过使用剩余的(未排除的)表位来解决该表位基共序列，获得q1的新值。下一步对q2进行相同的操作，不包括q1,q3,…,qn中的表位。对于q3到qn依此类推。5)镶嵌(ga镶嵌)法：使用原始遗传算法(ga)定义。镶嵌涉及由ga产生的称为镶嵌和/或抗原序列的遗传算法。在这里，大小为n的镶嵌体的集合一次性解决，或者最好的单个镶嵌体可以被解决、固定和解决5个疫苗选项序列的互补的集合，以制造总共6个疫苗选项序列。采用这一策略来实现与以下描述的聚类策略直接比较。6)最佳自然法：该方法解决了n个疫苗选择序列的集合。确定集合中的自然菌株，其是最“表位核心”的，即它具有最常见的k聚体。为了找到它，对于给定的自然菌株中的每个k聚体，根据其在群体中的频率，可以将频率分配给该特定形式，然后将频率求和以量度自然菌株覆盖群体的程度。最高得分的自然菌株是最好的单株，nat.1。然后，可以从评分方案中消除由nat.1覆盖的k聚体，并且可以通过找出用于除了nat.1已经涵盖的那些表位以外的表位覆盖的最佳自然菌株，来选择nat.2的最佳补体。这是迭代地进行的，所以选择k个自然菌株，其中k是想要考虑的疫苗选择的数量，并且它们被排序，因此nat.1是最好的单株，nat.2是nat.1的最佳补体，nat.3是(nat.1+nat.2)的最佳补体。已经探索了根据以下一般策略设计的疫苗选择，将新的想法进行比较以具体为以前被设计以优化群体覆盖率的治疗性疫苗群体序列编址(address)。如果所有受试者都要获得相同的疫苗(这可能只较好地适用于保守区)，排序和定制没有完成-这些都是通用设计，并且不是针对每个个体进行优化：共有法：找到最佳覆盖群体的单个通用序列。对于该1-通用序列的候选者包括：群体共有，最佳单一ga镶嵌，表位基共序列和最“表位-核心”(“epi-centric”)的自然菌株。epigraph法：找到2或3个基于群体的序列，并将其提供给群体中的每一个。使用ga镶嵌、最佳自然菌株和顺序以及迭代镶嵌解决方案比较基于群体的策略。由于epigraphs现在是可用的，并且由于我们也可以排除罕见的表位而比镶嵌有改进，因此我们使用它们。相比之下，对于定制的疫苗，每个个体都将只获得与他或她的感染最佳匹配的疫苗序列：制造例如6个疫苗抗原序列，并选择最佳的疫苗序列，或这6个中的2或3个的最佳组合以递送给病人；即选择以最少的错配表位向病人的感染菌株提供最佳覆盖率的那些疫苗序列。探讨了这种情况的几种策略。a.对于最终的集合，完成利用k-均值类策略来创建6个聚类、1500次迭代(这些迭代中的每一个都是试验分解合并步骤，然后是一些常规迭代)的聚类序列，其定义用于疫苗集合的来自这6个聚类的质心序列。两个序列之间的距离被定义为一个减去一个序列表位比另一个序列的覆盖率。最初，使用6个随机选择的自然菌株来播种簇群。这给出了非常高度相关的6个质心序列的集合。确定如果表现出更多的自然多样性，则这将创造一套更好的试剂来创建定制的疫苗。接下来，6个簇群接种了大多数互补的6个自然(nat6)菌株，因为它们是非常独特的，然后重新分配基于簇群的核心作为表位基共序列，并且迭代地重新聚类和重新集中。将这一策略与用6种最佳自然菌株开始并将共有序列用作簇群质心而不是表位基共序列进行比较，而且该表位基共序列提供稍微较好的覆盖率。实施最小簇群大小也给出了稍微较好的覆盖率(尝试作为最小簇群大小的1、5和20)，因此将最小簇群大小作为约束被并入。最小大小为20优于1或5。要实现最小大小，如果在给定循环中，簇群大小的序列的数量低于最小大小，则这个“太小簇群”的成员将被从其他五个簇群重新分配到最佳质心。为了使新的簇群代替丢失的簇群，通过以下方式将与其质心相隔的平均距离最大的簇群分裂开：从簇群内取两个随机自然序列作为质心并围绕它们重新形成两个簇群，重新计算质心，并且使用这六个新的簇群进入下一步。这些簇群的质心非常接近树的核心。从序列中确定这是由于在主导信号的簇群内重复复制共有序列导致的。b.表位基共序列+(5个簇群核心)。在这里，首先使用epigraph算法(群体表位基共序列)为整个群体定义核心序列，将其固定以包含作为疫苗试剂。与群体表位基共序列相匹配的任何表位都被从聚类因素排除。序列与以前一样聚类，具有最小的大小，但是这个时间，5个簇群是基于所有潜在表位，在该表位基共序列中发现的那些除外，所以补充群体表位基共序列的簇群被靶向。这被确定为gag的最佳解决方案。通过包括在每个受试者的定制的疫苗中的群体表位基共序列，即使给定的最常见的k聚体在其抽样的hiv序列中不明显，则其也可能是潜伏或常见的反转形式，假定hiv的常见的氨基酸在普通的形式之间反复发生的话。来自5个簇群中的一个的第二互补序列随后将增加到疫苗和感染菌株之间可能的变异交叉反应。c.确定最佳的epigraph，添加5个镶嵌补体以获得六个(添加的5个没有排序)的集合，或确定最好的自然的，按顺序地添加5个自然的。经过广泛的比较和改进，我们赞成使用epigraph算法来定义定制的疫苗的簇群的核心。提供了用于在定制设计中制造的6种gag蛋白抗原的集合，其针对全球m组疫苗，当代b进化枝疫苗和南非的当代c进化枝疫苗。使用2个自然b进化枝序列、m组epigraphs、b进化枝epigraphs或定制的b进化枝的自然的当代b进化枝序列的覆盖率的比较如图6a-b所示；b进化枝定制的设计提供最佳的表位覆盖。各种情况可以用表3中所示的几个数字进行总结，其表示为m、c、t、a和p。这些在下文中针对每一类型以“药丸”(即疫苗抗原)的数量进行描述：m＝制造的，所创造的药丸总数，从其选择用于每个个体的一些子集。(通常我们假设m＝6以下)。c＝普通的，每个人获得的那些药丸，可能另外还有一些定制的药丸。t/a＝定制/替代品，t是给予每个个体的定制药丸(不是a替代品)的数量，可能与一些普通的药丸组合。p＝每个受试者总数(t+c)，给每个个体的药丸数。表3普通:每个人都得到相同的基于人群的疫苗:在表3中，有单条下划线的数字表明，自然序列中平均>60％的12聚体由疫苗覆盖(good)，而有双重下划线的数字表明，平均超过70％的12聚体不存在于自然菌株中。定制-为690个群体序列中的每一个选择6个中最好的1个：与仅仅为整个群体制造一个相比，没有好很多(0.54比0.51)，但如果6个疫苗将被制造，则c6-epi是最好的类型，并且根据他们的序列给受试者六个中的一个。来自六个的组的定制的最佳对混合定制的对–固定群体核心，增加5个质心中的1个以最佳补充固定序列，从而覆盖测试序列中的每一个--混合最好的三个–固定群体核心，增加5个质心中的2个以最佳补充固定序列，从而覆盖测试序列。普通:每个人都得到相同的基于群体的疫苗，1或2个疫苗抗原被递送:完全匹配1+5-epi-c5:并且被认为大小差一的匹配1+5-epi-c5:这些可能是最好的解决方案。进行了群体表位基共序列，排除了在用于聚类的表位基共序列中发现的12聚体。当群体表位基共序列是固定的，并且选择其他5个互补簇群的最佳表位基共序列与之配对时，完全相同的答案在选择这6个变体中的最佳对时获得。这意味着群体表位基共序列总是最佳对中之一。大小差一(offbyone)：对于上面的估计，只考虑了完美的匹配，对于用以在疫苗混合体和自然菌株之间匹配的表位，需要完美的12/12匹配。不匹配通常是良好耐受的，特别是对于ii类表位，如果匹配需要11/12的一致性，不匹配是10/12或更小，情形看起来更乐观。事实可能是在之间的某个地方，10/12在某些情况下也是可以接受的。这里可能最好的选择是与可比较的最佳自然菌株选项进行比较，具有完美匹配：完美匹配(从上表中提取)：以及被认为大小差一的匹配:三个药丸，一个通用的(对于每个人都一样)。和两个定制的药丸，剩下的五个中的最佳的一对。实施例4：进化枝bhiv-1“定制的”抗原混合体的设计和优化。在群体层面的hiv多样性始于每个受感染宿主内的快速发展。宿主内部的多样性中的大部分是免疫逃避的直接后果(bar,k.j.2012.plospathog8:e1002721.,liu,m.k.2013.j.clin.invest.123:380-93)，以及逃避变体在感染后不久出现(fischer,w.2010.plosone5:e12303)。预防性疫苗的目的是快速消除感染菌株或防止其首先感染。由于不知道哪种菌株将被传播，因此，预防性疫苗必须引发对任何可能遇到的变体都会有活性的免疫反应。相比之下，免疫治疗可以针对给定宿主中存在的已知病毒群体，因此预防和治疗性hiv疫苗必须考虑这些不同的要求来设计。如图7所示，镶嵌解决方案针对给定的hiv群体接近最大可能的表位覆盖率，该图还显示了hiv蛋白的保守性差异，其中gag、nef和pol的较大片段是高度保守的，而大多数env以及大多数小的辅助蛋白(数据未显示)是高度可变的。虽然镶嵌体在群体中为预防性疫苗提供表位覆盖的接近最佳的解决方案，但是它们不利用有关知道靶向治疗环境中的感染菌株的序列的附加信息。定制疫苗设计策略的实现要求：制造可管理数量的疫苗试剂，其最大限度地捕获目标群体的表位多样性；从受感染的疫苗接受者对hiv进行测序；并且然后从疫苗试剂池中选择最佳匹配受试者的抗原插入片段的子集。因此，定制的疫苗策略在概念上与镶嵌疫苗设计不同。已在美国采样的大约150,000个hiv序列中有98％是进化枝b。使用目前可从losalamoshiv数据库获得的美国样本b进化枝gag序列。在该集合(seqidno：1-690)中有690个完整的gag序列，每个衍生自不同感染的受试者，其代表美国hiv病毒株的多样性的切片。为了使假设的疫苗中t细胞表位覆盖率最大化，同时固定需要包含在疫苗混合体中的不同gag序列的数目，设计了一种新颖的计算策略，其将表位基共有(或“episensus”)序列算法与k-均值类聚类一起使用。与在对齐的每个位置中占据最常见的氨基酸的简单的共有序列不同，该表位基共序列寻求在对齐的每个位置开始的最常见的表位(例如12聚体)。然而，不能简单地在每个位置获取最常见的表位，因为表位重叠，并且其可能导致附近氨基酸中的冲突。目标是以一种能够通过疫苗导致群体最大表位覆盖率的方式处理这些冲突。为了定义用于制造的代表群体表位多样性的小的抗原集合，使用k-均值类方法将690个gag序列基于表位相似性分成不同的簇群，并且为每个簇群生成作为簇群的核心序列的单独的表位基共序列。5-6个簇群之后个体变体的覆盖率趋于稳定，并且6个具有6种hiv抗原变体的疫苗载体的制造是可行的，因此最初靶向了6种抗原的集合。该算法以6个随机选择的自然菌株作为初始质心序列开始，并将每个剩余序列分配给6个中最接近的一个。在6个簇群中的每一个中，基于该簇群中的序列中的表位基共序列来计算新的质心序列。然后根据新质心中的最接近的那一个，重新分配所有序列。该过程收敛于用于设计6种疫苗抗原的k均值类优化，其被认为是单个簇群的表位基共序列的质心，并且这些抗原可以用作制造的集合，从中选择为特定疫苗提供最佳匹配的那些。发现杂交方法以显著改善表位的覆盖率，同时最大限度地减少潜在的疫苗特异性反应的增加。在杂交策略中，为整个群体(群体表位基共序列)计算核心序列，随后的聚类完全基于核心序列中未发现的表位。通过这种方式，簇群表位基共序列对群体表位基共序列进行了补充。因此，6-序列试剂库由一个群体表位基共序列和五个互补簇群表位基共序列组成，受试者将被给予双抗原定制的疫苗，该群体表位基共序列与最佳互补序列配对。该策略在参考集合中产生更多样化的序列，并且改善测试群体中的自然gag序列的潜在覆盖，如表4所示。表4.通过不同疫苗导致的在美国进化枝bgag中的潜在表位的平均每个菌株的覆盖率。针对690个变体中的每一个变体来制造一种定制的疫苗，即2-或3-抗原设计，该每一个变体选自群体表位基共序列和5个簇群的衍生的互补序列。将其与基于群体的疫苗策略的潜在表位覆盖进行比较，其中每个接种者将被给予相同的疫苗，或者镶嵌的或最佳自然的组合。“递送”表示将包含在疫苗混合体中的抗原数。“制造”表示需要合成的疫苗抗原基准池的大小，以针对将被使用的定制的方法从其中选择。“％匹配”表示每个自然gag变体和疫苗之间完全匹配的潜在表位的平均数目；该值越高，疫苗反应越有可能与自然变体交叉反应。“％不匹配”表示在给定的自然gag序列中未发现的疫苗中潜在表位的比例，分别对690个序列中的每一个进行计算，然后平均。该值越高，疫苗引起可能减损交叉反应性反应的疫苗特异性反应的潜力就越大。改进因素表明，使用被建议的新疫苗设计选项与使用单一最佳自然菌株相比，覆盖率增大。对于12聚体优化的定制疫苗解决方案对于9聚体几乎是最佳的，反之亦然，因此，如表5所示，基于12聚体的簇群对于i类和ii类表位呈现都应该是良好的。表5.当计算2-蛋白定制设计的平均覆盖率时，使得在9聚体或12聚体评估中的单个氨基酸失配能被认为是正匹配。最后，如果在潜在表位中容忍12个错配中的1个错配，而不是要求完全一致，则定制的疫苗方法理论上表现非常好(表5)；鉴于这种更宽松，也许在生物学上更实际的测量，约90％的针对定制疫苗的疫苗应答与匹配的自然gag中的表位会是交叉反应的。就最大化gag序列的表位覆盖率和将潜在有害的疫苗特异性表位最小化两者而言，定制的疫苗方法优于群体镶嵌、共有序列和最佳自然菌株(图8)。该代码也可以使用多个序列不是使用一个代表应用于定制疫苗，每个序列来自受感染的个体，并探索将定制的疫苗设计策略应用于不同的群体(南非的c进化枝流行病、泰国的2-进化枝区域流行病、和全球m组集合)。当感染菌株已知时，定制的疫苗抗原可以提供对自然序列的更好的覆盖(与基于群体的抗原相比)。实施例5：双重表达载体使用本文所述的群体表位基共序列抗原和/或定制的抗原，产生双重表达载体，其中每个表达完整的gag抗原和第二hiv抗原。第二hiv抗原可以是例如逆转录酶(rt)和nef的核心部分的融合蛋白。整合酶不包括在内，因为它是t细胞反应的相当差的刺激物。使用cmv载体(例如rhcmv或hcmv载体)作为双重表达载体，可以同时将t细胞诱导至两种不同的siv或hiv抗原。例如，产生含有基于所开发的epigraph算法的定制的gag序列的多达六个hcmv载体的小组(表达gag群体表位基共序列抗原的一个载体和每个表达互补簇群基的gag抗原的五个载体)，以及还设计了覆盖rt和nef核心区域的抗原的小组。提供了表达gag群体表位基共序列抗原的一个载体加上每个表达可以从五种基于互补簇群的抗原中选择的不同gag抗原的两个载体。这些载体也可以包含两个互补的hiv-1epigraphrt/nef序列中的一个。当由于这些序列的高度保守性而不能预测定制改善覆盖时，保留2个镶嵌的解决方案并将其用于载体。例如，一个rt/nef镶嵌体被包括在群体表位基共序列载体中，另一个用于定制的载体中。可以通过对所得载体进行测序并表征它们在体外的抗原表达和生长来产生可以进入疫苗生产的一组基于hcmv的疫苗载体。生成对应于gag、rt和nef镶嵌体以及实施例3中设计的定制抗原的合成密码子优化的dna插入片段。实施例6：使用epigraph方法开发的病毒抗原的瞬时表达。设计用于使用epigraph算法使表位频率最大化的抗原类似于自然序列，但不再编码自然蛋白。虽然用于这些人工序列的表达的理论指导原则在这些序列的构建中得到遵守，但是通过它们编码的蛋白质可能表现出未预期的表达谱或不能表达稳定的全长蛋白。为了评估这些序列在哺乳动物细胞的上下文中的表达谱，epigraph序列被合成并克隆用于瞬时转染。合成编码这些构建体的dna(genscript，piscataway，nj)以含有质粒载体的相容克隆位点(pcdna3.1和pori)。所有插入片段针对相应的宿主(恒河猴、siv或人类、hiv)进行密码子优化。还修饰了每种构建体以消除自然序列的残留酶活性，如kulkarnietal.vaccine(2011)中所述。删除的位置是基于相对于进化枝bepigraph-1的氨基酸序列。删除的氨基酸包括：与蛋白酶活性相关的“dtg”(位置81-83)、与逆转录酶活性相关的“ymdd”(位置338-341)、与rnaseh活性相关的“e”(位置633)、与整合酶活性相关的“d”(位置779)、与整合酶活性相关的“d”(位置831)以及与整合酶活性相关的“e”(位置867)。合成dna在水中再水合并用限制性内切核酸酶(5'nhei，3'bamhi)消化，然后热灭活。质粒载体用兼容的核酸内切酶线性化，并用小牛肠磷酸酶处理，以防止空载体再循环。通过琼脂糖凝胶电泳解析载体和插入片段，以确定消化片段大小，并通过pcr纯化试剂盒(thermoscientific)清洗以进行连接。在室温下，插入片段通过使用快速连接试剂盒(roche，indianapolis，in)以插入片段与载体为约3:1的比例连接到线性化载体持续15分钟，转化成化学感受态的大肠杆菌(dh5-α)，并接种于抗生素选择板上。通过插入片段的限制性消化，筛选来自所得菌落的dna。使含有相对于载体启动子和聚(a)序列的适当取向上的每个正确插入片段的克隆在液体培养物中生长以用于质粒dna纯化。在12孔组织培养板中积极生长的亚汇合hela细胞接收500ul新鲜培养基(dmem10％fbs)，同时制备脂质体。为了产生含有质粒dna的脂质体，将250ul无血清培养基与500ng质粒dna混合，以及将250ul无血清培养基与2μl脂质(lipofectamine2000，invitrogen)混合。在室温下孵育5分钟后，将这些溶液合并、混合并孵育20分钟。将在该过程中形成的含有脂质体的dna(500ul)滴加到培养物中并使其温育12-16小时，之后用新鲜培养基代替转染混合体。培养另外一天后，通过刮除和离心收获培养物。通过抽吸除去上清液，并且细胞沉淀在含有5％sds和10％2-巯基乙醇的100ul凝胶加载染料中通过重悬浮而裂解且经由qiashred柱(qiagen，valencia，ca)离心。通过sds聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)和以用于v5的抗体或工程改造到每个构建体中的血凝素表位标签开发的蛋白免疫印迹法来证明epigraph蛋白的表达。简言之，10％聚丙烯酰胺凝胶被制备并加载10ul(每个样品的10％)，并在110-120伏下电泳90分钟。将解析的蛋白通过半干印迹法在20伏下转移至pvdf膜持续45-50分钟。用10％脱脂干奶粉在含有0.1％吐温-20(pbs-t)的磷酸盐缓冲盐水溶液中封闭非特异性结合60分钟。将ha(sigma)或v5(santacruz)抗体在5％乳溶液中稀释，并与膜一起孵育1小时，随后用pbs-t洗涤3次，然后加入1：2000稀释的辣根过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠(santacruz)二级抗体1小时。随后，将印迹在pbs-t中洗涤三次，并用酶联化学发光(ecl试剂盒(thermo-pierce))显影，并用x射线胶片显现。所有测试的构建体证明了预测的分子量的蛋白质的稳健瞬时表达，并确认其在cmv载体主链中的测试实用性(例如，参见图9a-c)。实施例7：将epigraph设计的抗原工程改造为cmv载体bac构建体和来自重构病毒的表达。epigraph抗原被设计为最大化代表病毒序列谱和产生病毒序列的hiv的进化枝的t细胞表位的覆盖率。为了最有效地利用这些抗原，已经将其改造成了cmv载体，cmv载体已经证实三倍于竞争平台的cd8+t细胞光谱。广泛抗原呈现和cmv载体的终身表达谱已经证实了保护和治愈感染siv的恒河猴的能力。结合cmv载体的epigraph抗原设计算法可以在应用于广泛预防性疫苗或专注于定制的疫苗时，在进化枝内和跨越进化枝提供甚至更大的hiv覆盖。在瞬时转染系统中证明表达的epigraph序列被亚克隆到重组质粒(pori)中，并使用bac重组转移到cmv主链中。(messerleetal.procnatlacadsciusa.1997dec23；94(26):14759-63；和borstetal.jvirol.1999oct；73(10):8320-9)。在含有亲本bac的大肠杆菌菌株el250的上下文中，bac重组促进使用温度和代谢调节重组酶处理大dna序列。重组是一种连续两步法，其包括：将具有抗生素抗性基因的抗原序列(卡那霉素)插入靶区域，随后除去卡那霉素盒。使用具有长(50+bp)的同源性臂的引物，通过pcr从含有目的抗原的模板dna加卡那霉素来扩增插入片段。为了制备用于插入步骤的细菌细胞，将5ml培养物在30℃下用氯霉素在luriabroth(lb)中生长过夜，并在第二天早晨稀释至50ml。细菌在30℃下生长约3-4小时(至od＝0.6)，然后在42℃下振荡15分钟热休克，以诱导重组酶。诱导后，将细菌沉淀(3000rpm，10分钟，4℃)，然后在冰冷水中洗涤3次。大肠杆菌细胞被赋予电转感受态，以接收pcr产物并且被赋予重组感受态以将该序列插入到bac的靶区域中。将纯化的插入片段(500ng)与冰冷的100ul感受态大肠杆菌合并，移至0.2cm比色皿(fisher)，并使用bio-radmicropulser装置电穿孔。电穿孔后，通过加入900ullb培养基稀释细菌，并在30℃下回收2小时，然后在氯霉素/卡那霉素平板上铺板。将板在30℃下孵育两天，通过限制性消化和pcr筛选菌落以用于重组事件。将对重组呈阳性的bac构建体进行到第二步，其中通过由旁侧frt位点介导的flip重组酶的阿拉伯糖诱导来切除卡那霉素盒。使5ml培养物在lb+氯霉素中生长过夜，第二天早晨稀释1:10。经过三个小时的生长，细菌用l-阿拉伯糖(arcos，0.1％终浓度)处理，并在30℃下诱导1.5小时。诱导后，将细菌在氯霉素板上划线，并在30℃下孵育两天。然后将菌落复制铺在氯霉素/卡那霉素和氯霉素板上，筛选失去卡那霉素抗性的克隆。通过限制性消化和pcr进一步筛选这些克隆以确认构建体。病毒重建：为了再生病毒，将bacdna转移到允许病毒生长的哺乳动物宿主细胞中。将从10ml过夜培养物纯化的bacdna电穿孔成约1/5汇合烧瓶的调聚的成纤维细胞(约20万个细胞)。简言之，将细胞沉淀(1,500rpm，5分钟)并重新悬浮于700ulopti-mem中。然后将该细胞混合体加入到50μl的bacdna中，并轻轻混合，然后转移到4mm比色皿。使用bio-radgenepulserii在0.25kv和0.95uf下进行电穿孔。电穿孔后，将细胞接种到含有dmem+10％fbs的100mm培养皿中，并在第二天更换培养基以除去细胞碎片。每天观察细胞形成斑块，并在完全cpe下收获细胞。剩余的附着细胞通过细胞刮刀收集，通过离心(1,500rpm，5分钟)沉淀，并保留含有重构病毒载体的上清液以使重组病毒通过。通过在含有5％sds和10％2-巯基乙醇的100ul凝胶加载染料中再悬浮，并通过qiashred柱(qiagen，valencia，ca)离心来裂解细胞沉淀。病毒epigraph表达：通过sds聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)和以用于v5的抗体或工程改造到每个构建体中的血凝素表位标签开发的蛋白质印迹法来证明epigraph蛋白质的表达。简言之，10％聚丙烯酰胺凝胶被制备并加载10ul(每个样品的10％)，且在110-120伏下电泳90分钟。将解析的蛋白质通过半干印迹法在20伏下转移至pvdf膜持续45-50分钟。用10％脱脂干奶粉在含有0.1％吐温-20(pbs-t)的磷酸盐缓冲盐水的溶液中封闭非特异性结合60分钟。将ha(sigma)或v5(santacruz)抗体在5％乳溶液中稀释，并与膜一起孵育1小时，随后用pbs-t洗涤3次，然后加入1：2000稀释的辣根过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠(santacruz)二级抗体1小时。随后，将印迹在pbs-t中洗涤三次，并用酶联化学发光(ecl试剂盒(thermo-pierce))显影，且用x射线胶片显现。所有测试的构建体证明了预测的分子量的蛋白质的稳健瞬时表达，从而证实其在恒河猴cmv疫苗模型中的免疫原性测试的实用性(例如，参见图10a-b)。实施例8群体epigraph疫苗：使用epigraph算法以最初使用cmv载体创建疫苗抗原的集合，然而，可以利用其他疫苗递送系统。m组(全球)被考虑，以及b和c进化枝(对这些特定进化枝是流行性的地区，地理位置上使用受限)，gag、pol和nefepigraph疫苗抗原被生成-。b和m组被表达。基本的epigraph设计属性：epigraphs使用图形理论/动力学编程方法来设计使潜在t细胞表皮抗原(pte)覆盖率最大化的抗原。在某些条件下，它们在数学上是最优的，而且它们的计算效率非常高。相对于镶嵌抗原，epigraph具有额外的实际效益，因为排除构建体中更罕见的表位的益处可以通过承受微型pte覆盖率成本来平衡。这些epigraph的设计考虑到这一点，允许微小的覆盖率成本(0.005)，以确保甚至在许多群体序列(精确数量取决于输入数据集合)中观察到epigraph抗原中表示的最罕见的表位。大约在2014年9月，这些epigraphs的输入数据集合是从用于蛋白质(gag、pol和nef)中的每一种的hiv数据库序列对齐集合获得的，包括一个序列/人。不完整的序列被排除。这为每个蛋白质集合留下以下数量的序列，nseqs是输入对齐中的序列数。使用用于未对齐序列的epigraph算法来顺序地解决了用于二价疫苗的配对的epigraph抗原的集合。使用顺序解决方案，其允许分离使用第一epigraph作为单价疫苗。这意味着它们被设计成使得最好的单独的epigraph抗原(“表位基共序列”)首先被得到，以提供群体的最佳pte覆盖，然后被固定以包含在二价设计中。然后解决互补，以通过包含第一epigraph(即表位基共序列)的二价抗原对提供最佳群体pte覆盖。相对于同时的抗原解决方案，覆盖成本是最小的。然后进行分析以确定排除罕见变体的覆盖成本。数据总结在下表中。fo是罕见的表位阈值。在丢弃出现在fo或更少序列中的所有pte之后产生序列。换句话说，疫苗中的每个pte都已经出现在比fo较多的序列中。这些fo的值尽可能大，同时达到在fo＝0时达到的最大覆盖率的0.005以内的覆盖率。nseqs是输入对齐中的序列数。蛋白进化枝nseqfogagb172941gagc94021gagm4596146nefb178050nefc74914nefm4040100polb107234polc41411polm278067基本的epigraph抗体被设计作为全蛋白，并且它们被表达在cmv载体中并且被测试为gag/nef融合蛋白，或者具有为了安全而制造的缺失的pol，或作为被融合的gag和nef的最保守的区域或被融合的pol的最保守的区域。用于在cmv载体中表达的全蛋白形式的每个的列表包括在下文，其中实施例用于m组和b进化枝。疫苗抗原的保守区从全长epigraph蛋白中切除。gag、pol和nef内的保守区是基于二价(即2抗原)疫苗对pte覆盖的潜力而定义的。也就是说，它们基于两种优化抗原的潜力来提供对b进化枝的pte覆盖。保守区的序列如下列所示。选择边界以捕获可能的最长连续片段中三种蛋白质(gag、pol和nef)中的每一种的最保守的一半，因此保守区分布有更多的可变区段。在gag中，边界简单地反映p24衣壳蛋白的边界。实施例9：定制的治疗性抗原对于定制的抗原，或gag或gag最保守的部分，使用p24。对于一种设计，使用了4596个序列的全m组2015个对齐，以提供全球解决方案。分离了在美国的对齐的189个当代b进化枝序列，或者来自南非的对齐的199个当代c进化枝序列。“当代”是指2004年后分离的病毒；在过去十年中采样的所有序列都用于从每个区域获得合理的序列采样。排除未完全解决或不完整的序列。选择区域亚型特异性的当代病毒，因为它们代表了群体的良好匹配，其可能是用于评估定制疫苗的概念研究的初步证据；通过使用单一亚型区域集，我们可以限制群体多样性，以增加hiv治疗性疫苗的成功的潜力。这些治疗性疫苗抗原被设计用于治疗方案，其中它们可以与接受疫苗的人的被测序的感染病毒匹配或针对其“定制”。将制造6种疫苗抗原，来自该集合的与感染病毒的个体的最佳匹配的2或3种将被给予个体，以使疫苗与其感染菌株之间的匹配最大化。因此，下面提供了用于每个epigraph的全gag，以用于6种定制的抗原的制造解决方案，其中p24为粗体。或gag或更保守的p24可用于定制的疫苗。对于gag蛋白质或内部p24区域，匹配的pte得分和不匹配的得分(额外数量)，用于从m个的库中递送n个最佳匹配的抗原，其中选择n以最好地覆盖在目标群体中的每个单独序列。目标群体是在南非采样的当代c进化枝感染群体，或在美国抽样的当代b进化枝群体。最好的解决方案是使用m＝6个抗原的库，并且是粗体；这些是基于上面显示的六个序列。南非c进化枝gag的表位覆盖nm覆盖率额外针对数据集合评估的疫苗110.39886318.437mepigraph220.57907681.980mepigraph110.59591200.809cepigraph220.70758550.618cepigraph230.71875559.206c定制的330.73852778.603c定制的240.72609550.397c定制的340.75294805.658c定制的250.73124549.452c定制的350.75975800.337c定制的260.73440527.623c定制的360.76513767.759c定制的南非c进化枝p24的表位覆盖nm覆盖率额外针对数据集合评估的疫苗110.48548114.739mepigraph220.76864230.593mepigraph110.7352559.040cepigraph220.84494204.578cepigraph220.84494204.578c定制的230.86153205.387c定制的330.88154338.417c定制的240.87000188.307c定制的340.89175290.854c定制的250.87699187.849c定制的350.89945295.930c定制的260.87996191.538c定制的360.90373290.985c定制的美国b进化枝gag的表位覆盖nm覆盖率额外针对数据集合评估的疫苗110.55488237.815mepigraph220.67323629.333mepigraph110.61174195.720bepigraph220.72471553.899bepigraph230.73615557.254b定制的330.75734786.772b定制的240.74354547.725b定制的340.76973762.524b定制的250.74786546.111b定制的350.77777779.487b定制的260.75226536.619b定制的360.78669773.000b定制的美国b进化枝p24的表位覆盖nm覆盖率额外针对数据集合评估的疫苗110.7313159.979mepigraph220.84204214.296mepigraph110.7642152.646bepigraph220.87373201.233bepigraph230.88878194.434b定制的330.90810297.571b定制的240.89779190.635b定制的340.91754282.386b定制的250.90461191.794b定制的350.92704285.005b定制的260.90859187.889b定制的360.93556280.704b定制的实施例10：疫苗测试用于cmv初步测试的疫苗臂包括：1)单个群体表位基共序列gag抗原，其为美国b进化枝流行病的核心；2)群体表位基共序列加定制的gag蛋白，其被选为是最佳匹配的自然hiv-1菌株；3)群体表位基共序列加定制的gag蛋白，其被选为是最佳匹配的不同的(和远距离的)自然hiv-1菌株；4)群体表位基共序列加来自队列2和3的gag蛋白两者。使用与疫苗抗原相对应的重叠的15聚体肽(4个氨基酸重叠)分析所得的免疫应答(以确定总疫苗诱导的gag特异性应答)，然后使用与“目标”hiv-1株菌和选定的非目标hiv菌株(见下文)相对应的重叠的15聚体肽(4个氨基酸重叠)分析所得的免疫应答，以测量菌株特异性应答和表位匹配水平(比较目标与非目标hivgag序列)。确定计算设计的插入片段和载体组合是否为目标菌株提供更高的幅度和更广泛的t细胞应答，同时最小化非目标菌株匹配应答。该分析的结果使得能够对实施例1中产生的表位匹配的预测进行实验测试。5个恒河猴(rm)的四个队列用106pfu的hcmv载体接种如下：队列1接收含有进化枝b表位基共序列的单个载体，队列2接收表位基共序列载体加单个定制的疫苗载体，队列3接受表位基共序列加不同的定制疫苗载体，并且队列4接受表位基共序列加定制的疫苗载体。这些疫苗针对2种被传播的代表/创始人hiv菌株进行“定制”，这些hiv菌株选自9个hiv感染美国b进化枝的小组，纵向进行了广泛的测序；该小组代表自然感染谱，其与人类临床试验中可能遇到的相当。实质上，这2种不同的自然菌株被用作原型病者。针对一种优化的表位基共序列/定制疫苗插入片段对使得另一种将是次优的，反之亦然，从而使得(通过确定对反映每个菌株特异性序列的肽集合的交叉识别)能相互分析是否有益于我们的定制序列匹配策略。除了这种相互分析之外，来自其他7种感染的序列将在其与所选择的疫苗载体插入片段的相对“匹配”中变化，并且通过分析对反应这其他7种hiv病毒株的序列的肽集合的应答，对载体插入序列与载体组合之间的有关匹配与不匹配的响应的幅度和宽度的关系进行综合分析。专注于这9种菌株的集合的一部分动机是从纵向样品能获得仔细测序的全长基因组。分离物也可用作感染性分子克隆，其可用于评估随后的人类研究中的应答。因此，通过使用该集合在rm中进行基础研究，当将这些疫苗推进到人类研究中时，会有特别有用的匹配的蛋白的集合用于猕猴和人类反应之间的直接比较。多个恒河猴(rm)在第0天和第12周皮下接种，并且纵向(longitudinally)跟踪1年。由于hcmv载体的接种不受预先存在的抗rhcmv免疫的影响，所以将自然感染rhcmv的动物用于这些实验。使用流式细胞计数细胞因子分析(ics)来确定包含在每个动物施用的疫苗插入片段中的疫苗序列的各个连续15聚体肽的cd4+和cd8+t细胞应答(其将包括总疫苗引发的应答)。然后确定这些表位特异性t细胞是否识别目标菌株和其他8种非目标菌株中的表位变体。对于显示对菌株特异性表位的应答的肽，这些对“亲本”(疫苗插入片段序列)肽变体的反应的幅度、功能亲和力和功能特征(ifn-γ、tnf-α、il-2和mip-1β产生和cd107外部化)进行比较以确定功能交叉反应性的程度。在选择的情况下，使用截断分析来鉴定核心表位以进行类似的比较分析。为了确定存在的mhc-ii受限制的cd8+t细胞的百分比，其“阻断”对mhc-1和mhc-ii有特异性的mab，以及不变链来源的mhc-ii特异性结合肽clip用于抑制流感特异性cd8+t细胞在pbmc中的应答，如先前已经对siv应答所做的那样。不管与载体特异性基因相关的t细胞引发结果如何，免疫学分析使得能够测试假说，该假说即，与非定制疫苗相比，就给定的自然hiv库的表位覆盖率而言，由定制疫苗诱导的t细胞是优异的。定制的2种抗原混合体可以产生t细胞应答，与单独的表位基共序列相比，其对匹配的自然菌株具有至少高25％的交叉反应性应答频率(表5)。还进行测试来确定混合体中包含3种互补的定制抗原是否诱导更多的交叉反应性，或者抗原稀释或通过添加3种而不是2种抗原而导致存在更多数目的疫苗特异性表位是否实际上会减少对自然蛋白的交叉反应性应答的幅度或广度。相比于以前针对其他载体所报道的，预计基于cmv的t细胞应答将会更宽广，由此覆盖高得多的序列百分比。因此，即使有相对较少数量的动物，应有足够的表位应答来评估序列变异对应答的交叉反应潜力的影响。通过使用疫苗匹配的肽的集合来确定对疫苗的所有应答的数量和幅值。一旦确定了目标肽，则仅使用在每种动物中为阳性的那些肽，确定自然变异对每种疫苗应答肽的影响。测试的自然变体是基于基准组中发现的变异，包括定制和不良匹配的gag。非参数和计算重采样统计方法被用作评估表位变异对减小幅值或消除识别的影响的主要工具。然而，通过根据需要使用广义线性模型来探索更复杂的相互作用对t细胞应答交叉反应性的影响，这些分析是相辅相成的。seqidno:691定制的疫苗抗原表位基共序列.mgarasvlsggeldrwekirlrpggkkkyklkhivwasrelerfavnpglletsegcrqilgqlqpslqtgseelkslyntvatlycvhqkievkdtkealdkieeeqnkskkkaqq-------aaadtgnss---------qvsqnypivqnlqgqmvhqaisprtlnawvkvveekafspevipmfsalsegatpqdlntmlntvgghqaamqmlketineeaaewdrlhpvhagpiapgqmreprgsdiagttstlqeqigwmtnnppipvgeiykrwiilglnkivrmysptsildirqgpkepfrdyvdrfyktlraeqasqevknwmtetllvqnanpdcktilkalgpaatleemmtacqgvggpghkarvlaeamsqvtn--satimmqrgnfrnqrktvkcfncgkeghiarncraprkkgcwkcgkeghqmkdc--terqanflgkiwpsh-kgrpgnflq--------srpept-----------appeesfrfgeetttps----------qkqepidke-----lyp-laslrslfgndpssqseqidno:692定制的疫苗抗原1序列.mgarasvlsggeldkwekirlrpggkkkyrlkhivwasrelerfavnpglletsggcrqileqlqpslqtgseelrslyntvatlycvhqkidvkdtkealekieeeqnkskkkaqq-----aaaaadtgnns---------qvsqnypivqnmqgqmvhqalsprtlnawvkvieekafspevipmftalsegatpqdlntmlnsvgghqaamqmlketineeaaewdrvhpvhagpvapgqmreprgsdiagttstlqeqigwmtsnppipvgeiykrwiimglnkivrmysptsildikqgpkepfrdyvdrfyktlraeqatqevknwmtetllvqnsnpdcktilkalgpgatleemmtacqgvggpshkarvlaeamsqatn--satimmqkgnfrnqrkivkcfncgkeghiakncraprkkgcwkcgreghqmkdc--terqvnflgkiwpsh-kgrpgnflq--------nrpept-----------appaesfrfgeetttpp----------qkqepidke-----lyp-laslkslfgndpssqseqidno:693定制的疫苗抗原2序列.mgarasvlsggkldkwekirlrpggkkryklkhivwasrelerfavnpglletaegcrqilgqlqpalqtgseelkslfntvatlycvhqridvkdtkealekieeeqnkskkkaqp-------aaadtgsss---------qvsqnypivqnmqgqmvhqaisprtlnawvkvieekafspevipmfaalsegatpqdlnlmlntvgghqaamqmlketineeaaewdrlhpvhagpvapgqmreprgsdiagttstlqeqigwmthnppipvgeiykkwiimglnkivrmysptsildikqgpkepfrdyvdrfyktlraeqatqevknwmtetllvqnsnpdcktilkalgpgatleemmtacqgvggpshkarvlaeamsqatn--satimmqrgnfknqrktikcfncgkeghiakncraprkkgcwkcgreghqmkdc--terqanflgkiwpsh-kgrpgnflq--------nrpept-----------appaesfrfgeetttpp----------qkqepidke-----lyp-laslkslfgndpssqseqidno:694定制的疫苗抗原3序列.mgarasvlsggeldkwekirlrpggkkkyrlkhivwasrelerfavnpglletaegcrqileqlqpslqtgseelrslyntvavlycvhqridvkdtkealdkieeeqnkskkkaqq-----aaaaadtgnns---------qvsqnypivqnlqgqmvhqpisprtlnawvkvieekafspevipmftalsegatpqdlntmlntvgghqaamqmlkdtineeaaewdrlhpvqagpiapgqireprgsdiagttstlqeqiawmtnnppipvgdiykrwiilglnkivrmysptsildikqgpkepfrdyvdrfyktlraeqasqdvknwmtetllvqnsnpdcktilkalgpgatleemmtacqgvggpshkarvlaeamsqatn--satimmqkgnfrnqrkivkcfncgkeghiakncraprkkgcwkcgreghqmkdc--terqanflgkiwpss-kgrpgnflq--------srpept-----------appaesfrfgeetttpp----------qkqepidke-----lyp-laslkslfgndpssqseqidno:695定制的疫苗抗原4序列.mgarasvlsggkldkwekirlrpggkkkyrlkhivwasrelerfavnpglletaegcrqilgqlqpalqtgseelrslyntvatlycvhqrievkdtkealekieeeqnkskkkvqq------aaaadtgnsn---------qvsqnypivqniqgqmvhqplsprtlnawvkvieekafspevipmftalsegatpqdlntmlntigghqaamqmlketineeaadwdrlhpvhagpvapgqmreprgsdiagttsnlqeqigwmtsnppipvgeiykrwiimglnkivrmysptsildikqgpkepfrdyvdrfyktlraeqasqdvknwmtetllvqnsnpdcktilkalgpgatleemmtacqgvggpshkarvlaeamsqvtn--satimmqkgnfrnqrkivkcfncgkeghiakncraprkrgcwkcgkeghqmkec--terqanflgkiwpsy-kgrpgnflq--------srpeps-----------appeesfrfgeetatps----------qkqepidke-----lyp-laslkslfgndpssqseqidno:696定制的疫苗抗原5序列.mgarasvlsggkldkwekirlrpggkkqyklkhlvwasrelerfavnpglletaegcrqilgqlqpalqtgseelkslfntvatlycvhqridvkdtkealekieeeqnkskkkaqq-------aaadtgnns---------qvsqnypivqniqgqmvhqalsprtlnawvkvieekafspevipmfsalaegatpqdlntmlntvgghqaamqilketineeaaewdrlhpvqagpvapgqmreprgsdiagttsnlqeqiawmthnppipvgeiykrwiimglnkivrmyspvsildirqgpkepfrdyvdrfyktlraeqasqdvknwmtetllvqnsnpdcktilkalgpgatleemmtacqgvggpshkarvlaeamsqatn--patimmqrgnfknqrkivkcfncgkeghiakncraprkkgcwkcgkeghqmkec--terqanflgkiwpsy-kgrpgnflq--------srpeps-----------appeesfrfgeetttpp----------qkqepidke-----lyp-ltslrslfgndpssqseqidno:697epigraph抗原1序列.mgarasvlsggeldrwekirlrpggkkkyklkhivwasrelerfavnpglletsegcrqilgqlqpslqtgseelkslyntvatlycvhqridvkdtkealdkieeeqnkskkkaqq-------aaadtgnss---------qvsqnypivqnlqgqmvhqaisprtlnawvkvveekafspevipmfsalsegatpqdlntmlntvgghqaamqmlketineeaaewdrlhpvhagpiapgqmreprgsdiagttstlqeqigwmtnnppipvgeiykrwiilglnkivrmysptsildirqgpkepfrdyvdrfyktlraeqasqevknwmtetllvqnanpdcktilkalgpaatleemmtacqgvggpghkarvlaeamsqvtn--satimmqrgnfrnqrktvkcfncgkeghiarncraprkkgcwkcgkeghqmkdc--terqanflgkiwpsh-kgrpgnflq--------srpept-----------appeesfrfgeetttps----------qkqepidke-----lyp-laslrslfgndpssqseqidno:698epigraph混合体抗原1.mgarasvlsggeldrwekirlrpggkkkyklkhivwasrelerfavnpglletsegcrqilgqlqpslqtgseelkslyntvatlycvhqridvkdtkealdkieeeqnkskkkaqq-------aaadtgnss---------qvsqnypivqnlqgqmvhqaisprtlnawvkvveekafspevipmfsalsegatpqdlntmlntvgghqaamqmlketineeaaewdrlhpvhagpiapgqmreprgsdiagttstlqeqigwmtnnppipvgeiykrwiilglnkivrmysptsildirqgpkepfrdyvdrfyktlraeqasqevknwmtetllvqnanpdcktilkalgpaatleemmtacqgvggpghkarvlaeamsqvtn--satimmqrgnfrnqrktvkcfncgkeghiarncraprkkgcwkcgkeghqmkdc--terqanflgkiwpsh-kgrpgnflq--------srpept-----------appeesfrfgeetttps----------qkqepidke-----lyp-laslrslfgndpssqseqidno:699epigraph混合体抗原2.mgarasvlsggkldkwekirlrpggkkkyrlkhivwasrelerfalnpglletaegcrqilgqlqpalqtgseelkslfntvatlycvhqkidvkdtkealekieeeqnkskkkaqq-----aaaaadtgnns---------qvsqnypivqnmqgqmvhqalsprtlnawvkvieekafspevipmftalsegatpqdlnlmlntvgghqaamqilketineeaadwdrlhpvhagpvapgqmreprgsdiagttsnlqeqigwmtsnppipvgeiykrwiimglnkivrmyspvsildikqgpkepfrdyvdrvyktlraeqasqdvknwmtetllvqnsnpdcktilkalgpgatleemmtacqgvggpshkarvlaeamsqatn--satimmqkgnfrnqrkivkcfncgkeghiakncraprkrgcwkcgkeghqmkec--terqanflgkiwpsy-kgrpgnflq--------nrpept-----------appaesfrfgeetttpp----------qkqepidke-----lyp-laslkslfgndpssqseqidno:700epigraph混合体抗原3.arasvlsggeldkwekirlrpggkkqyklkhlvwasrelerfainpglletsggcrqileqlqpslqtgseelrslyntvavlycvhqrievkdtkealekveeeqnkskkkvqq-------aaadtgnsn---------qvsqnypivqniqgqmvhqpisprtlnawvkviedkafspevipmfaalsegatpqdlntmlntigghqaamqmlkdtineeaaewdrlhpvqagpvapgqmrdprgsdiagttstlqeqiawmtnnppipvgdiykrwiilglnkivrmysptsildikqgpkesfrdyvdrfyktlraeqatqevknwmtetllvqnanpdcrtilkalgpaatleemmsacqgvggpshkarilaeamsqvtn--staimmqrgnfknqrktvkcfncgreghiakncraprkkgcwkcgreghqmkdcterqrqanflgkiwpss-kgrpgnflq--------srpeps-----------appeesfrfgeetatps----------qkqepidke-----lyp-ltslrslfgndpslqseqidno:701hivbgag/nef融合epigraph1mgarasvlsggeldrwekirlrpggkkkyrlkhivwasrelerfavnpglletsegcrqilgqlqpslqtgseelkslyntvatlycvhqrievkdtkealdkieeeqnkskkkaqqaaadtgnssqvsqnypivqnlqgqmvhqaisprtlnawvkvveekafspevipmfsalsegatpqdlntmlntvgghqaamqmlketineeaaewdrlhpvhagpiapgqmreprgsdiagttstlqeqigwmtnnppipvgeiykrwiilglnkivrmysptsildirqgpkepfrdyvdrfyktlraeqasqevknwmtetllvqnanpdcktilkalgpaatleemmtacqgvggpghkarvlaeamsqvtnsatimmqrgnfrnqrktvkcfncgkeghiakncraprkkgcwkcgkeghqmkdcterqanflgkiwpshkgrpgnflqsrpeptappeesfrfgeetttpsqkqepidkelyplaslkslfgndpssqggkwskssivgwpavrermrraepaaegvgavsrdlekhgaitssntaatnadcawleaqeeeevgfpvrpqvplrpmtykgaldlshflkekgglegliysqkrqdildlwvyhtqgyfpdwqnytpgpgirypltfgwcfklvpvepekveeanegennsllhpmsqhgmddpekevlmwkfdsrlafhhmarelhpeyykdcseqidno:702hivbgag/nef融合epigraph2mgarasvlsggkldkwekirlrpggkkkyklkhivwasrelerfalnpglletsegckqilgqlqpalqtgseelrslyntvavlycvhqridvkdtkealekieeeqnkckkkaqqaaaaadtgnnsqvsqnypivqnmqgqmvhqalsprtlnawvkvieekafspevipmftalsegatpqdlntmlntigghqaamqmlkdtineeaaewdrvhpvhagpvapgqmreprgsdiagttsnlqeqiawmthnppipvgeiykrwiimglnkivrmyspvsildikqgpkepfrdyvdrfyrtlraeqasqdvknwmtetllvqnsnpdcktilkalgpgatleemmtacqgvggpshk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