发明领域本发明涉及一种制备大环螯合剂dota的钆金属络合物制剂的方法，所述制剂还包含少过量的游离dota。该方法使用受控条件，使得过量的钆以氧化钆的沉淀存在，并过滤以除去过量，之后加入限定过量的dota螯合剂。还提供了制备基于gd-dota的mri造影剂的方法。发明背景镧系金属(特别是钆)的金属络合物作为在体内医学成像领域中的mri造影剂具有重要意义。基于钆的金属络合物的mri造影剂已被详尽地评述[见例如zhang等人,curr.med.chem.,12,751-778(2005)和aime等人,adv.inorg.chem.,57,173-237(2005)]。然而，游离钆离子确实在体内显示出明显的毒性。us5,876,695通过在钆金属络合物的制剂中包含添加剂解决了这个问题，所述添加剂是例如具有钙的“弱金属螯合物络合物”。想法是过量的“弱金属螯合物络合物”将有效地络合可偶然地释出或存在的任何钆离子，因而改进了mri造影组合物的安全性。ep2513043b1公开了一种制备钆金属络合物的方法，其中先使钆与任选地用金属配位基团官能化的阳离子交换树脂络合。固相结合的钆随后与氨基羧酸螯合剂反应以释出所需的钆络合物。任何过量的钆保持与固相的结合。ep2242515b9公开了一种制备含有大环螯合物与镧系元素的络合物和0.002%和0.4%之间的mol/mol量的游离大环螯合物的液体药物制剂的过程，所述过程包括以下连续的步骤：b)通过混合游离大环螯合物的溶液和游离镧系元素的溶液，以通过大环螯合物获得镧系元素的络合，制备含有大环螯合物与镧系元素的络合物，和不在赋形剂x[x',l]的形式下的游离大环螯合物的液体药物组合物，其中l是大环螯合物且x和x'是金属离子，特别是独立地选自钙、钠、锌和镁，和游离镧系元素，游离大环螯合物的量和游离镧系元素的量使得并非所有镧系元素被络合；c)测量在步骤b)中获得的药物制剂中的游离镧系元素的浓度clanl；游离大环螯合物的浓度cchl等于0；d)通过将一定量的游离大环螯合物加入到步骤b)中获得的制剂中来调节cchl和clanl，所述游离大环螯合物的量有必要首先完成游离镧系元素的络合以获得clanl=0，且其次获得cchl=ctchl，其中ctchl是最终液体药物制剂中的游离大环螯合物的目标浓度并在0.002%和0.4%mol/mol之间的范围内选择，其中最终液体药物制剂中的游离大环螯合物的量对应于游离大环螯合物相对于最终液体药物制剂中络合的大环螯合物的量的比例。ep2242515b9教导了所述方法优选还包括测定最终液体药物制剂中的游离大环螯合物的理论目标浓度ctchl的在先步骤a)。us2012/0082624a1公开了与ep2242515b9类似的过程，不同之处在于以粉末形式获得药物制剂。ep2242515b9和us2012/0082624a1二者都强调，对于工业规模的药物制造过程，加入0.1mol%的游离大环螯合物难以单靠称重达到所需的准确度。这归因于包含的螯合剂的量的1000倍差异，加上螯合剂的吸湿特性。要求保护的发明，如上所述，是首先进行与过量的镧系金属离子的金属络合，然后再准确确定未络合的、过量的镧系元素的浓度。随后该测定被用来精确计算多少额外的螯合剂必须加入以既使过量的镧系元素络合，又达到所需的0.1%摩尔过量的大环螯合物。ep2242515b9的参考实施例3包括实验室规模的制备，其通过使dota(10g,25mmol)与化学计量量的氧化钆(gd2o3,12.5mmol)在80℃，在水(ph6-7)中反应来制备gd-dota。然后将ph调节至5，且残余的游离钆通过与chelex树脂一起搅拌2小时，接着过滤除去。ep2242515b9教导了gd-dota络合物随后从乙醇水溶液沉淀，得到80%分离产率的白色粉末。ep2242515b9未教导参考实施例3的方法如何可适合提供液体药物组合物，其具有过量的在0.002%和0.4%mol/mol范围内的大环螯合物，特别是在工业规模上。wo2014/114664提供一种制备gd-dota葡甲胺(钆特酸葡甲胺)的过程，其首先包括从轮环藤宁(cyclen)合成dota，接着经由重结晶和阳离子和阴离子交换层析二者的多步骤纯化。然后使纯化的dota与gd2o3反应，得到gd-dota络合物，接着加入葡甲胺，得到所需产物。wo2014/161925教导，当以工业规模制备gd-dota和类似的络合物时，在使用和修正相应所用的摩尔量之前，必须测定螯合剂的含水量。wo2014/161925指明，dota的含水量随着相对湿度条件而变化。对制备结合过量的此类螯合剂的大环螯合物的镧系金属络合物的制剂的备选方法仍有需求。所述方法应优选地适合于工业规模的药物制造，且还适合于提供包含这样的制剂的mri造影剂。本发明本发明提供了一种制备液体药物制剂的方法，所述制剂包含钆dota络合物，以及量在0.002和0.4mol/mol%范围内的未络合形式的dota。这样的制剂在提供mri造影剂中是有用的。然后，本发明的方法避免了对现有技术的测量和调节步骤的需要，这对于简化时间和工作量二者有用。本方法替代提供了一种方法，由此首先获得gd-dota金属络合物，而不存在过量的钆离子。这通过控制反应条件来实现，使得任何过量的钆以不溶性gd2o3存在，其可以通过过滤除去。此外，gd-dota络合物保持在水溶液中，因此不需要对络合物的水分含量进行修正。由于该方法提供不具有游离钆离子的gd-dota金属络合物的中间体溶液，可容易地计算加入以得到具有限定过量的游离螯合剂的所需制剂的过量dota的量。本发明的方法还具有可以在工业规模上进行的优点。发明详述在第一方面，本发明提供制备液体药物制剂的方法，所述制剂包含金属络合物gd-dota的葡甲胺盐，以及量在所述gd-dota络合物的0.002-0.4mol/mol%范围内的未络合形式的dota，所述方法包括以下步骤：(i)以下任一反应：(a)1:1摩尔比的dota和葡甲胺的水溶液与过量的gd2o3反应，由此所有的dota反应以得到gd-dota；或(b)dota的水溶液与不足的gd2o3在ph2.0-6.0下反应，其中所有的钆反应以得到gd-dota，接着加入葡甲胺以将ph升高至6.5-8.0，然后加入过量的gd2o3；或(c)dota与过量的葡甲胺的水溶液在ph6.5-8.0下与过量的gd2o3反应，由此所有dota反应以得到gd-dota；由此(a)、(b)或(c)得到含有过量未溶解gd2o3的gd-dota第一溶液；(ii)过滤来自步骤(i)的第一溶液以除去过量的未溶解gd2o3，得到包含gd-dota的不含过量gd2o3的第二溶液；(iii)将0.002-0.4mol/mol%范围内的未络合形式的dota加入到来自步骤(ii)的所述第二溶液中，得到所述液体药物制剂；其中未络合形式的所述dota不含配位金属离子。术语“dota”是大环螯合剂1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸的常规缩写，且指dota本身或其盐：dota。dota及其生物医学成像中的金属络合物已经由stasiuk和long[chem.comm.，49，22732-2746(2013)]描述。短语“未络合形式的dota”指“游离螯合剂”，即无任何配位的金属离子。因此，未络合形式的dota不具有任何配位的镧系元素或其它金属离子，因此完全可用于后续的金属络合。“未络合形式的dota”可含有离子形式的金属离子，例如当作为羧酸金属供体基团的羧酸盐存在时。术语“葡甲胺”具有其常规含义，且指n-甲基葡糖胺。术语“包含”或“含有”在整个本申请中具有其常规意义并意味着试剂或组合物必须具有所列的基本特征或组分，但其它物质可能另外存在。术语“包含”包括“基本由…组成”作为优选的子集，“基本由…组成”意指组合物具有所列组分，而不存在其它特征或组分。用于步骤(i)的络合的合适溶剂是本领域已知的[医学磁共振成像中造影剂的化学(thechemistryofcontrastagentsinmedicalmagneticresonanceimaging),第2版,a.merbach,l.helm&e.toth(eds),wiley(2013)]，并且合适地是水性的。钆通过大环螯合物(例如dota)的络合是涉及稍微稳定的初始络合物的多步骤过程，所述初始络合物缓慢地成熟，得到最终的热力学稳定的金属络合物。步骤(i)(a)中过量的钆或步骤(i)(b)中过量的dota通过知道钆dota络合物的化学计量比为1:1络合物来计算摩尔比获得。还考虑了使用的钆和dota二者的化学纯度百分比。氧化钆(gd2o3)不溶于水，但在酸性ph下会水解，在溶液中给出游离的钆离子。在中性ph下，这种水解已报道为不存在或非常缓慢[hemmer等人，adv.mat.sci.eng.，1-15(2012)doi：10.1155/2012/748098)。在步骤(i)(a)中，将过量的氧化钆加入到1:1摩尔比的dota和葡甲胺的混合物中。dota将消耗氧化钆并形成gd-dota，且通过使用正确的dota/葡甲胺比(100:95至100:100摩尔比dota/葡甲胺)，ph将在络合结束时接近较高的ph(ph6-8)。由于较高的ph值，不溶性氧化钆的水解非常缓慢，这允许通过过滤随后除去过量的氧化钆。在步骤(i)(b)中，在酸性ph下将不足化学计量量的gd2o3加入到dota中。在完全消耗氧化钆后，加入葡甲胺以将ph升高至6.5-8.0，接着加入过量的gd2o3(约1至5%)。这有助于所有dota的完全络合，同时使过量gd2o3的水解最小化(由于中性ph下的缓慢动力学)。在这个过程中，利用低ph下的高络合速率和在升高ph下的低水解率二者。在步骤(i)(c)中，使用过量的葡甲胺，导致更高的ph(约ph6.5-8)，导致氧化钆的水解程度甚至更低。由于dota的酸度，在步骤(iii)中随后通过加入0.1mol/%的过量dota中和碱性gd-dota-葡甲胺溶液。步骤(ii)的过滤可以通过标准方法实现。步骤(iii)的加入优选地在不进行游离钆在第一或第二溶液中的浓度/量的在先过程中测定的情况下实施。这是因为这样一个步骤对于本方法不是必要的-步骤(ii)的过滤得到具有已知(即有效零)浓度的游离钆的“第二溶液”。因此，基于步骤(i)中起始摩尔量的dota，基于假定在步骤(i)的络合反应中100%转化率，根据计算量的“未络合形式的dota”进行步骤(iii)的加入。100%转化率与本领域关于这样反应的有效性已知的一致。dota可作为固体，或作为溶液且优选作为溶液加入。当制备dota的溶液以便进行步骤(i)时，那么最优选的方法是从该溶液除去合适的体积分数，然后加入氧化钆(例如从1000l反应体积或等量除去约1l)。然后方便地将该体积分数用于步骤(iii)的加入。这种方法不再需要补充多种溶液，和/或进行多次计算以修正纯度或含水量。第一方面的方法适合以实验室、中试设备或工业制造规模进行。该方法特别适合于千克规模生产，从1kg至800kg，优选100kg-650kg规模。优选实施方案.在第一方面的方法中，步骤(i)的选项(a)、(b)和(c)中过量的gd2o3在0.001至5范围内，更优选为0.01至1，最优选为0.05至0.5mol/mol%，0.05至5mol/mol%。在该范围(约0.001至0.01mol%)内的过量的钆金属的最低水平可以通过以下实现：增量加入钆的等分试样，直到观察到存在游离钆离子的阳性试验。这样的“现场试验”对存在/不存在问题给出是/否的回答，但未提供关于游离钆浓度的信息。现场试验可使用偶氮胂染料进行，如本领域已知。或者，过量的钆可通过如本领域已知的二甲酚橙测定或偶氮胂iii测定来确定[分别在barge等人,contrastmed.mol.imaging,1,184-188(2006)和hvattum等人，j.pharm.biomed.anal.，13(7)，927-932(1995)]。二甲酚橙和偶氮胂iii是市售可得的。更高水平(>0.01mol%至最多5mol%)的过量的钆可通过单独称重获得。在第一方面的方法中，步骤(iii)的未络合形式的dota的量相对于gd-dota络合物优选在0.025-0.25范围内，更优选为0.08至0.12，最优选为0.09至0.11mol/mol%。未络合形式的dota合适地不含钆金属离子，且优选也不含配位的钙、锌和镁离子。第一方面的方法的步骤(ii)优选进一步包括在过滤之后，通过以下步骤除去溶液中的任何过量的gd3+：(a)将过滤的溶液与固相结合的清除剂螯合剂接触一次或多次，由此溶液中的任何过量的gd3+与所述清除剂螯合剂络合；(b)从步骤(a)的过滤的溶液中分离固相。短语“固相结合的清除剂螯合剂”指共价缀合到不溶于用于镧系元素络合的溶剂的固相材料的螯合剂。缀合的螯合剂络合溶液中的游离金属离子，因此能够从溶液除去或“清除”任何这样的金属离子。选择不同于dota的清除剂螯合剂，因此适当地具有比dota更低的与钆金属的形成常数，且适当地选择使得它不能替代来自gd-dota金属络合物的钆。优选选择清除剂螯合剂，使得捕获溶液中的游离金属离子的动力学是快速的。因此，优选线性(即非大环)清除剂螯合剂。在结合到固相时，清除剂螯合剂通过过滤在任选的洗涤情况下容易与其所接触的溶液分离。合适的固相材料包括合成的聚合物和共聚物。步骤(a)的接触可以通过两种主要方法或其组合进行。第一个选项是将固相树脂与“第一溶液”混合。或者，固相可以作为柱提供，且“第一溶液”通过柱洗脱。然后通过过滤溶液以除去钆结合的树脂，或通过分别从柱洗脱中收集洗脱液来实现步骤(b)的分离。优选地，过滤的树脂或固相柱可以用合适的溶剂洗涤以确保更完全地回收“第二溶液”。步骤(a)的接触优选在ph4.0至6，更优选4.5至5.5下进行，约ph5是理想的。清除剂螯合剂优选包含亚氨基二乙酸(ida)、edta或dtpa，更优选亚氨基二乙酸。优选的固相结合的清除剂螯合剂是chelex®100，其是苯乙烯二乙烯基苯共聚物，具有缀合于其上的螯合剂ida。chelex®100可作为来自bio-radlaboratories和其他供应商的钠盐或铵盐市售可得。商业供应商提供关于用于除去给定量的金属的合适量树脂的信息。在中性ph下，chelex作为阳离子交换树脂起作用，因此对带负电例如gd(dota)-的钆金属络合物没有亲和力。这具有以下优点：这种络合物与固相的非特异性结合是最小的，因此对产率的影响最小。清除剂螯合剂优选作为所述清除剂螯合剂的葡甲胺盐存在。这样的材料可通过常规离子交换层析技术制备，以通过培养或用过量的葡甲胺溶液洗脱来改变反荷离子(例如chelex®-100的钠或铵盐)。然后，固相可以任选在使用前干燥。或者，葡甲胺盐清除剂树脂可通过加入质子化形式的树脂(通过以与实施例1的程序类似的程序，用强酸洗涤例如市售的chelex获得)原位生成。然后水合氢离子chelex树脂在含有葡甲胺的络合反应中原位形成对应的葡甲胺盐形式。这样的葡甲胺树脂具有特定的优点，即当制备gd-dota葡甲胺盐时，产物的钠离子/盐含量减少。因此，在市售的chelex®树脂中的清除剂螯合物(ida)的反荷离子是钠，因此对于捕获的每一个钆离子，3个钠离子被释放进入反应混合物中。为避免钠污染，可制备chelex®树脂以便所有的钠离子交换葡甲胺盐离子。因此，当钆离子被清除剂树脂捕获时，释出3个葡甲胺盐离子。使用后，具有结合的金属离子的清除剂螯合物树脂可任选地再生，以通过用过量的葡甲胺或其它反荷离子处理随后再使用。对于chelex，标准再生方法在由商业供应商提供的操作指示手册中描述。完全除去钆将通过在树脂的酸性水洗涤后的洗脱液的icp-aes或icp-ms，或通过上文提及的“现场试验”确定。步骤(i)的钆络合过程通常本质上是多步骤的。络合发生在较宽的ph范围内，但是多步骤过程的每个步骤都具有最佳的ph范围。在步骤(i)的选项(a)、(b)(c)中使用包括ph的反应条件的控制。低ph(ph约2)是适于溶解所有gd2o3以在溶液中得到游离的钆离子。然而，在该低ph下，dota的羧酸根基团不能完全络合所有的钆离子，因为羧酸根基团被部分质子化。在稍高的ph(约4至5)下，羧酸根阴离子的形成是有利的，这继而有利于金属络合。形成的初始gd-dota络合物实际上是双质子化的，然后缓慢成熟以得到高热力学(和动力学)稳定性的最终gd-dota络合物[moreau等人，chem.eur.j.，10(20)，5218-32(2004)]。成熟过程通过较高的ph和加热(通常在约ph5下加热几小时)而有利。步骤(iii)的加入优选在加入过量的dota之前首先中和至中性ph(约ph7-7.4)进行。该中和优选使用葡甲胺进行。dota可从一系列的供应商市售可得。dota也可通过desreux[inorg.chem.,19,1319-1324(1980)]或toth等人[inorg.chem.，33,4070-4076(1994)]的方法合成。大环螯合物合成的进一步细节由kotel等人给出[第3章第83-155页，医学磁共振成像中造影剂的化学(thechemistryofcontrastagentsinmedicalmagneticresonanceimaging),第2版,a.merbach,l.helm&e.toth(eds),wiley(2013)]。葡甲胺(n-甲基葡萄糖胺)可从一系列的供应商市售可得。优选地，使用药用级材料。在第二方面，本发明提供一种制备mri造影剂的方法，其包括：(a)进行第一方面的方法，得到如在其中限定的液体药物制剂；(b)任选地用生物相容的载体稀释来自步骤(a)的液体药物制剂；(c)将来自步骤(b)的制剂分配到药学上可接受的容器或注射器中，得到分配的容器或注射器；(d)在无菌制造条件下进行步骤(a)-(c)，或进行来自步骤(c)的分配的容器或注射器的终端灭菌，得到呈适合于哺乳动物给予形式的在所述药学上可接受的容器或注射器中的mri造影剂。第二方面的液体药物制剂和步骤(a)的方法的优选实施方案如在第一方面(上文)中所述。术语“造影剂”具有其在体内医学成像领域的常规意义，并指适合于哺乳动物给予形式的试剂，其有助于在关注的区域或器官提供比可通过单独使受试者成像获得的图像更清楚的图像。“mri造影剂”通常为一种顺磁性或铁磁性物质，适合于哺乳动物给予，其缩短在受试者体内成像所关注的区域中相关原子核的t1和/或t2弛豫时间(例如对于1hnmr的1h)。术语“受试者”意指哺乳动物体内，优选完整的哺乳动物体内，和更优选活的人类受试者。短语“适合于哺乳动物给予的形式”意指这样的组合物，其是无菌的、无热原的、缺乏产生毒性或不利作用的化合物，以及在可生物相容的ph(约ph4.0-10.5)下配制。这样的组合物缺乏可能导致体内栓子的风险的颗粒，并被配制以便在与生物流体(例如血)接触时不会发生沉淀。这样的组合物也含有仅生物相容的赋形剂，且优选是等渗的。如同其它体内成像剂，造影剂设计成对要成像的哺乳动物受试者具有最小限度的药理学作用。优选地，造影剂可以最小限度的侵入方式给予哺乳动物体内，即当在专业的医疗专门知识下进行时，对哺乳动物受试者没有实质上的健康风险。这样的最小限度的侵入给予优选地经静脉内给予到所述受试者的外周静脉中，而不需要局部或全身麻醉。术语“生物相容的载体”意指一种流体，特别是液体，以使组合物是生理学上可耐受的，即可给予哺乳动物体内，而无毒性或过度的不适。生物相容的载体适合为一种可注射的载体液体例如供注射用的无菌、无热原的水；水溶液例如盐水(其可有利地进行平衡，以使供注射用的最终产品是等渗的)；包含生物相容的缓冲剂(例如磷酸盐缓冲剂)的水性缓冲溶液；一种或多种渗透压调节物质(例如血浆阳离子与生物相容的反荷离子的盐)、糖(例如葡萄糖或蔗糖)、糖醇(例如山梨糖醇或甘露醇)、二醇(例如甘油)，或其它非离子多元醇材料(例如聚乙二醇、丙二醇等)的水溶液。优选地，所述生物相容的载体是供注射用的无热原的水(wfi)、等渗盐水或磷酸盐缓冲剂。短语“无菌制造”指在无菌制造，即无热源条件下进行相关过程步骤，例如在洁净室环境中。术语“灭菌”或“灭菌法”具有其常规意义，且指破坏微生物的过程，以获得一种无菌、无热源组合物。短语“终端灭菌”具有其常规意义，并指进行在gmp(良好制造规范)之前的步骤，但在整个过程中尽可能晚地执行灭菌步骤。组分和试剂可通过本领域已知的方法灭菌，包括：无菌过滤、使用例如γ-辐射的终端灭菌、高压灭菌法、干热或化学处理(例如用环氧乙烷)或其组合。术语“高压灭菌法”具有其常规意义，并指使用过热蒸汽灭菌的一种特定灭菌方法。高压灭菌法和其它灭菌方法描述于在医学和药物产品中实现灭菌(achievingsterilityinmedicalandpharmaceuticalproducts),n.halls(crcpress,1994)。在第二方面的方法中，终端灭菌是优选的。一种优选的终端灭菌方法是高压灭菌法。术语“分配的容器或注射器”指装料的容器，即已将等分的组合物分配至其中的容器，即分配的小瓶。用于第二方面的方法的合适容器、小瓶和盖以及注射器是药用级的并广泛市售可得。通过下面详细描述的非限制性实施例说明本发明。实施例1提供葡甲胺清除剂螯合剂树脂的制备。实施例2提供能够分析这些组分的混合物中的gd-dota、游离dota和葡甲胺的hplc-cad方法。实施例3提供gd-dota络合物的制备，根据本发明的方法除去过量的钆。缩写dota：1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸；dtpa：二亚乙基三胺-五乙酸；edta：乙二胺-四乙酸；gmp：良好制造规范；hplc：高效液相色谱；hplc-cad：hplc电雾式检测器；icp-aes：电感耦合等离子体原子发射光谱；icp-ms：电感耦合等离子体质谱；mecn：乙腈；min：分钟；mri：磁共振成像；wfi：注射用水。实施例1：制备葡甲胺化chelex®树脂(“meg-chelex”).将在烧结玻璃滤器上的chelex-100树脂(sigma-aldrich；100g)用1mhcl(1l)按4份处理4h。然后用水洗涤树脂直至洗脱液为ph6.5，且用树脂平衡葡甲胺(10g)的水溶液(400ml)经1h的时间段。再次用水洗涤树脂至ph8，在真空下过滤并干燥1分钟，得到潮湿的树脂，其以该形式(“meg-chelex”)使用。实施例2：hplc-cad方法：gddota-葡甲胺溶液中的dota测定.检测器：esacorona，电雾式检测器；柱：sequantzic-philic(5µm,150*4.6mm)。样品制备：向20µl(约0.5m)反应混合物中加入zn(oac)2(10µl,10mg/ml)，然后加入水(270µl)，接着加入mecn(700µl)*。注入体积：20µl；移动相：100mm乙酸铵(a)、乙腈(b)。在样品注入前，用初始组合物(15:85a:b)，以1ml/min的流速调节柱至少5分钟。梯度：时间(min)流速(ml/min)%a%b曲线1.初始1.0015.085.02.50.001.0033.066.06其中曲线6指线性梯度。观察到以下保留时间：保留时间(min)葡甲胺21.3gddota23.2zndota*28.1.*dota作为zndota络合物间接分析。实施例3：gd-dota-葡甲胺溶液的制备，去除钆离子.将葡甲胺(0.749g，4.00mmol)、dota(1.615g，4.00mmol)、氧化钆(0.749g2.04mmol)和水(8.0g)在烧瓶中合并且在60℃下搅拌过夜。这得到溶液明显混浊的混合物。将混合物用注射器过滤器(pallacrodisc25mm，0.45μpvdf膜)过滤，得到ph~9的澄清溶液。使用偶氮胂指示剂检测没有游离钆[hvattum等人，j.pharm.biomed.anal.，13(7)，927-932(1995)]。检测限为<9.4μg/ml或<0.06mm。偶氮胂iii染料市售可得。当前第1页12