一种丝瓜络抗粘连创面敷料的制备方法与流程

本发明属于组织工程支架材料技术领域，涉及一种天然植物纤维抗粘连创面敷料的制备方法，更具体地涉及一种丝瓜络抗粘连创面敷料的制备方法。

背景技术：

敷料是一种暂时性覆盖伤口用的医用材料，其最主要的功能是控制伤口的渗出液及保护伤口，以免受细菌及尘粒的污染，提供利于伤口愈合的环境。细胞粘附性影响敷料的使用效果。细胞粘附性强的敷料易粘附肉芽组织，在敷料揭除时带来二次损伤，对迁移的上皮细胞、增生的成纤维细胞的损害。

基于天然植物纤维的海绵体生物相容性好且分子链上具有多种可反应的活性官能团，可通过改性手段进行化学修饰，改善材料的性能和质量，是医用敷料的理想材料。目前制备敷料常用的方法是化学交联法和紫外光交联法。采用交联法制备的材料因有毒的化学试剂或引发剂的残留，对机体产生刺激，安全性不能得到保障。此外，交联后材料的分子间距离较小，吸水性能较低，影响敷料的保护和使用效果。

目前，基于丝瓜植物纤维敷料已被应用于创面的修复。文献1(中国组织工程研究，2012，16(8)，1505-1508)采用封闭负压引流技术，证明了丝瓜络创面敷料能有效引流，避免患者毒素入血保护肝肾功能，优于常规切开减压敷料包扎组。同时，肉芽组织颗粒的新鲜度满意，可为后期植皮提供良好的组织创面，并且具有良好的生物相容性。文献2(中国组织工程研究，2012，16(34)，6445-6448)考察了丝瓜络创面敷料在四肢脱套伤治疗中的临床效果。结果表明，采用封闭负压引流后，与常规传统换药组比较，丝瓜络敷料组能明显改善创面循环，降低回植皮肤坏死率，减轻术后患者局部功能障碍程度。说明丝瓜络创面敷料能有效引流，减轻创面静脉负荷，改善四肢脱套伤术后症状。文献3(中国组织工程研究，2014，18(8)，1295-1300)对比了封闭负压引流天然丝瓜络和合成材料创面敷料在创面植皮中的临床效果，结果显示采用丝瓜络治疗组植皮覆盖率及创面愈合时间均明显优于合成材料创面敷料，提示采用丝瓜络封闭负压引流可以有效促进引流，改善循环，抑制细菌增生及促进修复过程。

然而，上述方法制得的基于丝瓜络的敷料细胞粘附性存在很大的缺陷，创面肉芽组织易向敷料内生长而引起组织粘连，在敷料揭除时造成二次创伤。因此，寻找抗粘连的敷料，满足临床应用需求，具有巨大的应用价值。

技术实现要素：

针对现有技术中丝瓜络创面敷料易粘附肉芽组织，揭除时易带来二次损伤的缺陷，本发明提供了一种丝瓜络抗粘连创面敷料的制备方法。

本发明的技术解决方案为：一种丝瓜络抗粘连创面敷料的制备方法，以丝瓜络海绵体为基材，采用接枝改性技术制备而成，具体包括以下步骤：

步骤1，室温下将丝瓜络在避光条件下浸入高碘酸钾水溶液，搅拌反应结束后清洗，得到醛基化丝瓜络；

步骤2，室温下将醛基化丝瓜络浸入羧甲基壳聚糖水溶液，反应结束后，得到接枝羧甲基壳聚糖的丝瓜络；

步骤3，室温及避光条件下在海藻酸钠溶液中滴加高碘酸钾水溶液，搅拌反应结束后，透析并冻干，得到醛基化海藻酸钠；

步骤4，室温下将接枝羧甲基壳聚糖的丝瓜络浸入醛基化海藻酸钠水溶液中，反应结束后，冻干得到丝瓜络抗粘连创面敷料。

优选地，步骤1中，高碘酸钾水溶液的浓度为1.5～3wt％，搅拌反应时间为4～12小时。

优选地，步骤2中，羧甲基壳聚糖水溶液的浓度为0.25～1.5wt％，反应时间为5～15分钟。

优选地，步骤3中，海藻酸钠溶液的浓度为1wt％，海藻酸钠与高碘酸钠的质量比为1:0.5～1.5，反应时间为1～4小时。

优选地，步骤4中，醛基化海藻酸钠水溶液的浓度为0.25～1.5wt％，反应时间为5～15分钟。

本发明与现有技术相比，其显著效果如下：1)接枝改性的丝瓜络抗粘连创面敷料亲水性强，抗粘连性能好，使用中能避免发生组织粘连；2)避免使用有毒化学交联剂，保证了敷料的安全性；3)具有反应温度低、接枝速度快、改性处理周期短等优点，工艺和设备简单、易行，适用于大规模的工业化生产。

附图说明

图1为本发明的一种丝瓜络抗粘连创面敷料的制备方法的流程示意图。

图2为丝瓜络敷料改性前(a)与改性后(b)的扫描电镜图。

图3为实施例1丝瓜络敷料的吸水率测试结果图。

图4为实施例1丝瓜络敷料的蛋白粘附性测试结果图。

图5为实施例1丝瓜络敷料的细胞粘附性测试结果图。

具体实施方式

本发明的一种丝瓜络抗粘连创面敷料的制备方法，是以丝瓜络海绵体为基材，通过席夫碱反应接枝改性而成，流程示意图如图1所示，首先在丝瓜络表面接枝醛基，然后再接枝羧甲基壳聚糖，最后接枝醛基化海藻酸钠，具体包括以下步骤：

步骤1，室温下将丝瓜络在避光条件下浸入浓度为1.5～3wt％高碘酸钾水溶液，搅拌反应4～12小时，然后清洗得到醛基化丝瓜络；

步骤2，室温下将醛基化丝瓜络浸入浓度为0.25～1.5wt％的羧甲基壳聚糖水溶液中，反应5～15分钟，得到接枝羧甲基壳聚糖的丝瓜络；

步骤3，室温下将1.0克海藻酸钠溶解于100毫升水中，然后加入0.5～1.5克高碘酸钠，避光条件下搅拌1～4小时，透析后冻干得到醛基化海藻酸钠；

步骤4，室温下将接枝羧甲基壳聚糖的丝瓜络浸入浓度为0.25～1.5wt％的醛基化海藻酸钠水溶液中，反应5～15分钟，冻干得到丝瓜络抗粘连创面敷料。

实施例中使用的原料和试剂如下：丝瓜络海绵材料，购于南京双威生物医学科技有限公司；羧甲基壳聚糖、海藻酸钠、高碘酸钾、牛血清白蛋白(bsa)、3-(4,5-二甲基噻唑)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(mtt)，购于阿拉丁公司；二甲基亚砜、十二烷基磺酸钠，分析纯，上海化学试剂厂。蛋白测定试剂盒，购于碧云天生物技术研究所。dmem培养基、磷酸盐缓冲溶液(pbs)，美国giboco公司；小牛血清，上海赛齐生物工程有限公司。

下面结合实施例和附图对本发明做进一步详细说明。

实施例1

(1)室温下将丝瓜络在避光条件下浸入浓度为2wt％高碘酸钾水溶液，搅拌反应8小时，然后清洗得到醛基化丝瓜络；

(2)室温下将醛基化丝瓜络浸入浓度为1.5wt％的羧甲基壳聚糖水溶液中，反应15分钟，得到接枝羧甲基壳聚糖的丝瓜络；

(3)室温下将1.0克海藻酸钠溶解于100毫升水中，然后加入1克高碘酸钠，避光条件下搅拌4小时，透析后冻干得到醛基化海藻酸钠；

(4)室温下将接枝羧甲基壳聚糖的丝瓜络浸入浓度为1.5wt％的醛基化海藻酸钠水 溶液中，反应15分钟，冻干得到丝瓜络抗粘连创面敷料。

扫描电镜观察改性前后的敷料的微结构，结果见图2，其中a为丝瓜络改性前，b为改性后得到的丝瓜络抗粘连创面敷料。从图2(b)可知，丝瓜络抗粘连创面敷料为纤维海绵体多孔结构，平均纤维直径为200微米左右，多孔结构相互贯穿，有利于透气及水分的吸收。改性后，支架保持多孔结构，冻干的壳聚糖/海藻酸钠附着于支架中。

实施例2

具体操作步骤为：

(1)室温下将丝瓜络在避光条件下浸入浓度为1.5wt％高碘酸钾水溶液，搅拌反应4小时，然后清洗得到醛基化丝瓜络；

(2)室温下将醛基化丝瓜络浸入浓度为0.25wt％的羧甲基壳聚糖水溶液中，反应5分钟，得到接枝羧甲基壳聚糖的丝瓜络；

(3)室温下将1.0克海藻酸钠溶解于100毫升水中，然后加入0.5克高碘酸钠，避光条件下搅拌1小时，透析后冻干得到醛基化海藻酸钠；

(4)室温下将接枝羧甲基壳聚糖的丝瓜络浸入浓度为0.25wt％的醛基化海藻酸钠水溶液中，反应5分钟，冻干得到丝瓜络抗粘连创面敷料。

实施例3

具体操作步骤为：

(1)室温下将丝瓜络在避光条件下浸入浓度为2wt％高碘酸钾水溶液，搅拌反应12小时，然后清洗得到醛基化丝瓜络；

(2)室温下将醛基化丝瓜络浸入浓度为0.5wt％的羧甲基壳聚糖水溶液中，反应10分钟，得到接枝羧甲基壳聚糖的丝瓜络；

(3)室温下将1.0克海藻酸钠溶解于100毫升水中，然后加入1克高碘酸钠，避光条件下搅拌2小时，透析后冻干得到醛基化海藻酸钠；

(4)室温下将接枝羧甲基壳聚糖的丝瓜络浸入浓度为0.5wt％的醛基化海藻酸钠水溶液中，反应10分钟，冻干得到丝瓜络抗粘连创面敷料。

实施例4

具体操作步骤为：

(1)室温下将丝瓜络在避光条件下浸入浓度为3wt％高碘酸钾水溶液，搅拌反应12小时，然后清洗得到醛基化丝瓜络；

(2)室温下将醛基化丝瓜络浸入浓度为1wt％的羧甲基壳聚糖水溶液中，反应15分钟，得到接枝羧甲基壳聚糖的丝瓜络；

(3)室温下将1.0克海藻酸钠溶解于100毫升水中，然后加入1.5克高碘酸钠，避光条件下搅拌3小时，透析后冻干得到醛基化海藻酸钠；

(4)室温下将接枝羧甲基壳聚糖的丝瓜络浸入浓度为1wt％的醛基化海藻酸钠水溶液中，反应15分钟，冻干得到丝瓜络抗粘连创面敷料。

实施例5

具体操作步骤为：

(1)室温下将丝瓜络在避光条件下浸入浓度为1.5wt％高碘酸钾水溶液，搅拌反应4小时，然后清洗得到醛基化丝瓜络；

(2)室温下将醛基化丝瓜络浸入浓度为1.5wt％的羧甲基壳聚糖水溶液中，反应15分钟，得到接枝羧甲基壳聚糖的丝瓜络；

(3)室温下将1.0克海藻酸钠溶解于100毫升水中，然后加入0.5克高碘酸钠，避光条件下搅拌4小时，透析后冻干得到醛基化海藻酸钠；

(4)室温下将接枝羧甲基壳聚糖的丝瓜络浸入浓度为0.25wt％的醛基化海藻酸钠水溶液中，反应15分钟，冻干得到丝瓜络抗粘连创面敷料。

实施例6

具体操作步骤为：

(1)室温下将丝瓜络在避光条件下浸入浓度为2.5wt％高碘酸钾水溶液，搅拌反应10小时，然后清洗得到醛基化丝瓜络；

(2)室温下将醛基化丝瓜络浸入浓度为1.25wt％的羧甲基壳聚糖水溶液中，反应10分钟，得到接枝羧甲基壳聚糖的丝瓜络；

(3)室温下将1.0克海藻酸钠溶解于100毫升水中，然后加入1.25克高碘酸钠，避光条件下搅拌4小时，透析后冻干得到醛基化海藻酸钠；

(4)室温下将接枝羧甲基壳聚糖的丝瓜络浸入浓度为1wt％的醛基化海藻酸钠水溶液中，反应12分钟，冻干得到丝瓜络抗粘连创面敷料。

实施例7

吸水性检测

先将敷料称重(wd)，25℃下在磷酸盐缓冲溶液中浸泡6小时以保证充分溶胀。测 试时，从溶液中取出敷料，用滤纸吸去敷料表面的水，立刻称重(ww)，每个样品平行测试5次。计算敷料吸水性能pa的公式为pa＝(ww–wd)/wd。

改性前后敷料的吸水率见图3。结果显示，改性前吸水率为4.6，接枝壳聚糖后其吸水能力增强，达到8.3；进一步结合海藻酸钠后，敷料可吸收相当于自身重量17.2倍的液体，表明丝瓜络抗粘连创面敷料的亲水性显著提高。

实施例8

蛋白吸附性检测

配制0.2wt％的牛血清白蛋白溶液，25℃下将敷料浸于该溶液中，24小时后取出敷料，用大量蒸馏水冲洗，再将敷料置于0.1wt％的十二烷基磺酸钠溶液中，37℃下摇床24小时，以将吸附于敷料的蛋白溶出。蛋白吸附量测定方法按照蛋白测定试剂盒标准操作流程执行。

改性前后敷料的蛋白吸附量见图4。医用纱布的蛋白吸附量为25.1，而未改性丝瓜络为21.3，分别接枝壳聚糖和海藻酸钠后，敷料蛋白吸附能力显著降低，分别为14.2和8.5，均显著低于医用纱布，进一步说明改性后的丝瓜络抗粘连创面敷料亲水性提高。

实施例9

细胞粘附性检测

将敷料剪成圆形，尺寸与24孔培养板(nunc^tm，denmark)孔径一致，将敷料铺满培养板底部。使用前先将敷料用75％乙醇浸泡2小时消毒，然后用磷酸盐缓冲溶液反复漂洗除去乙醇。在敷料表面接种数量为4×10⁴的人体成纤维细胞，并加入2毫升培养液(dmem培养基+10％小牛血清)，将其放于37℃下孵育4小时后取出，用磷酸盐缓冲溶液反复冲洗以除去未粘附的细胞，然后加入20微升0.5wt％mtt的磷酸盐缓冲溶液，置于37℃下孵育4小时后加入200微升二甲基亚砜，振荡均匀后采用酶标仪(bio-rad，imark)于570纳米处测定紫色物质的吸光度。

改性前后敷料的细胞粘附率见图5。改性前敷料的细胞粘附率为0.16，接枝壳聚糖和海藻酸钠后，分别降低至0.11和0.05，显著低于组织培养板(0.45)和医用纱布(0.20)，这与敷料的蛋白吸附结果一致，说明改性敷料的亲水性增强，阻碍细胞的粘附，从而能有效抗组织粘连。