本发明涉及一种脑蛋白水解物溶液的制备方法，属于医药领域。
背景技术：
：脑蛋白水解物是一种由动物脑组织经蛋白酶水解后得到的富含多种氨基酸和小分子多肽的一种混合物，可以调节和改进神经元的代谢，临床上，脑蛋白水解物主要用于治疗颅脑损伤和脑血管病(如脑梗和脑出血等)后遗症的恢复治疗，加速脑部神经系统的功能恢复。脑蛋白水解物主要成分为氨基酸和分子量较小有特定生物活性的多肽类物质，是用于生产注射用脑蛋白水解物的原料。按对机体的作用，氨基酸分为有效氨基酸和杂质氨基酸。有效氨基酸能够透过血脑屏障，促进细胞dna合成、修复与再生，同时提高肾上腺皮质机能，促进全身代谢。杂质氨基酸则刺激机体免疫细胞分泌类组胺物质，组胺和类组胺物质均有使血压下降作用，这类物质可导致患者血压下降，严重时导致休克，危及生命。纳滤是一种介于反渗透和超滤之间的膜分离技术，对溶液中各类溶质的截留率与其摩尔质量成正相关，采用截流分子量不同的纳滤膜系统处理，得到的产品中各类成分也不同。现有技术已公开了采用纳滤技术对脑组织水解液进行分离处理的工艺，如cn1562339a公开了一种脑蛋白水解物制剂的制备方法，该方法包括将新鲜猪脑酶解、超滤后用截留分子量为100～1000的纳滤膜进行纳滤浓缩的步骤；cn103191403a公开了一种脑蛋白水解物的制备方法，并具体公开了将猪脑组织经匀浆、脱脂、酶解、超滤处理后用截留分子量为90～150道尔顿的纳滤机进行纳滤浓缩；cn101019889a公开了对脑蛋白水解物用300～1000分子量的纳滤器进行纳滤。现有技术中公开的纳滤步骤其目的仅仅是提纯浓缩 脑蛋白水解物，或保证制剂的折光率合格，并未公开通过纳滤技术提高产品安全性的技术方案。技术实现要素：本发明的目的是提供一种脑蛋白水解物溶液的制备方法，该方法采用150～300道尔顿纳滤系统去除脑蛋白水解物溶液中低分子无效及有害物质，提高了产品的安全性。本发明的目的是通过如下技术方案实现的：一种脑蛋白水解物溶液的制备方法，该方法包括将动物脑组织依次进行前处理、酶解、酸碱沉淀、超滤、纳滤的步骤；其特征在于，所述纳滤步骤采用截留分子量为150～300道尔顿纳滤系统进行。进一步，所述的纳滤过程为采用截留分子量150～300道尔顿的纳滤系统进行过滤，收集回流液为纳滤液，当纳滤液为原体积1/5至1/2时结束纳滤。进一步，可向所述纳滤液中加入注射用水至纳滤前体积，再次用150～300道尔顿的纳滤系统进行过滤，收集回流液，当回流液为原体积1/5至1/2时结束纳滤，该过程重复1～4次。进一步，所述动物脑组织为新鲜或冻存不超过3个月的猪脑。进一步，所述前处理包括去除附着于脑组织的结构以及对脑组织进行匀浆得到脑组织匀浆液的步骤。更进一步，所述匀浆过程中加入脑组织重量1～3倍的注射用水。进一步，所述酶解过程包括依次用胃蛋白酶和胰酶进行酶解得到酶解液的过程。更进一步，所述胃蛋白酶和胰酶的加入量为脑组织匀浆液的0.2％～1％，酶解温度为40～70℃，酶解时间为2～8小时；更进一步，酶解温度为50～60℃，酶解时间为3～6小时；更进一步，酶解温度为55℃，酶解时间为4小时。进一步，所述酸碱沉淀过程为取酶解液用酸性溶液调节ph至1～2，静置8～12小时，取上清液；上清液再用碱性溶液调节ph至8～10，静置1～2小时，取上清液。进一步，所述超滤过程为依次用截留分子量为100000～150000道尔顿和 10000～50000道尔顿的超滤装置进行超滤，取透过液为超滤液；更进一步，所述超滤过程为依次用截留分子量为100000道尔顿和10000道尔顿的超滤装置进行超滤。本发明方法在有效的去除产品中的无效成分、有害成分的同时，能最大限度保留氨基酸，提高产品的安全性。具体实施方式实施例1前处理：取新鲜健康猪的猪脑，剔除附着的骨头、脂肪、结缔组织等；将猪脑和其重量的2倍的注射用水一同匀浆2遍得到匀浆液；酶解：按照其对应猪脑重量的0.5％向匀浆液中加入胃蛋白酶，用盐酸调节匀浆液ph值为3.5，在55℃下水解4h；然后用氢氧化钠溶液调节ph值为8.5，再按对应猪脑重量的0.5％向匀浆液加入经0.02mol/lcacl2溶液活化的胰酶，在55℃的温度水解4h；将胰酶水解液加热煮沸，保持60min；酸碱沉淀：用盐酸调节胰酶水解液ph值至1.5，静置8h，分取上清液；上清液用氢氧化钠溶液调节ph至9.0，静置2h，分取上清液；超滤：上清液用截留分子量100000道尔顿的超滤膜进行超滤，取透过液，再经截留分子量10000道尔顿的超滤膜进行超滤，收集透过液。实施例2前处理：取新鲜健康猪的猪脑，剔除附着的骨头、脂肪、结缔组织等；将猪脑和其重量的3倍的注射用水一同匀浆2遍得到匀浆液；酶解：按照其对应猪脑重量的0.2％向匀浆液中加入胃蛋白酶，用盐酸调节匀浆液ph值为3.5，在50℃下水解6h；然后用氢氧化钠溶液调节ph值为8.5，再按对应猪脑重量的0.2％向匀浆液加入经0.02mol/lcacl2溶液活化的胰蛋白酶，在50℃的温度水解6h；将胰酶水解液加热煮沸，保持60min；酸碱沉淀：用盐酸调节胰酶水解液ph值至1.0，静置3h，分取上清液；上清液用氢氧化钠溶液调节ph至10.0，静置3h，分取上清液；超滤：上清液用截留分子量150000d的超滤膜进行超滤，取透过液， 再经截留分子量50000d的超滤膜进行超滤，收集透过液。实施例3前处理：取新鲜健康猪的猪脑，剔除附着的骨头、脂肪、结缔组织等；将猪脑和与其等量的注射用水一同匀浆2遍得到匀浆液；酶解：按照其对应猪脑重量的1％向匀浆液中加入胃蛋白酶，用盐酸调节匀浆液ph值为3，在60℃下水解4h；然后用氢氧化钠溶液调节ph值为9，再按对应猪脑重量的1％向匀浆液加入经0.02mol/lcacl2溶液活化的胰蛋白酶，在60℃的温度水解4h；将胰酶水解液加热煮沸，保持60min；酸碱沉淀：用盐酸调节胰酶水解液ph值至2.0，静置1.5h，分取上清液；上清液用氢氧化钠溶液调节ph至8.0，静置1.5h，分取上清液；超滤：上清液用截留分子量120000d的超滤膜进行超滤，取透过液，再经截留分子量30000d的超滤膜进行超滤，收集透过液为超滤液。实施例4纳滤：取实施例1-3任一制备的超滤液，用截留分子量为150道尔顿的纳滤膜分离系统进行纳滤，弃去透过液，收集回流液至纳滤前体积1/2；向回流液中加入注射用水至纳滤前体积，再次用截留分子量为150道尔顿分离膜系统纳滤，弃去透过液，收集回流液至纳滤前体积1/4，结束纳滤；将纳滤液用0.22um滤膜滤过，制得到脑蛋白水解物。实施例5纳滤：取实施例1-3任一制备的超滤液，用截留分子量为200道尔顿的纳滤膜分离系统进行纳滤，弃去透过液，收集回流液至纳滤前体积1/2；向回流液中加入注射用水至纳滤前体积，再次用截留分子量为200道尔顿分离膜系统纳滤，弃去透过液，收集回流液至纳滤前体积1/2；向回流液中加入注射用水至纳滤前体积，用截留分子量为200道尔顿分离膜系统进行第三次纳滤，当回流液至原体积的1/4，结束纳滤；将纳滤液用0.22um滤膜滤过，制得到脑蛋白水解物。实施例6纳滤：取实施例1-3任一制备的超滤液，用截留分子量为300道尔顿的纳滤膜分离系统进行纳滤，弃去透过液，当回流液至原体积的1/4，结 束纳滤；将纳滤液用0.22um滤膜滤过，制得到脑蛋白水解物溶液。对照实施例1纳滤：取实施例1制备的超滤液，用截留分子量为400的纳滤膜分离系统进行纳滤，弃去透过液，当回流液至原体积的1/4，结束纳滤；将纳滤液用0.22um滤膜滤过，制得到脑蛋白水解物。对照实施例2纳滤：取实施例1制备的超滤液，用截留分子量为100的纳滤膜分离系统进行纳滤，弃去透过液，当回流液至原体积的1/4，结束纳滤；将纳滤液用0.22um滤膜滤过，制得到脑蛋白水解物。对照实施例3取实施例1制备的超滤液，在真空度-0.08mpa±0.005mpa，温度60℃至75℃之间，真空浓缩液至原体积的1/4，浓缩液用0.22um滤膜滤过，制得到脑蛋白水解物。制备方法考察1实验药物样品1-3：分别为实施例4-6制备的脑蛋白水解物，所用超滤液为实施例1制备的超滤液；样品4-6：分别为对照实施例1-3制备的脑蛋白水解物。2实验内容及方法2.1理化成分测定2.1.1总氮含量2.1.1.1检测方法仪器与用具刻度吸管(0.5ml、2ml、3ml)、kdy-9810凯氏定氮仪、kxl-1010型控温消煮炉、酸式滴定管(25ml)、电子天平(al204-ic或bs224s)试液与试药硫酸钾(分析纯)、硫酸(分析纯)、硫酸铜(分析纯)、硫酸滴定液(0.1mol/l)30％硫酸铜溶液：称取硫酸铜30g，置100ml量瓶中，加水溶解稀释成100ml，摇匀即得。检验方法与结果判定总氮量取本品0.3ml，照脑蛋白水解物中氮测定标准操作程序测定，同时平行测定2份，并用空白试验校正。计算：式中v1为供试品消耗硫酸滴定液(0.005mol/l)的体积(ml)v0为空白消耗硫酸滴定液(0.005mol/l)的体积(ml)f为硫酸滴定液(0.005mol/l)的校正因子t为供试品相当于硫酸滴定液(0.005mol/l)的滴定度c为供试品的总氮量(mg/ml)2.1.1.2样品检测分别取样品1-6，依上法检测总氮含量。2.1.2总氨基酸含量2.1.2.1检测方法仪器与工具高效液相色谱仪(lc-10atvp、lc-15c)、dh-101型电热恒温鼓风干燥箱电子天平(bp211d)、量瓶(50ml)、量筒(1000ml)、烧杯、衍生管25μl玻璃微量进样器、旋涡混合器、微量移液枪、干燥吸头试药、试液、溶液氨基酸标样对照品、accq·tag流动相a浓液(密封置于4℃冰箱中保存)、accq·fluortmrcagengkit{衍生用试剂：accq·flour试剂粉末(2a)、accq·flour稀释剂(2b)、accq·flour硼酸盐缓冲液(bufferl)}、当日制备的高纯水、乙腈(色谱级)、衍生用氨基酸标样的配制：打开1瓶17种氨基酸标样，置10ml容量瓶中，用高纯水稀释至刻度，混匀，备用。衍生剂2a的配制：在打开2a瓶之前，轻轻弹击，确保所有的accq·flour试剂粉末全落在瓶底；用1ml微量移液管由2b瓶中吸取1mlaccq·flour稀释剂并放掉，以清洗微量移液管头；吸取1mlaccq·flour 稀释剂放入装有accq·flour衍生剂粉末的2a瓶中，加盖密封；震荡直至溶解。检验方法与结果判定色谱条件设置参数色谱柱：watersaccq·tagc-18150mm×3.9mm柱温：37℃，检测波长：248nm流速：1.0ml/min进样量：10μl流动相：a液：按1：10(v/v)将accq·taga浓液(wat052890)用水稀释，过滤，将其倒入洁净的溶剂瓶中，放到超声波清洗器中超声脱气1分钟，备用。(密封置于4℃冰箱中保存)b液：分别取乙腈和水60：40(v/v)倒入烧杯中，搅拌混合均匀，过滤，将其倒入洁净的溶剂瓶中，放到超声波清洗器中超声脱气1分钟，备用。(现用现配)设置梯度表和单次运行时间，如表1：表1洗脱程序色谱系统预平衡分别用a、b流动相充满泵头管路(即进行泵排气操作)之后，先用 b液以1ml/min流速冲洗系统15min，然后用a液平衡系统60min，按上述accq·tag色谱条件设置参数，做一次空白梯度平衡。氨基酸标样的衍生用清洁的移液枪移取10ul已稀释的标样注入清洁的衍生管底部，换一个清洁的微量移液管头，加70ulaccq·flour硼酸盐缓冲液(bufferl)到衍生管中，涡旋混合；另换一清洁的微量移液管头吸取20ul已配好的accq·flour衍生剂(2a)，在涡旋状态下加到衍生管中，并保持涡旋混合10秒，在室温下放置1分钟；将衍生管用封口膜封好口，放在55℃烘箱中加热10分钟；加热后，取出，即可用于进样。供试品溶液的衍生精密量取本品1ml，置25ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，做为供试品溶液。供试品溶液的衍生方法与氨基酸标样的衍生方法相同。按外标法以峰面积计算氨基酸的含量。式中c为供试品中氨基酸的百分含量分子量为各种氨基酸的分子量a供为各种氨基酸的峰面积a对为相对应的氨基酸的峰面积n供试品的稀释倍数(ml)2.1.2.2样品检测分别取样品1-6，依上法检测样品中氨基酸含量。2.2安全性评价注射用脑蛋白水解物在临床应用过程中，极少数病例会出现不良反应，其中常见的为过敏性反应，症状为寒战、发热、血压迅速下降等，严重者可致休克。在本品的法定标准中仅收载了异常毒性进行安全性评价，没有列入与过敏性相关的评价。本发明过程参照中国药典2010版第二部附录xig降压物质检查法，通过比较组胺对照品(s)与供试品(t)引起麻醉猫血压下降的程度，判定供试品中所含降压物质的限度是否符 合规定，对不同工艺制备的样品的降压物质实验结果进行了对比，确认本发明工艺的先进性。2.2.1试验方法对照品溶液的制备精密称取磷酸组胺对照品适量，按组胺计算，加水溶解使成每1ml含1.0mg的溶液，分装于适宜的容器内，4-8℃贮存。对照品稀释液的制备精密量取磷酸组胺标准品贮备液0.1ml，置于200ml容量瓶中，加生理盐水至刻度，摇匀，即为0.5μg/ml。供试品溶液的制备将样品1-5分别用0.22um滤膜过滤，在无菌条件下分装在经过灭菌的容器中，密封，4-8℃保存。检查法取健康合格、体重2kg以上的猫，雌者应无孕，用适量的麻醉剂(戊巴比妥钠40mg/2ml/kg)麻醉后，固定于保温手术台上，分离气管。必要时插入插管以使呼吸畅通，或可进行人工呼吸。在一侧颈动脉插入连接测压计的动脉插管，管内充满适宜的抗凝剂溶液，以记录血压，也可用其他适当仪器记录血压。在一侧股静脉内插入静脉插管，供注射药液，用给药剂量：按样品总氮含量计算，给药量为10mg/kg。试验中注意保持动物体温。全部手术完毕后，将测压计调节到与动物血压相当的高度，开启动脉夹，待血压稳定后，方可进行药物注射。3实验结果3.1理化成分测定结果结果见表2。表2理化成分含量样品总氮(mg/ml)总氨基酸(mg/ml)19.3314.6129.2014.2638.9213.5245.327.4059.6015.10610.1015.89上述实验结果表明，采用减压浓缩工艺处理后的脑蛋白水解物(即样品5)，总氮和氨基酸的含量最高；而采用纳滤工艺处理的脑蛋白水解物中总氮和氨基酸的含量均低于样品5，二者含量随着使用纳滤膜可透过的分子量范围的增加而降低。3.2安全性评价结果结果见表3。表3安全性评价结果上述实验结果表明，样品4和样品5给药后，对受试猫血压降压幅度均大于对照品给药后引起的血压下降值，实验结果不符合规定。表明这两种样品的制备工艺不能够将降压物质去除至可接受的水平，产品的安全性差。样品1-4给药后，对受试猫血压降压幅度均小于对照品给药后引起的血压下降值得0.5倍，实验结果符合规定，表明采用150～400道尔顿纳滤技术进行分离后的产品中，可引起降压物质的含量显著下降，产品的安全性较高。综合上述实验结果，样品5和样品6中总氮和氨基酸的含量虽然较高，但由于其降压实验不符合要求，产品中对应的无效成分和有害成分也较高，不符合对产品安全性的要求。样品1-4的降压试验符合要求，表明对应的工艺能够有效的去除产品中的有害成分，安全性符合要求。样品4中总氮和氨基酸的含量仅为样品6的52.7％和46.6％，样品1、样品2和样品3中总氮含量分别为样品6的92.3、90％和85％，氨基酸含量分别为样品6的91.9％、89.7％和85.1％。表明采用400道尔顿纳滤膜系统处理后的溶液，约有近50％的有效成分的损失，在配制注射用脑蛋 白水解物时，需要添加的氨基酸也较多。兼顾安全性和经济性，样品1、2和3的工艺更为合理，即选择150-300道尔顿纳滤技术效果最佳。当前第1页12