本发明涉及生物化学和医药领域，具体地，涉及蛋白功能抑制剂dapt在制备治疗肿瘤的药物中的用途。
背景技术：
：垂体腺瘤治疗方式主要包括药物治疗、手术治疗、放射性治疗，目前的治疗主要以手术为主，相当一部分患者手术效果不佳，术后常出现残留及复发，是目前神经外科难以突破的一个问题。药物治疗是解决这一难题的有效途径。生长抑素类似物和多巴胺受体激动剂被用于控制一部分高分泌gh型和prl型腺瘤患者，sstr2表达水平的高低与药物敏感性呈正相关。但是临床上仍存在大量手术切除残留、术后复发、对药物耐药的病人，治疗方法不当和过度治疗并存，使其治疗效率低，致残率高，总体复发率超过30％。目前仍缺乏针对性的、有效的药物治疗手段。因此有必要开发能够影响垂体腺瘤分化、增殖、凋亡和侵袭过程的方法和药品，从而为提高垂体腺瘤的治疗及预后效果提供有效途径。技术实现要素：本发明的第一个目的是提供蛋白功能抑制剂dapt在制备治疗垂体腺瘤的药物中的用途。本发明的第二个目的是提供蛋白功能抑制剂dapt的功能片段、衍生物及其盐或溶剂化物在制备治疗垂体腺瘤的药物中的用途。其中，dapt是指cas登录号208255-80-5的化合物，中文名：(3,5-二氟苯乙酰基)-l-丙氨酰基-l-2-苯基甘氨酸叔丁酯；分子式：c23h26f2n2o4； 是一种γ-分泌酶(γ-secretase)抑制剂，能够间接抑制γ-分泌酶底物notch的活性，进而影响细胞信号传导和细胞分化过程。其中，所述dapt的衍生物为dapt的卤代、磺化、硝化、羟化、烷氧化或酯化产物。dapt衍生物可成盐或溶剂化物，其中所述的盐包括钠盐、钾盐等，所述的溶剂化物是指水合物、乙醇化物等。所述衍生物可以用于至少部分的抑制垂体腺瘤的分化、增殖和侵袭。本领域技术人员可以预见，dapt的衍生物和功能化片段具备与dapt相同的核心结构。因此，其功能片段、衍生物及其盐或溶剂化物在制备治疗或预防垂体腺瘤的药物中同样具备理想的应用效果。本发明所述的垂体腺瘤涵盖了已知多种垂体腺瘤，包括功能性垂体腺瘤和/或非功能性垂体腺瘤，其中，所述功能性垂体腺瘤包括gh型垂体腺瘤、prl型垂体腺瘤、acth型垂体腺瘤和tsh型垂体腺瘤中的至少一种；所述非功能性垂体腺瘤包括空细胞腺瘤、大嗜酸粒细胞瘤、促性腺激素腺瘤、静止的促皮质激素腺瘤和糖蛋白分泌腺瘤中的至少一种。除活性成分外，本发明所述的药物还包括药学上可接受的至少一种赋形剂。所述的赋形剂为本领域技术人员所理解，包括但并不局限于崩解剂、润滑剂、分散剂等，本领域技术人员可依据制剂的实际需求加以选择，本发明对此不作特别限定。本发明所述的药物，可经由常规方法制备成药学上各种常见剂型，如片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、混悬剂、口服溶液、粉针或注射剂等。给药方式可选口服、舌下、静脉、皮下、透皮或局部给药等，以单位给药形式给予动物或人。本发明所述的药物合适的单位给药形式包括口服剂型(例如片剂、胶囊、丸剂、散剂、颗粒剂、口服溶液或悬浮液)、舌下或口含给药剂型、静 脉，皮下，透皮或肌内给药剂型(例如注射液、粉针等)。此外，所述药物可以是普通制剂、缓释制剂、速释制剂及控释制剂。优选的，本发明所述的药物为口服剂型、静脉给药剂型或肌内给药剂型。本发明同时为含有dapt、dapt的功能片段、dapt衍生物及其盐或溶剂化物的药物制剂提供理想的实施方式，具体而言，当制备片剂或胶囊形式的固体药物组合物时，在活性成分中可加入的赋形剂，包括稀释剂，如乳糖、糊精、淀粉、预胶化淀粉、蔗糖、甘露醇、微晶纤维素等；黏合剂，如聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、羟丙甲纤维素等；崩解剂，如羧甲基淀粉钠、交联羧基甲基纤维素、低取代羟丙纤维素、羧甲基纤维素钠、交联聚乙烯吡咯烷酮等；润滑剂，如二氧化硅、硬脂酸镁、硬脂酸盐、玉米淀粉、滑石粉等，矫味剂，如甘露醇、阿斯巴甜、糖精钠和甜菊苷等，此外，还可加入表面活性剂，如十二烷基磺酸钠、磺基丁二酸二辛酯钠、蔗糖酯和泊洛沙姆等。当制备丸剂形式的药物组合物时，在活性成分中可加入的赋形剂，包括稀释剂与吸收剂，如乳糖、葡萄糖、糊精、淀粉、蔗糖、可可脂等；黏合剂，如阿拉伯胶、黄芪胶、明胶、蜂蜜等；崩解剂，如甲基纤维素、乙基纤维素、干燥淀粉、琼脂粉、海藻酸盐等。口服溶液或悬浮液可加入的赋形，包括甜味剂，如糖精钠、蔗糖、甜蜜素、阿斯巴甜和甜菊苷等；助悬剂，如聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、羟丙基甲基纤维素等；防腐剂，如尼泊金类、苯甲酸钠、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯等。颗粒剂可加入的赋形剂，包括填充剂、黏合剂、着色剂及矫味剂等。注射用制剂，如注射液、乳剂、冻干粉针剂等，可以使用本领域常用的各种稀释剂，如水、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、氧化异硬脂醇等，助溶剂，缓冲剂或ph调节剂等。另外，为了制备等渗注射液，可加入氯化钠、葡萄糖或甘油等。本发明所述的片剂可以是纯片剂，还可将片 剂进一步制成包衣片，例如薄膜衣、糖衣等。通过制备聚合物基质或在膜包衣中使用特定的聚合物，可将片剂制成速释、缓释或控释剂型。胶囊剂可以是软胶囊或硬胶囊，不带膜或带膜，以便具有速释、缓释或控释性能。在本发明的药物组合物中，dapt通常以剂量单位配制。每剂量单位含有5至10毫克dapt，每日给予1次或多次。特定情况下也可以采用较高或较低剂量，每个患者的适用剂量由医生根据给药模式，该患者的年龄、体重和反应来最终决定。所述药物可以与已经可用的治疗手段(例如化学治疗、外科手术治疗或放疗)联用。除了在所概述的任意方法中使用药物以外，本发明的药物可用作其他疗法的添加剂。应该清楚本发明的治疗可以与任何其他已知的治疗方法联用。通过上述技术方案，dapt能明显抑制垂体腺瘤细胞和移植瘤的生长。在原代生长激素腺瘤肿瘤细胞和gh3细胞中应用不同剂量的dapt，能够明显抑制原代垂体腺瘤细胞和gh3细胞的增殖。特别是在5-20ng/ml的处理剂量下，能够获得最佳的抑制增殖效果。transwell实验也显示dapt在2-20ng/ml剂量下能够抑制肿瘤细胞的侵袭能力。本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。具体实施方式以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。以下实施例中dapt为geneoperation(us)的商品化产品，货号为in01001-0005mg。实施例11.1标本来源标本取自垂体腺瘤患者手术切除的肿瘤组织。术前根据临床表现，血清激素水平和影像学检查做出初步诊断，再根据术中所见及术后病理学和免疫组织化学染色确诊，为具有侵袭力的gh型垂体腺瘤、tsh型腺瘤、prl型腺瘤、无功能腺瘤各10例。1.2主要试剂胰酶，dmem培养基，胎牛血清，二甲基亚砜，多聚赖氨酸均为市售产品。1.3细胞培养手术切除的垂体腺瘤组织在无菌操作下放入无血清dmem培养液中，超净台内无菌pbs冲洗2-3次，去除结缔组织，坏死组织及血块，将标本用眼科剪剪碎成1mm3大小组织坏，加胰蛋白酶吹打分散，待细胞分散良好以后，加入dmem培养液(内含10％胎牛血清)终止消化，经100目细胞滤器过滤后，1000r/min离心10min，弃上清液，加入dmem培养液使细胞重悬分散，镜检计数，调整细胞密度为1×106/ml。用台盼蓝染色计数细胞活性。接种于预先包被了多聚赖氨酸的培养瓶中培养。待原代垂体腺瘤细胞达到80％-90％融合时，用胰蛋白酶消化收集细胞，用dmem培养液重悬传代。1.4观测指标：1.4.1形态学及细胞增殖速度观察设置6个不同剂量的处理组，在dmem培养液中分别添加终浓度0.5、1、5、10、20和100ng/ml的dapt，对照组添加等体积的dmso，进行细胞培养。倒置相差显微镜下每天观察一次培养细胞的形态特点，记录不同处理组下垂体腺瘤细胞贴壁的时间及长满单层的时间，结果如表1所示。表11.4.2流式细胞仪检测细胞凋亡设置6个不同剂量的处理组，在dmem培养液中分别添加终浓度为0.5、1、5、10、20和100ng/ml的dapt，对照组添加等体积的dmso，进行细胞培养。取培养时间同为3周的原代垂体腺瘤细胞传代培养3d后将其收获，并制成单细胞悬液，经1000r/m(r＝15cm)离心5min，弃上清，细胞直接悬浮于pi低渗液中，fcm对细胞dna进行分析，pi-dna复合物发出的荧光经fcm计量分析，细胞凋亡用小于2倍体峰的细胞百分数表示。结果如表2所示。表21.4.3mts法检测细胞增殖设置6个不同剂量的处理组，在dmem培养液中分别添加终浓度为0.5、1、5、10、20和100ng/ml的dapt，对照组添加等体积的dmso，培养原代垂体腺瘤细胞和gh3细胞到对数生长期，取96孔细胞培养板，每孔加dmem培养液(加10％小牛血清)在37℃5％co2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养24小时。每孔加20μlmts/pms混合液，继续培养3-4小时显色。检测前摇晃培养板10秒钟，混匀颜色在酶联检测仪上，波长570nm处检测各孔的光吸收值(od)。用样品稀释度对od值(od570)绘制曲线。统计细胞增殖情况如表3所示。表31.4.4肿瘤细胞侵袭能力检测按照chemicon公司的ecm550系列说明书要求，将小室放入培养板中，在上室加入300μl预温的无血清培养基，室温下静置15-30min，使基质胶再水化。再吸去剩余培养液。制备细胞悬液：制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12-24h，进一步去除血清的影响。消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用pbs洗1－2遍，用含bsa的无血清培养基重悬。加入不同剂量的dapt并调整细胞密度至1-10×105。接种细胞：取细胞悬液200μl加入transwell小室；24孔板下室加入500μl含fbs或趋化因子的培养基。培养细胞：常规培养24h。mtt法进行结果计数：用棉签擦去基质胶和上室内的细胞；24孔板中 加入500μl含0.5mg/mlmtt的完全培养基，将小室置于其中，使膜浸没在培养基中，37℃4h后取出。24孔板中加入500μldmso，将小室置于其中，使膜浸没在dmso中，振荡10min，充分溶解。取出小室，24孔板于酶标仪上测od值(od570)，处理数据结果如表4所示。表4处理组(ng/ml)0.51510201000原代垂体腺瘤细胞0.3790.3340.2960.2230.1780.1420.457gh3细胞0.3910.3450.2770.2070.1650.1340.672以上结果表明在原代生长激素腺瘤肿瘤细胞和gh3细胞中应用不同剂量的dapt，能够明显抑制原代肿瘤细胞和gh3细胞的增殖。特别是在5-20ng/ml的处理剂量下，能够获得最佳的抑制增殖效果。transwell实验显示dapt能够抑制肿瘤细胞的侵袭能力。1.4.5裸鼠移植瘤实验spf级balb/c-nu小鼠(品种)，雌性，5-7周龄，体重(18±2)g(购北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物许可证号：scxk(京)2012-0001)经前肢腋下皮下接种鼠源垂体生长激素腺瘤gh3细胞(购自中国医学科学院基础研究所细胞中心)，待瘤长至约120mm3从中筛选出体重及瘤体均匀的荷瘤鼠30只，备用。将荷瘤鼠30只随机均匀分为3组，每组10只，每组分别经尾静脉施用不同剂量dapt，每日分1次给药，每次给药剂量分别为1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg。给药15天后处死动物，剥取瘤组织计算抑瘤率tvi，结果如表5所示。tvi％＝(空白组当天肿瘤体积-给药组当天肿瘤体积)/(空白组当天肿瘤体积)×100％。表5每次给药剂量(mg/kg)给药15天后抑瘤率(％)110.71528.971049.81以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。当前第1页12