本发明涉及一种益生菌制剂，尤其涉及一种改善上呼吸道微生态平衡的益生菌制剂及其制备方法，属于生物技术领域。
背景技术：
健康人体的下呼吸道尤其是细小支气管以下部分，肺内和胸腔是完全无菌的，鼻咽部作为呼吸道的起始部分，是连接下呼吸道与外界的通道，任何致病菌进入人体首先需要在鼻咽部定植然后才能进一步引起机体相应的病理反应。鼻咽在婴儿出生时是无菌的，通过空气环境及周围人群的密切接触，在出生后12小时左右就在鼻咽及喉部出现一般的需氧菌如甲型链球菌，白色葡萄球菌，在第四天则有76%的婴儿带金黄色葡萄球菌，以后逐渐在鼻咽部定居的细菌有奈瑟氏菌属，大肠杆菌，嗜血杆菌等。健康人体的鼻咽部正常定植菌包括了：甲型链球菌，奈瑟氏菌属，嗜血杆菌，葡萄球菌，棒状杆菌和某些厌氧菌。而在这一部分定植的正常菌群中甲型链球菌占主导地位，比其它菌种有更强的抵抗力。
在我国空气环境条件日趋恶化的今天，上呼吸道感染尤其是儿童由于免疫力低下导致的上呼吸道感染发病率逐年升高。研究表明，急慢性上呼吸道感染疾病的发生多与上呼吸道微生物群落失调密切相关，除分离到治病菌之外，正常定植的微生物群落也发生显著变化，甲型链球菌比例极度低下，冗余种群（放线菌属，厌氧菌，藤黄球菌）数量显著增多。因此，从2006年即有临床专家提出维持上呼吸道微生态平衡对于预防急慢性上呼吸道感染有重要作用。
微生态制剂就是利用正常菌群成员联合制成的活的微生物制剂，它可以补充生境中缺乏的正常菌群，起到维持或调整微生态平衡的作用。目前应用于肠道微生态平衡微生物制剂较为成熟，美国在2003年也有类似的肠道生态平衡的微生物制剂出现，用于治疗因胃肠道异常微生物区系或微生物区系的异常分布引起的慢性肠道疾病。Vo rob’ ev等人根据肠道内菌群失调时可导致严重的腹泻，而双歧杆菌可以纠正菌群失调的原理，提出在药物中加入前生命期的双歧杆菌，用来治疗成人和儿童因菌群失调而出现的疾病。
《中国微生态学杂志》, 2000, 12(4):206-207出版的呼吸道感染与甲型链球菌的相关性研究，肖纯凌，李舒音，韩秀珍，张月茹；该研究表明呼吸道感染病者的甲型链球菌检出率明显低于健康人士，说明呼吸道感染与呼吸道感染与甲型链球菌含量密切相关。但到目前为止，尚无甲型链球菌以及其他益生菌在调整上呼吸道微生态平衡方面的进一步详细的介绍。
技术实现要素：
本发明的目的之一是提出一种改善上呼吸道微生态平衡的益生菌制剂，通过甲型链球菌、四叠球菌、双歧杆菌菌粉以及其他益生菌制成益生菌制剂，具有维持人体上呼吸道微生态平衡，预防上呼吸道感染性疾病的作用。
为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
一种改善上呼吸道微生态平衡的益生菌制剂，其特征在于：包括甲型链球菌菌粉、四叠球菌菌粉、双歧杆菌菌粉和嗜酸乳杆菌菌粉，所述甲型链球菌菌粉占益生菌制剂的重量百分比为30～60%；所述益生菌制剂中活菌数为 1010～1015。
本发明的益生菌制剂可通过上述益生菌混合发酵制得，也可以分别单独发酵后再混合制得，也可先单独发酵甲型链球菌菌粉制得菌粉后，再将其他益生菌混合发酵制成混合菌种，最后将多次发酵得到的菌粉进行混合。
为了更好地实现本发明，所述双歧杆菌菌粉为婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌和短双歧杆菌中至少一种。
本发明的另一个目的是提供益生菌制剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
A. 甲型链球菌菌粉制备
在液体培养基中加入乳清蛋白、低聚果糖后，121℃下高压灭菌20min，冷却至37℃后，接种甲型链球菌，于 37℃下连续培养至含菌量达到105～109/ml后，用低温高速离心机进行离心，得到湿菌体；
将所述湿菌体悬于pH为4.8～7.2，质量浓度为20%的脱脂奶粉液中，混合均匀后冷冻干燥即得到甲型链球菌菌粉；
B. 混合菌粉的制备
在液体培养基中加入乳清蛋白、低聚果糖后，121℃下高压灭菌30min，冷却至37℃后，接种四叠球菌菌粉、双歧杆菌菌粉和嗜酸乳杆菌，于 37℃下连续培养至含菌量达到105～109/ml后，用低温高速离心机进行离心，得到湿菌体；
将所述湿菌体悬于pH为4.8～7.2，质量浓度为20%的脱脂奶粉液中，混合均匀后冷冻干燥即得到混合菌粉；
C.益生菌喷雾剂制备
将步骤A得到的甲型链球菌菌粉和步骤B得到的混合菌粉按3:1的重量比进行混合，然后加入重量百分比为1～5%的壳聚糖，0.5～1.5%的木糖醇，混匀后包装即得到所述益生菌制剂。
上述制备方法中，所述液体培养基为TSB培养基。
步骤A中，所述连续培养的时间为20～48h。
步骤A中，所述乳清蛋白的添加量为发酵体积的1～6%，低聚果糖的添加量为发酵体积的1～5%。
步骤A中，所述甲型链球菌菌粉中活菌数为5×109/g。
步骤B中，所述连续培养的时间为18～36h。
步骤B中，所述四叠球菌菌粉、双歧杆菌菌粉和嗜酸乳杆菌的接种比例为1:1:1。
步骤B中，所述乳清蛋白的添加量为发酵体积的1～5%，低聚果糖的添加量为发酵体积的1～5%。
步骤B中，所述混合菌粉中活菌数为5×1010/g。
本发明的有益效果:
（1）本发明通过添加人体呼吸道正常寄生的益生菌：甲型链球菌和四叠球菌，起到维持呼吸道的微生态平衡的作用；益生菌制剂中还添加了双歧杆菌菌粉，可维持甲型链球菌和四叠球菌初始含量状态，使其含量保持相对平衡的状态，以保证益生菌制剂预防呼吸道疾病的作用达到最佳；另外，益生菌制剂中添加有嗜酸乳杆菌菌粉，该益生菌除了调节胃、肠微生态平衡，还可与双歧杆菌在肠道内发酵后，产生乳酸和醋酸，可提高钙、磷、铁的利用率，促进铁和维生素D的吸收，产生维生素K及维生素B，起到促进人整个机体健康的作用。
（2）本发明的双歧杆菌菌粉为婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌和短双歧杆菌中的一种，以稳定微生物种群，调节宿主环境和微生物群落的稳定。
（3）本发明通过菌粉制备后，将多种益生菌菌粉混合制成喷雾剂，将制剂中的益生菌群直接补充到人体咽部，不仅有利于呼吸道微生物菌群稳定，能够有效预防上呼吸道感染，避免上呼吸道疾病的发生，而且在益生菌粉随唾液吞咽进入胃肠道后，仍然能够发挥益生菌作用，调节胃肠道菌群平衡，增强人体对外来致病菌的抵抗力，喷剂使用起来也方便、快捷，尤其适合儿童和其他吞咽能力不足的人群使用。
具体实施方式
实施例1
一种改善上呼吸道微生态平衡的益生菌制剂，由甲型链球菌菌粉、四叠球菌菌粉、婴儿双歧杆菌和嗜酸乳杆菌组成，所述甲型链球菌菌粉占益生菌制剂的重量百分比为30%；所述益生菌制剂中活菌数为 1010。
实施例2
一种改善上呼吸道微生态平衡的益生菌制剂，由甲型链球菌菌粉、四叠球菌菌粉、长双歧杆菌、婴儿双歧杆菌和嗜酸乳杆菌组成，所述甲型链球菌菌粉占益生菌制剂的重量百分比为60%；所述益生菌制剂中活菌数为 1015。
实施例3
一种改善上呼吸道微生态平衡的益生菌制剂，由甲型链球菌菌粉、四叠球菌菌粉、短双歧杆菌和嗜酸乳杆菌组成，所述甲型链球菌菌粉占益生菌制剂的重量百分比为50%；所述益生菌制剂中活菌数为 1012。
本实施例中的益生菌制剂的制备方法如下：
A. 甲型链球菌菌粉制备
在液体培养基中加入乳清蛋白、低聚果糖后，121℃下高压灭菌20min，冷却至37℃后，接种甲型链球菌，于 37℃下连续培养至含菌量达到1×105/ml后，用低温高速离心机进行离心，得到湿菌体；
将所述湿菌体悬于pH为4.8，质量浓度为20%的脱脂奶粉液中，混合均匀后冷冻干燥即得到甲型链球菌菌粉；
B. 混合菌粉的制备
在液体培养基中加入乳清蛋白、低聚果糖后，121℃下高压灭菌30min，冷却至37℃后，接种四叠球菌菌粉、双歧杆菌菌粉和嗜酸乳杆菌，于 37℃下连续培养至含菌量达到1×105/ml后，用低温高速离心机进行离心，得到湿菌体；
将所述湿菌体悬于pH为4.8，质量浓度为20%的脱脂奶粉液中，混合均匀后冷冻干燥即得到混合菌粉；
C.益生菌喷雾剂制备
将步骤A得到的甲型链球菌菌粉和步骤B得到的混合菌粉按3:1的重量比进行混合，然后加入重量百分比为1%的壳聚糖，0.5%的木糖醇，混匀后包装即得到所述益生菌制剂。
实施例4
一种改善上呼吸道微生态平衡的益生菌制剂，由甲型链球菌菌粉、四叠球菌菌粉、短双歧杆菌和嗜酸乳杆菌组成，所述甲型链球菌菌粉占益生菌制剂的重量百分比为55%；所述益生菌制剂中活菌数为 6*1010。
本实施例的益生菌制剂制备方法同实施例3。
本实施例的制备方法中，液体培养基为TSB培养基。
实施例5
一种改善上呼吸道微生态平衡的益生菌制剂，由甲型链球菌菌粉、四叠球菌菌粉、短双歧杆菌和嗜酸乳杆菌组成，所述甲型链球菌菌粉占益生菌制剂的重量百分比为55%；所述益生菌制剂中活菌数为 6*1010。
制备方法如下：
A. 甲型链球菌菌粉制备
在液体培养基中加入乳清蛋白、低聚果糖后，121℃下高压灭菌20min，冷却至37℃后，接种甲型链球菌，于 37℃下连续培养至含菌量达到1×109/ml后，用低温高速离心机进行离心，得到湿菌体；
将所述湿菌体悬于pH为7.2，质量浓度为20%的脱脂奶粉液中，混合均匀后冷冻干燥即得到甲型链球菌菌粉；
B. 混合菌粉的制备
在液体培养基中加入乳清蛋白、低聚果糖后，121℃下高压灭菌30min，冷却至37℃后，接种四叠球菌菌粉、双歧杆菌菌粉和嗜酸乳杆菌，于 37℃下连续培养至含菌量达到1×109/ml后，用低温高速离心机进行离心，得到湿菌体；
将所述湿菌体悬于pH为6.5，质量浓度为20%的脱脂奶粉液中，混合均匀后冷冻干燥即得到混合菌粉；
C.益生菌喷雾剂制备
将步骤A得到的甲型链球菌菌粉和步骤B得到的混合菌粉按3:1的重量比进行混合，然后加入重量百分比为5%的壳聚糖，1.5%的木糖醇，混匀后包装即得到所述益生菌制剂。
进一步地，本实施例的制备方法中，液体培养基为TSB培养基。
步骤A中，所述连续培养的时间为20h。
步骤A中和步骤B中，所述乳清蛋白的添加量为发酵体积的1%，低聚果糖的添加量为发酵体积的1%。
步骤A中，所述甲型链球菌菌粉中活菌数为5×1010/g。
实施例6
一种改善上呼吸道微生态平衡的益生菌制剂，由甲型链球菌菌粉、四叠球菌菌粉、短双歧杆菌和嗜酸乳杆菌组成，所述甲型链球菌菌粉占益生菌制剂的重量百分比为45%；所述益生菌制剂中活菌数为 1011。
本实施例的益生菌制剂的制备方法与实施例5的区别在于：
步骤A中，所述连续培养的时间为48h。
步骤A中，所述乳清蛋白的添加量为发酵体积的6%，低聚果糖的添加量为发酵体积的5%。
步骤B中，脱脂奶粉液的pH值为7.2。
步骤B中，所述四叠球菌菌粉、双歧杆菌菌粉和嗜酸乳杆菌的接种比例为1:1:1。
步骤B中，所述连续培养的时间为18h。
步骤B中，所述乳清蛋白的添加量为发酵体积的5%，低聚果糖的添加量为发酵体积的5%。
实施例7
本实施例与实施例6的区别在于，步骤A中，所述连续培养的时间为36h；步骤A中，所述乳清蛋白的添加量为发酵体积的2%，低聚果糖的添加量为发酵体积的3%；步骤B中，所述连续培养的时间为36h；所述乳清蛋白的添加量为发酵体积的2.5%，低聚果糖的添加量为发酵体积的4%；步骤B得到的混合菌粉中活菌数为5×1010/g。